阅读说明：本技术 两步pcr技术 (Two-step PCR technique ) 是由 苗鑫垚 沈悦生 龚晓娟 赵梓丞 李梦瑶 贺小兰 于 2021-01-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种两步PCR技术,包括如下步骤：第一步,扩增特异性靶点：在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液,使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧,这一部分反应也被称为第一步PCR；第二步,富集靶点：在富集靶点也就是第二步PCR部分,我们在第一步连接的通用序列后连接了接头。连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化,混合到单个试管中并进行纯化。本发明通过更简单的操作步骤造就了其高于市场上通过文库构建测序方法的数据利用率。(The invention discloses a two-step PCR technology, which comprises the following steps: first, amplification of specific targets: mixing the DNA sample and the specific primer pair mixture solution in the part to ensure that the universal sequences of the forward primers and the reverse primers are respectively connected to two sides of the specific amplicon determined by the specific primers, wherein the part of the reaction is also called as first-step PCR; step two, enriching target spots: in the enrichment target, i.e., the second PCR portion, we ligated the linker after the universal sequence ligated in the first step. The ligated adaptors were amplified and purified by a second step of PCR, mixed into a single tube and purified. The invention has the advantage that the data utilization rate is higher than that of a library construction sequencing method in the market through simpler operation steps.)

两步PCR技术

技术领域

本发明涉及生物领域，具体是一种两步PCR技术。

背景技术

聚合酶链式反应简称PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增, 具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

DNA探针(DNA probe)是最常用的核酸探针，为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，用特殊示踪剂(如同位素、酶或有；色基团)进行标记；在适当的p时值、温度和离子强度下，DNA探针利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。杂交捕获技术其原理是根据DNA序列互补原理，设计与目标序列互补的特异性探针，并合成在固相或液相芯片上，打断样品基因组DNA，加上测序接头后与探针杂交，最终将目标区域捕获下来，后续经过回收、构建文库并直接高通量测序。固相杂交法，即将探针固定在固体支持物上，典型代表是基因芯片。杂交后先洗脱未杂交上的DNA片段，再将与探针杂交的DNA洗脱下来，进行扩增，构建高通量测序文库。而液相杂交捕获技术，不难理解是在溶液环境中，让目标DNA与带有生物素标记的探针直接杂交，再通过生物素 -亲和素的反应使目标片段锚定在带有亲和素的微珠上，后面过程也是洗脱、富集、扩增、构建测序文库等，目前液相杂交系统逐渐成为基因捕获主流。

但上述的目的片段捕获方法都需要进行建库步骤才能上机测序，文库构建往往是测序前最重要也是耗时最长的一步它的成功与否直接关系到测序的成功。构建文库的目的是在目的片段两端连接上想要的接头，文库结构需要符合不同种类测序仪的上机要求才能进行测序。

因此，本发明提供了一种两步PCR技术，以解决上述背景技术中提出的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种两步PCR技术，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种两步PCR技术，包括如下步骤：

1.包括如下步骤：

第一步，扩增特异性靶点：在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液，使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧，这一部分反应也被称为第一步PCR。

第二步，富集靶点：在富集靶点也就是第二步PCR部分，我们在第一步连接的通用序列后连接了接头。

第三步，混合文库：本部分使用荧光定量方法量化富集产物，记录样本信息和浓度信息。

第四步，稀释文库：使用荧光定量方法量化混合文库产物并将其稀释至10ng/μL，按照不同测序平台的上机流程进行测序前准备。

作为本发明再进一步的方案：在扩增特异性靶点时DNA投入量为1-10ng。

作为本发明再进一步的方案：在富集靶点时连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化，混合到单个试管中并进行纯化。

作为本发明再进一步的方案：在混合文库时将定量后的样本按照等比进行混合

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明操作简便，耗时短，适用于一些对时效性有特殊要求的情况：本发明通过引物融合技术使目的片段扩增和测序接头的添加在两步PCR中就得以完成，从而使操作步骤得以简化，耗费时间得以减少，从而得以适应对时效性要求比较高的情况。

2、本发明通过更简单的操作步骤造就了其高于市场上通过文库构建测序方法的数据利用率。

3、本发明成本低，适用于多种测序平台：本发明依托二代测序平台，且对各种测序平台具有普适性，这就赋予了其成本高适应性广泛等优势。

4、本发明的需求DNA量比较低，在低至78pg时也能实现精准分型，传统建库需要50-100ng。

附图说明

图1为一种两步PCR技术的技术路线图。

图2为一种两步PCR技术中原理示意图。

图3一种两步PCR技术中不同方法下的数据利用率占比图示。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明实施例中，一种两步PCR技术，包括如下步骤：

第一步，扩增特异性靶点：在此部分混合DNA样品和特异性引物对混合液，使正反向引物的通用序列分别连接到由特异性引物所确定的特异性扩增子的两侧，这一部分反应也被称为第一步PCR。

第二步，富集靶点：在富集靶点也就是第二步PCR部分，我们在第一步连接的通用序列后连接了接头。

第三步，混合文库：本部分使用荧光定量方法量化富集产物，记录样本信息和浓度信息。

第四步，稀释文库：使用荧光定量方法量化混合文库产物并将其稀释至10ng/μL，按照不同测序平台的上机流程进行测序前准备。

进一步的，在扩增特异性靶点时DNA投入量为1-10ng，在富集靶点时连接好的接头通过第二步PCR进行扩增并纯化，混合到单个试管中并进行纯化，在混合文库时将定量后的样本按照等比进行混合

下表为不同方法/试剂盒上机前所需时间：

如上表格所示，采用2-step PCR技术时，其上机前总耗费时间少于“BGISEQ-500文库构建”，远少于“ForenSeqTMDNA特征制备”。

实施例二

图3为不同方法下的数据利用率占比图示，其中，noise表示测序噪音。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。