一种单细胞裂解液及其应用
阅读说明：本技术 一种单细胞裂解液及其应用 (Single cell lysis solution and application thereof ) 是由 訾晓渊 雷佳 于 2021-02-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种单细胞裂解液及其应用。本发明所提供的单细胞裂解液可以在常温状态下保持线粒体完整的同时快速裂解细胞,耗时短,避免裂解温度过高、耗时长导致的RNA降解与污染。其单细胞裂解液组份均为常用试剂,配制简单、方便、成本低。经验证,本发明所提供的单细胞裂解液在常温下仅需1-5min便可以实现单细胞的裂解,高效简捷,且裂解强度适中,裂解后线粒体依然完好；显著提高单细胞转录组测序成功率,具有较高的商业应用价值。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a single cell lysate and application thereof. The single cell lysate provided by the invention can rapidly lyse cells while keeping the integrity of mitochondria at normal temperature, has short time consumption, and avoids RNA degradation and pollution caused by overhigh lysis temperature and long time consumption. The components of the unicellular lysis solution are common reagents, and the preparation is simple and convenient, and the cost is low. The single cell lysis solution provided by the invention can realize the lysis of single cells only within 1-5min at normal temperature, is efficient and simple, has moderate lysis strength, and is still intact mitochondria after lysis; obviously improves the sequencing success rate of the single cell transcriptome and has higher commercial application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单细胞裂解液及其应用。
背景技术
单细胞转录组测序（scRNA-seq）是近几年兴起的新技术，能够从单个细胞水平获得全转录组表达谱、扩增后进行高通量测序，从而高效地检测单个细胞内的基因表达水平，在干细胞的发育与分化、肿瘤的诊断与治疗、靶向药物的设计等领域具有重要的应用价值。单细胞测序流程主要包括单细胞提取、细胞裂解、mRNA反转录、cDNA扩增、文库构建、测序及数据分析。近年来，主要采用微流控系统从细胞悬液中分离单个细胞，而通过微流控分离得到单细胞以后，如何快速高效的裂解单细胞，释放出细胞质中的mRNA对后续构建NGS文库是非常关键的。
目前，常用于裂解单细胞的方法主要有冻融变性、碱裂解以及蛋白酶 K 裂解法等。在实际操作过程中采用上述裂解方法均存在一些不同程度的缺陷，比如操作比较复杂、耗时较长，温度过高容易造成RNA降解，裂解强度过大，细胞破碎时细胞核、线粒体也会破裂等问题，严重影响后续测序结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种单细胞裂解液及其应用。本发明所提供的细胞裂解液解决了现有的单细胞裂解时细胞核、线粒体同时破裂的问题。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案得以实现：
本发明的一个方面，是提供一种单细胞裂解液，所述裂解液包含质量分数为0.02~2%的Triton X100、终浓度为0.05~0.5 M的Tris-Hcl、终浓度为0.1~1M 的Licl、终浓度为5~10mM的DTT，以及终浓度为10~20mM的EDTA。
作为优选，在本发明的实施方式中，上述单细胞裂解液由质量分数为0.02~1%的Triton X100、终浓度为0. 05~0.2 M的Tris-Hcl、终浓度为0.1~0.5M 的Licl、终浓度为5~8mM的DTT，以及终浓度为10~14mM的EDTA组成。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述单细胞裂解液由质量分数为0.02~1%的Triton X100、终浓度为0.05~0.1M的Tris-Hcl、终浓度为0.1~0.2M 的Licl、终浓度为5mM的DTT，以及终浓度为10mM的EDTA组成。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述单细胞裂解液中包含质量分数为0.02%的Triton X100、终浓度为0.05M的Tris-Hcl、终浓度为0.1M 的Licl、终浓度为5mM的DTT，以及终浓度为10mM的EDTA。
本发明的另一个方面，是提供一种单细胞转录组测序中进行单细胞核酸提取的方法。该方法利用以上任意所述的单细胞裂解液来完成。
在上述方法中，样本在微流控芯片分离得到单个细胞后与所述单细胞裂解液混合，处理1-5min，分离后得到样本中所含的核酸。
本发明的另一个方面，是提供一种细胞核酸提取试剂盒，所述试剂盒包含上述的单细胞裂解液。
