具体实施方式

下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

结直肠癌与癌旁组织circRNA表达水平：

1、cDNA文库的构建和DNA测序。

使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)按照制造商的程序从细胞和组织中分离总RNA，并使用Bioanalyzer 2100和RNA 6000 Nano LabChip Kit(Agilent，SantaClara，CA，USA)定量。使用Epicentre Ribo-Zero Gold Kit(Illumina，San Diego，USA)纯化大约10μg的总RNA，并在高温下使用二价阳离子将这些poly(A)-或poly(A)+RNA或circRNA级分片段化成小块，然后根据mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina)将切割的RNA片段逆转录成cDNA用于cDNA文库构建，在配对末端文库中平均插入片段大小为300bp(±50bp)，使用Illumina Hiseq3000对DNA进行测序。

测序的转录组共一百万对成对，读取产生千兆的DNA序列，大约是基因组大小的七倍。在组装之前，除去低质量读数(1，含有测序衔接子的读数；2，含有测序引物的读数；3，q质量得分低于20的核苷酸)。然后将清洁的配对末端读数提交至NCBI Short ReadArchive。

2、DNA序列数据分析。

为了分析差异circRNA表达，使用STAR将读数定位到基因组和DCC鉴定circRNA并估计circRNA表达水平。使用edgeR程序将M值的修剪平均值(TMM)用于标准化差异circRNA表达。miRanda工具用于预测靶向circRNA的miRNA。

如图1A所示，两例结直肠癌和癌旁组织中差异表达的circRNA，共鉴定出17659个circRNA，其中9466个是新的circRNA，其未记录在circRNA数据库中。

这些新的circRNA大多是由外显子测序产生的，参照图1B，它们的中位数长度为359bp；如图1C所示，它们的基因组分布数据显示，该circRNA存在于所有人类染色体中。

如图1D所示，使用≥2倍变化和显著性差异P<0.05的标准在结直肠癌和相应癌旁组织中选择差异表达的circRNA，得到724个差异表达的circRNA，其中241个上调，483个下调。

实施例2

结合miRNA和调节基因通路：

microRNA(miRNA)海绵是经常报道的circRNA功能模型，用于生物信息学预测circRNA与内源miRNA的竞争性结合。在本实施例中，我们首先预测了大肠癌组织中724差异表达的circRNA与miRNA的潜在结合。

如图2A所示，使用R语言和Ingenuity途径分析IPA平台对这些差异表达的circRNA结合miRNA网络进行基因途径分析；其相关途径的数据总结如图2B所示。其中，如图2C所示，AMPK途径，胰岛素抗性途径，HIF-1途径和ErbB途径在结直肠癌中起主要作用。

实施例3

结直肠癌组织中差异表达的circRNA：

将结肠直肠癌患者收集血液样品，用2,000g离心30分钟，上清液转移到50mL锥形管中，并以2,000g离心30分钟。将上清液转移到新管中，向管中加入0.5体积的TEI试剂(Invitrogen)，或者每5mL培养基加入1mL ExoQuick试剂(SBI)，充分混合，4℃温育过夜。第二天，将混合物以10,000g离心1小时，然后吸出上清液。将得到的沉淀加入在PBS中，然后使用qRT-PCR分析circRNA水平。

为了验证这些差异表达的circRNA在结直肠癌和相应的癌旁组织和外泌体中的表达，我们首先使用Trizol试剂(Invitrogen)从组织或外泌体样品中分离RNA，并使用Geneseed II将它们逆转录成cDNA。使用ABI 7500机器(ABI，USA)中进行qPCR。qPCR条件为：每个SYBR Green反应，总体积为20μl，其含有2μlcDNA和每种引物(10μM)。PCR进行初始95℃5分钟，然后进行40个循环：95℃10秒，60℃34秒和60℃60秒。为了验证SYBR Green染料是否被检测为对定量逆转录酶-聚合酶链反应(qRT-PCR)产物具有特异性，我们在qRT-PCR的最后一个循环后对样品进行热解离方案以检查是否存在只有一个峰值。并计算circRNA表达的相对水平。

