一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗的研制方法
阅读说明：本技术 一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗的研制方法 (Method for developing porcine circovirus 2d type and porcine infectious pleuropneumonia combined inactivated vaccine ) 是由 肖敏 任华 李桂明 刘德琴 花纪 于 2021-01-30 设计创作，主要内容包括：本申请涉及一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其制备方法,含有灭活的猪圆环病毒2d型和灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,所述二联灭活疫苗中猪圆环病毒2d型含量≥10～(6.0 )TCID-( 50)/头份,猪传染性胸膜肺炎放线杆菌含量≥6×10～(9 )CFU/ml。所述二联灭活疫苗降低抗原之间的相互干扰,只需一次免疫,即可达到分别免疫单苗的效果,省去猪圆环病毒2d型和猪传染性胸膜肺炎单苗免疫的复杂程序,耗时少,费力少；并且减少了油性佐剂的剂量,既降低了成本,也减少了动物的应激反应。(The application relates to a porcine circovirus 2d type and porcine infectious pleuropneumonia bivalent inactivated vaccine and a preparation method thereof, the bivalent inactivated vaccine contains inactivated porcine circovirus 2d type and inactivated porcine infectious pleuropneumonia actinobacillus, and the porcine circovirus 2d type content in the bivalent inactivated vaccine is more than or equal to 10 6.0 TCID 50 The content of actinobacillus pleuropneumoniae in the first part of the pig is more than or equal to 6 multiplied by 10 9 CFU/ml. The bivalent inactivated vaccine reduces the antigen-antigen interactionThe mutual interference is realized, the effect of respectively immunizing single seedlings can be achieved only by one-time immunization, the complex procedures of porcine circovirus type 2d and porcine contagious pleuropneumonia single seedling immunization are saved, and the time consumption and the labor consumption are low; and the dosage of the oily adjuvant is reduced, so that the cost is reduced, and the stress response of animals is also reduced.)
技术领域
本申请属于兽用疫苗领域，具体涉及一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗的研制方法。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种呼吸系统重要传染病，主要引起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速死亡，发病率和死亡率均在50% 以上。猪圆环病毒是迄今发现的一种最小的动物病毒，死亡率为10%~30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率可达到40%。在集约化养猪场，无论猪仔感染猪传染性胸膜肺炎还是猪圆环病毒，都会带来重大的经济损失。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其制备方法，包含至少一种猪圆环病毒2d型抗原和至少一种已灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原，以预防和治疗猪圆环病毒病和猪胸膜肺炎病的疾病。
本发明采取的技术方案是：一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，包括灭活的猪圆环病毒2d型和灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌以及佐剂；所述猪圆环病毒2型含量≥106.0 TCID 50/头份，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌含量≥6×109 CFU/ml。
进一步地，所述猪圆环病毒2d型佐剂为无菌Carbopol水溶液，浓度为3%。
进一步地，所述猪传染性胸膜肺炎病毒佐剂为水包油佐剂，所述水包油佐剂以Span85和角鲨烯为油相，以无菌 PBS和Tween80为水相；各组分比例为Span85 1%、角鲨烯5%、Tween80 1%，pH7.5 PBS。
进一步地，所述抗原与佐剂的体积比例为1：1。
本发明采取的另一技术方案是：一种猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤101. 分别制备猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎病毒的生产种子；
步骤103. 分别制备猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎的制苗用病毒液；
步骤105. 分别在猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎的制苗用病毒液中加入10％甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为 0.2% (V/V)，充分摇匀后置于37℃环境下灭活24小时，期间搅拌3~5次，加入0.2%的焦亚硫酸钠终止灭活；
步骤107. 分别对猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎的制苗用病毒液作10倍浓缩；
步骤109. 分别制备猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎佐剂，其中猪圆环病毒2型佐剂为无菌Carbopol水溶液，猪传染性胸膜肺炎病毒佐剂为水包油佐剂；