本发明的另一个方面，是提供一种上述单细胞裂解液用于在单细胞转录组测序中提取全血或细胞中核酸的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所提供的单细胞裂解液可以在常温状态下保持线粒体完整的同时快速裂解细胞，耗时短，避免裂解温度过高、耗时长导致的RNA降解与污染。本发明所提供的单细胞裂解液组份均为常用试剂，配制简单、方便、成本低。经验证，本发明所提供的裂解液在常温下仅需1~5min便可以实现单细胞的裂解，高效简捷，且裂解强度适中，裂解后线粒体依然完好；显著提高单细胞转录组测序成功率，具有较高的商业应用价值。
附图说明
图1是裂解微流控芯片中细胞裂解前的显微镜图；
图2是裂解微流控芯片中细胞裂解后的显微镜图。
具体实施方式
本发明公开了一种单细胞裂解液及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
材料：三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-Hcl）、氯化锂（Licl）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、二硫苏糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）均购自于生工生物工程（上海）股份有限公司；微流控芯片来自于新格元南京生物科技有限公司。
实施例1：单细胞裂解液的配置
单细胞裂解液的成分，具体应用时，可以采用如下实施例的单细胞裂解液成分配比：配置1mL单细胞裂解液，用移液枪吸取2 mol/L Tris -Hcl 50 uL于离心管中，加5 mol/L Licl 100 uL，加20% Triton X100 5uL ，加1 mol/L EDTA 20 uL ，加100mmol/LDTT50uL，吹吸混匀，加无菌水775 uL补至1mL，混合后备用。
实施例2：单细胞裂解液的配置
单细胞裂解液的成分，具体应用时，可以采用如下实施例的单细胞裂解液成分配比：配置1mL单细胞裂解液，用移液枪吸取2 mol/L Tris -Hcl 50 uL于离心管中，加5 mol/L Licl 100 uL，加20% Triton X100 5uL ，加1 mol/L EDTA 20 uL ，加100mmol/LDTT50uL，加无菌水775 uL，混合后备用。
实施例3：293T细胞的裂解
293T细胞生长速度快，倍增时间一般不超过1天，原代细胞复苏后传一代即可进行后续试验，本实施例中将生长状态良好的293T细胞悬液利用微流控芯片分离得到单个细胞，在微流控芯片中加入100uL实施例1中所配制的单细胞裂解液，在显微镜下观察加入前后细胞裂解情况，并记录裂解时间，拍照记录裂解过程。
图1是裂解微流控芯片中细胞裂解前的显微镜图；图2是裂解微流控芯片中细胞裂解后的显微镜图；由图1、图2可见，加入单细胞裂解液之前，落入微流控芯片中的293T 细胞轮廓清晰，细胞核清晰可见。加入单细胞裂解液后，细胞全部裂解且几乎不存在线粒体的裂解，且细胞全部裂解完时间不超过2min。
实施例4：PBMC（外周血单个核细胞）的裂解
取正常人外周血，制备外周血单个核细胞的PBMC悬液，用细胞核染色剂对PBMC悬液进行染色，利用微流控芯片对染色后的PBMC悬液进行分离得到单个细胞，在微流控芯片中加入100uL实施例2中所配制好的单细胞裂解液，在显微镜下观察外周血单个核细胞PBMC细胞的裂解情况，并记录裂解时间及裂解过程。经观测发现加入实施例2所配置的单细胞裂解液后外周血单个核细胞在3min内全部裂解完毕。
实施例5：单细胞裂解液对线粒体的影响
常规培养293T细胞，随机分为4组，分别为实验组A（实施例1中得到的裂解液）、实验组B（实施例2中得到的裂解液）、对比组C（冻融裂解法）和对比组D（碱裂解法），每组3个平行。每组倒去培养液后用PBS缓冲液冲洗3遍后沥干。实验组A和实验组B分别加入对应的单细胞裂解液，冻融裂解法具体为：-20℃冰冻、融化，加上石蜡油，在95℃热变性35min，从而使细胞裂解。碱裂解法中裂解液具体组份为：1mol/L Tris-Hcl，0.5mol/L Licl，1% SDS；裂解时间为15s。各组裂解时间和裂解状态如表1所示。
表1.各组裂解程度及状态对比
方法 裂解时间 裂解强度 裂解线粒体 实验组A 1-5min 适中 少量 实验组B 1-5min 适中 少量 对比组C 35min-14h 弱 少量 对比组D 1-15s 强 大量
从表1可见，与目前常用的冻融裂解法相比，本发明所提供的单细胞裂解液可以在较短时间内（1-5min）裂解单细胞，且裂解强度适中；碱裂解法虽然能够在1-15s实现快速裂解细胞，但是在裂解单细胞的同时，线粒体也存在大量的裂解，影响后续实验的准确性。本发明所提供的单细胞裂解液在裂解后细胞中线粒体完整性明显高于传统的碱裂解方法，且裂解强度适中，5分钟以内全部完成细胞的裂解，与现有的裂解方法相比具有明显的时间或裂解强度优势。
进一步，对上述实验各组裂解后线粒体的含量进行统计，表2是各组线粒体含量统计对比表。
表2.线粒体含量统计对比表
有丝分裂率 实验组A 实验组B 比对组C 比对组D >5% 14.781491 15.2365931 48.344371 91.366655 >10% 1.7994859 1.787592 22.102649 50.716533 >15% 0.8997429 0.3154574 12.417219 13.946173 >20% 0.5141388 0.3154574 5.380795 3.739951
由表2可见，本申请所提供的单细胞裂解液在裂解完成后细胞内的线粒体依然完好，可以预见的本申请所提供的单细胞裂解液可以显著提高单细胞转录组测序成功率，具有明显的技术优势。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。