一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法

文档序号：527186 发布日期：2021-06-01 浏览：7次 >En<

阅读说明：本技术 一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法 (Cotton metaphase chromosome non-denaturing fluorescence in situ hybridization method ) 是由刘玉玲杨足君彭仁海田艳淼韦洋洋刘震李鹏涛卢全伟李兆国于 2021-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法,其包括根据公布的棉花基因组序列信息,设计单染色体或染色体区段的寡核苷酸混合池；经末端连接特异标记,获得目标染色体或染色体区段的寡核苷酸混合探针；对棉花体细胞有丝分裂中期染色体进行非变性的荧光原位杂交。本发明的方法相比于传统FISH探针杂交,获得的寡核酸探针染色体特异性强,杂交信号检出率高；所设计的寡核酸探针不需要经过复杂的变性、重复洗脱等步骤,减少染色体丢失,速度快,简便快捷,结果可靠；为棉花染色体DNA重排、染色体配对、亲缘关系分析、异源染色质分析与遗传资源的高通量鉴定等提供技术支持,也为具有小型染色体的植物重复序列研究提供了借鉴。(The invention relates to a cotton metaphase chromosome non-denaturing fluorescence in situ hybridization method, which comprises the steps of designing an oligonucleotide mixing pool of a single chromosome or a chromosome segment according to published cotton genome sequence information; connecting a specific marker through the tail end to obtain an oligonucleotide mixed probe of a target chromosome or a chromosome segment; non-denaturing fluorescent in situ hybridization was performed on cotton somatic mitotic metaphase chromosomes. Compared with the traditional FISH probe hybridization, the method of the invention has the advantages that the obtained oligonucleotide probe has strong chromosome specificity and high hybridization signal detectable rate; the designed oligonucleotide probe does not need to undergo complicated steps of denaturation, repeated elution and the like, reduces chromosome loss, and has high speed, simplicity, convenience, rapidness and reliable result; provides technical support for cotton chromosome DNA rearrangement, chromosome pairing, genetic relationship analysis, heterochromatin analysis, high-throughput identification of genetic resources and the like, and also provides reference for the research of plant repetitive sequences with small chromosomes.)

技术领域

本发明涉及一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，属于生物信息学及分子细胞遗传学技术领域。

背景技术

异源四倍体棉花是植物多倍化研究的重要模式植物，在植物异源多倍化、染色体进化及远缘杂交育种研究中，染色体鉴别是进行染色体结构分析的重要基础。基于碱基互补配对原理的荧光原位杂交(FISH)技术可以实现特定核酸探针的准确染色体定位，已经成为鉴定和识别基因组与染色体组的关键技术之一，在棉属细胞遗传学分析中广泛应用。目前，在棉属基于FISH的染色体鉴定相关研究中，探针主要来自于一些基因组特殊重复序列(如rDNA序列)、染色体特异BAC克隆等。而基于rDNA序列探针只能局限于识别那些含有rDNA序列的少数染色体；染色体特异BAC克隆的获得依赖于大量的BAC文库筛选工作，而且，在基因组重复序列含量高的物种中，受到BAC克隆中重复序列的影响，非特异强，导致FISH分析过程中杂信号的干扰强，增加了技术应用的局限性。另外，利用这些探针，FISH流程复杂，费时费力。因此，有必要建立一种新的方法，开发出更多的棉花染色体特异探针，以利于准确识别染色体和染色体区段，了解特定染色体和染色体区段的结构特点，为具有小型染色体的植物重复序列研究提供了借鉴。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种用于棉花染色体的非变性荧光原位杂交(ND-FISH)，旨在解决目前FISH的探针标记繁杂、程序繁琐的问题。明确探针所代表的串联重复序列在染色体上的分布，了解染色体的结构特点，建立染色体特定界标，从而精准识别特定的染色体或染色体区段，进行不同棉种间比较分析。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交(ND-FISH)方法，其包括如下步骤：

S1、根据公布的棉花基因组序列信息，设计单染色体或染色体区段的寡核苷酸混合池；

S2、寡核苷酸混合池经末端连接特异标记，获得标记的寡核苷酸混合池，即目标染色体或染色体区段的寡核苷酸混合探针；

S3、以S2获得的寡核苷酸混合探针，对棉花体细胞有丝分裂中期染色体进行非变性的荧光原位杂交(ND-FISH)。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，在步骤S1中，所述对基因组序列数据用Tandem Repeats Finder(TRF)生物信息分析软件包，对已测序棉种每条染色体序列开展全基因组分析，匹配参数设置成2、7、7，分别对应匹配、错配、插入/删除，每条染色体的最小匹配值是50以识别重复序列(Repeats sequence，RS)，根据周期距离的片段大小将RS分成三类；用SPSS软件分析各棉种基因组染色体中重复序列的分布；