步骤111. 将步骤107得到的制苗用病毒液与相应的病毒佐剂按1:1的体积比例混合后，加入稀释剂稀释至浓缩前的浓度，再将得到的两种病毒液按照1:1的体积比例混合，装入无菌容器中在37℃条件下搅拌35min。
进一步地，所述稀释剂为无菌的PBS缓冲溶液，pH为7.5。
本发明的有益效果在于：降低抗原之间的相互干扰，获得一种具有良好的免疫原性的猪圆环病毒2d型、传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗；只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，省去猪圆环病毒2型和猪传染性胸膜肺炎单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少；并且减少了油性佐剂的剂量，既降低了成本，也减少了动物的应激反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例的流程示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
1. 生产种子的制备
（1）猪圆环病毒2d型生产种子的制备
将毒种用无菌PBS作适当稀释，按5％接种于PK15 细胞培养，所述PK15 细胞购自中国兽药监察所，令毒种在37℃的条件下吸附45分钟，加入含5％体积犊牛血清和3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM 细胞维持液，在37℃的条件下培养5日，期间冻融4 ~ 5次，收获病毒。
（2）猪传染性胸膜肺炎生产种子的制备
将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD平板上，所述TSA/NAD平板上含5% 小牛血清，将平板置与37℃条件下培养24小时。选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD（含5%小牛血清）液体培养基中，37℃培养12~16小时，作为一级种子。取一级种子的培养物，按0.1% 的量加入TSB/NAD（含5%小牛血清）液体培养基中，37℃培养12~16小时，经检验纯粹后作为二级种子。
2. 病毒液的制备
（1）猪圆环病毒2型d病毒液的制备
将长满单层的PK15细胞（购自ATCC），倒去细胞培养液，将毒种液按0.1~ 0.2TCID50 /个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附40分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转（12~16转/小时）培养。每日观察2~3次，细胞生长良好，37℃培养5日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。将猪圆环病毒2型病毒液用中空纤维滤柱过滤，除去细胞碎片。
（2）猪传染性胸膜肺炎菌液的制备
在猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基（商售TSB）中，加入0.01%～0.05%NAD、5%～10% 的血清，将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液按0.2% 的量加进培养基培养，混匀后置37℃培养15~20小时，当菌液的浓度OD600达到2.5以上、DO值开始上升、PH值降低到6.5以下时停止培养。
3. 灭活
在猪圆环病毒2d型病毒液和猪传染性胸膜肺炎病毒液中加入10％甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2％ (V/V)，充分摇匀后置于37℃环境下灭活24小时，期间搅拌3~5次，加入0.2％的焦亚硫酸钠终止灭活。
4. 浓缩
（1）猪圆环病毒2d型病毒液的浓缩
将猪圆环病毒2d型病毒液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda道尔顿）作10倍浓缩，浓缩后含量为107.0 TCID50 /头份。
（2）猪传染性胸膜肺炎菌液的浓缩
用中空纤维超滤器（GE healthcare，UniFluxTM D，30D-5m2）作10倍浓缩，浓缩后含量为6×1010 CFU/ml。
5. 佐剂的制备
（1）猪圆环病毒2d型佐剂的制备
采用无菌的Carbopol水溶液，浓度为2%。
（2）猪传染性胸膜肺炎佐剂的制备
猪传染性胸膜肺炎佐剂选用水包油佐剂，以Span85和角鲨烯为油相，以无菌PBS和Tween80为水相；各组分比例为Span85 1%、角鲨烯5%、Tween80 1%，pH7.5 PBS。将无菌 PBS（pH7.5）与Tween80混匀为水相，再将Span85与角鲨烯混匀为油相，之后再不断搅拌。在5000rpm的转速条件下缓慢加入油相，水相与油相混匀后开启乳化机，乳化15min。再将乳化的粗制混合物经均质机循环5次，过滤后保存于4℃备用。
6. 制苗
将制苗用病毒液与相应的病毒佐剂按1:1的体积比例混合后，加入稀释剂（无菌的PBS缓冲溶液，pH为7.5）稀释至猪圆环病毒2d型含量为1×106.0 TCID50/头份，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌含量为6×109 CFU/ml。再将得到的两种病毒液按照1:1的体积比例混合，装入无菌容器中在37℃、3000-5000rpm条件下搅拌35min，生产二联灭活疫苗。
7. 检验
选20~30日龄断奶仔猪70头，分为7组，每组10头；第1、2组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒2d型、猪传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗1ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒2d型灭活疫苗1ml，免疫后14d再次接种1ml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗；第5组颈部肌肉注射无菌PBS 1ml，14d再次接种1ml PBS；第6组颈部肌肉注射无菌PBS 1ml ；第7组为空白对照，既不接种，也不攻毒，在单独房间饲养。
试验结果表明，本发明实施例试制的二联灭活疫苗无论是从攻毒保护效果上，还是从血清学抗体水平上来看，其免疫效果都与市场上的商品单苗之和相当，两种抗原之间无相互干扰；其次，所述二联灭活疫苗的免疫持续期更长，效力持久，对猪传染性胸膜肺炎的免疫保护至少为180天，对猪圆环病毒2d型的免疫保护至少为120天；最后，本发明实施例的二联灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去猪圆环病毒2d型单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，即降低了成本，也减少了动物的应激反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。