如图3所示，为了验证差异表达的circRNA，本实施例选择了四个主要改变的circRNA分别为circ-SATB2(has_circ_0003915)，circ-HIPK3(has_circ_0000284)，circ-ARHGAP12(has_circ_0000231)和circ-AHNAK(has_circ_0008194)；以在88例结直肠癌和相应的癌旁组织中进行验证；其中，如图3C所示，与相应的癌旁组织相比，大肠癌组织中circ-HIPK3的表达上调。

如图4A-B所示，本实施例验证了18个其他结直肠组织样品中circ-HIPK3表达的水平，数据进一步证实了上述数据(显著性差异P<0.01)。

如图4B所示，ROC分析显示AUC为0.815(95％CI，0.674-0.956)，阈值为0.0065，敏感性和特异性分别为88.9％和61.1％。

如图4C所示，我们将circ-HIPK3的表达水平与结直肠癌患者的临床病理数据相关联，发现circ-HIPK3在肿瘤分期的相对表达较高(在A期高于B期和C期，显著性差异P<0.01)。

如图4D所示，在30名健康对照和结肠直肠癌患者的外泌体中检测到circ-HIPK3的表达，并发现circ-HIPK3表达在结肠直肠癌患者的外来体中上调(显著性差异P<0.001)。

实施例4

circ-HIPK3表达下调对大肠癌细胞迁移、侵袭和增殖的抑制作用。

Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭测定：

将结肠直肠癌细胞以2×104/孔的密度接种到24孔板中并孵育过夜。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将HIPK3 siRNA和cDNA转染24小时之后，用2.5％胰蛋白酶分离细胞，并以1×10⁶/ml的浓度混匀于无血清DMEM中。将200μl细胞溶液加入Transwell的每个孔中，并向每个孔中加入600μl含20％FBS的DMEM。随后，将Transwell在37℃下孵育48小时，Transwell过滤器具有8.0-μm孔，为了进行侵袭测定，过滤器预涂有50μL基质凝胶。测定之后，使用棉签除去残留在过滤器顶面上的细胞，而迁移到膜下表面的细胞用10％福尔马林固定，并用0.5％结晶紫溶液染色，在光学显微镜下对它们计数5个随机视野(×200)。

流式细胞术Annexin V凋亡检测：

为了检测细胞凋亡的变化，使用2.5％胰蛋白酶分离HIPK3 siRNA或cDNA转染48小时后的细胞，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(KeyGen，江苏)用FITC结合的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色。FACScan流式细胞仪(DB Biosciences，San Jose，CA，USA)进行分析。使用Cell Quest软件(BD Biosciences)定量测定细胞凋亡率。

如图5A所示，在结直肠癌细胞中检测到circ-HIPK3表达，发现circ-HIPK3在高侵袭性结直肠癌细胞系如Lovo和SW620中高表达，但在HT29，SW480中低表达。

我们降低了结直肠癌Lovo细胞中circ-HIPK3的表达，并评估了circ-HIPK3对细胞的影响。如图5B所示，在结直肠癌细胞中降低circ-HIPK3表达后，肿瘤细胞迁移和侵袭能力降低；如图5C所示，肿瘤细胞的存活率没有明显变化。

如图6所示，circ-HIPK3的过表达调节G1(DNA合成前期)的细胞周期。

如图7所示，circ-HIPK3表达的下调诱导肿瘤细胞凋亡，表明circ-HIPK3是致癌基因或在结肠直肠癌细胞中具有致癌活性。

上述实施例表明，与癌旁组织相比，circ-HIPK3在结肠直肠癌细胞中过度表达，促进了结直肠癌细胞的迁移、侵袭和生存能力，敲低circ-HIPK3表达，则能抑制肿瘤细胞迁移侵袭；因此，circ-HIPK3作为生物标志物，适用于结直肠癌早期检测和治疗后癌症复发和进展的监测，真实性高，AUC值达到0.815。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 广州医科大学附属中医医院

<120> 用于结直肠癌早期检测和复发监测的生物标志物及其应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> circRNA

<400> 1

caatctcggt actacaggta tg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> circRNA

<400> 2

tcacataggt ccgtggatag 20