筛选各棉种Gypsy转座子种系特异性重复序列(Gypsy-RS)，建立各棉种Gypsy-RS分布的可视化数据库；在以上各棉种Gypsy-RS分布可视化数据库中，分离基于棉种染色体组、染色体或染色体区段的特异的寡核苷酸序列，设计一系列基于Gypsy-RS的寡核苷酸序列，构成寡核苷酸混合池。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，所述RS分成三类为<20、20-60和>60。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，所述SPSS软件为22.0版，SPSS，Chicago，IL。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，在步骤S2中，寡核苷酸混合池中各筛选的特异Gypsy-RS寡核苷酸序列，在5′端连接特异标记，标记成荧光原位杂交(FISH)探针，开展非变性的荧光原位杂交(ND-FISH)验证，使获得的寡核苷酸序列具有染色体或染色体区段特异性。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，在步骤S3中，非变性的荧光原位杂交为将寡核苷酸混合探针分别加入2×SSC 1×TE溶液作为杂交液，直接加在制备好的棉花体细胞有丝分裂中期染色体玻片上，进行杂交，杂交结束后，玻片直接放在2×SSC溶液中，塑膜盖片自然脱落；避光晾干，加入含有抗荧光衰减剂的DAPI，加上盖玻片，荧光显微镜观察。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，杂交为放入放42℃恒温箱杂交1～3h。

如上所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，优选地，获得的寡核苷酸混合池包括陆地棉A04、A06、A09、A10、D02和D08染色体特异的Gypsy-RS，序列如SEQ IDNO.1-6所示。

用于棉花中期染色体非变性荧光原位杂交的探针，其包括陆地棉A04、A06、A09、A10、D02和D08染色体特异的Gypsy-RS，序列如SEQ ID NO.1-6所示，探针的5′端连接荧光标记基团。

如上所述的探针，优选地，所述荧光标记基团包括FAM、TAMRA、JOE、CY3或ROX。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供的探针对棉花体细胞中期染色体进行非变性的荧光原位杂交，建立棉花中期染色体非变性FISH方法(ND-FISH)，为棉花染色体DNA重排、染色体配对、亲缘关系分析、异源染色质鉴定等提供技术支持，也为具有小型染色体的植物重复序列研究提供了借鉴。

相比于传统FISH探针，本发明所设计的寡核酸探针来自于基因组序列，在设计过程中经过严格的相关数据处理，探针的染色体或染色体区段特异性有了基本保证；探针设计灵活，可以根据研究需要，设计成覆盖整条染色体，也可以覆盖染色体的部分片段，或者染色体的多个区域，或者不同的染色体的不同区域；所设计非变性寡核苷酸探针较短，且为特异性单链状态，可与靶标染色体的完全杂交，能够准确反映染色体结构；探针一经设计成功，数据永久保存，每次合成后可以获得足够的探针量，使用过程中探针的稳定性强、使用成本低，适用于大量样本的高通量鉴定，便于不同研究者之间交流使用。

相比于传统FISH探杂交，所设计的寡核酸探针不需要经过复杂的变性、重复洗脱等步骤，减少染色体丢失，速度快，整个杂交过程1-3个小时，简便快捷，结果可靠。

附图说明

图1为以陆地棉中期染色体制片为靶标，基于陆地棉基因组串联重复序列设计的荧光染料标记的寡核苷酸引物为探针，ND-FISH验证结果；其中A为寡核苷酸序列A04-222，2对红色信号；B为寡核苷酸序列A06-39，2对绿色信号；C为寡核苷酸序列A09-75，2对绿色信号；D为寡核苷酸序列A10-23，2对绿色信号；E为寡核苷酸序列D02-608，1对红色信号；F为寡核苷酸序列D08-43，1对绿色信号。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述，未明确强调指出的采用现有技术进行。

实施例1

根据四倍体陆地棉(AD1)基因组序列的串联重复序列设计，具体步骤如下：对四倍体陆地棉的基因组序列数据用Tandem Repeats Finder(TRF)生物信息分析软件包分析每条染色体序列，匹配参数设置成2、7、7，分别对应匹配、错配、插入/删除，每条染色体的最小匹配值是50以识别重复序列(Repeats sequence,RS)，根据周期距离的片段大小将RS分成三类(<20、20-60和>60)。用SPSS软件(22.0版，SPSS，Chicago，IL)分析各棉种基因组染色体中RS的分布。筛选各棉种Gypsy转座子种系特异性重复序列(Gypsy-RS)，建立各棉种Gypsy-RS分布的可视化数据库。在Gypsy-RS分布可视化数据库中，分离基于陆地棉A04、A06、A09、A10、D02和D08染色体特异的Gypsy-RS，设计对应染色体基于Gypsy-RS的寡核苷酸序列。

得到的寡核苷酸序列包括：

A04-222(SEQ ID NO.1)：5'-GCTCAACTCATTTCTCGCAATATGAGTTGAATTTTGAAAACAGAA-3'

A06-399(SEQ ID NO.2)：5'-CGTTTAACAAAATCAATTCACAATTTCTTTCTTCTTTAAAACATTTCC-3'

A09-75(SEQ ID NO.3)：5'-TTGAAAAACAAAAATTGAAAATACCTCAACGTGTCTTGAGGTTCA-3'

A10-23(SEQ ID NO.4)：5'-AACACTTCAATTTGCAGCACTTT-3'

D02-608(SEQ ID NO.5)：5'-AATTTCAATAATCTCTGATATGGATCCTCTCTTCACTTCACGGTTCTA-3'

D08-43(SEQ ID NO.6)：5'-TTGAATTTTGAAAACAGAAATTGAAATTACCTCAACG-3'

将设计好的序列送公司进行寡核苷酸序列合成，合成时对5'端碱基进行荧光标记(D08-43-FAM；A04-222-TAMRA；A06-399-TAMRA；A09-75-FAM；D02-608-2-TAMRA)，以获得用于非变性荧光原位杂交(ND-FISH)分析的探针。

获得的荧光标记探针进行非变性荧光原位杂交(ND-FISH)试验，验证探针的染色体分布。具体的试验流程包括：(1)探针稀释：每2个OD的标记探针，离心(8000转，2min)，加200μL 1×TE(pH8.0)作为母液，-20℃保存。(2)工作液：利用2×SSC 1×TE(pH7.0)对母液稀释10倍，配置探针的杂交工作液。(其中，所用溶液2×SSC 1×TE的配制方法为：先配置20×SSC母液：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加ddH₂O至1000mL，用10mol/L NaOH调pH值至7.0；10×TE母液：1mol/L Tris-HCl pH值8.0 5ml，0.5mol/L EDTA pH值8.0 1ml，加水至50mL，调pH值至8.0；上述母液分别以ddH₂O稀释为4×SSC和2×TE；等体积混合4×SSC和2×TE，调节pH值至7.0获得2×SSC 1×TE(pH值7.0))。(3)杂交液：将探针各1-2μL工作液，分别加入6.0μL的2×SSC 1×TE(pH值7.0)中，即为杂交液。直接加在制备好的陆地棉体细胞有丝分裂中期染色体玻片上，盖上塑膜盖片。放42℃恒温箱杂交1-3h。(4)杂交结束后，玻片直接放在2×SSC溶液中，塑膜盖片自然脱落。避光晾干，加入含有抗荧光衰减剂的DAPI，加上盖玻片，荧光显微镜观察，结果见图1，其中A为寡核苷酸序列A04-222，如图所示，从左向右依次为修正的整合图、DAPI衬染的染色体图、A04-222信号、整合图，结果显示有2对红色信号；同样地，B为寡核苷酸序列A06-39，2对绿色信号；C为寡核苷酸序列A09-75，2对绿色信号，D为寡核苷酸序列A10-23，2对绿色信号；以上结果表明A、B、C、D四个探针在A亚基因组和D亚基因组的对应部分同源染色体都各有1对信号，但是A亚基因组染色体和D亚基因组染色体上表现出信号强度的差异，即A亚基因组染色体上信号稍强。E为寡核苷酸序列D02-608，1对红色信号；F为寡核苷酸序列D08-43，1对绿色信号，表明E、F探针只在对应的D亚基因组有1对信号。结果表明，本发明所设计的寡核苷酸混合探针，通过对棉花体细胞有丝分裂中期染色体进行非变性的荧光原位杂交，可以获得清晰的杂交信号，可以作为染色体识别的理想探针，将为棉花染色体DNA重排、染色体配对、异源染色质鉴定等提供技术支持。利用这些染色体特异探针在棉属二倍体A基因组、D基因组，以及AD基因组相关棉种进行杂交，根据杂交信号的染色体分布、信号位点差异，也将为棉属的亲缘关系分析提供直观证据。

而采用现有技术设计的探针，进行现有技术的FISH分析，由于干扰性强，没有荧光显示。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 安阳工学院

<120> 一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA