一种火麻仁蛋白制备抗氧化肽的方法
阅读说明：本技术 一种火麻仁蛋白制备抗氧化肽的方法 (Method for preparing antioxidant peptide from fructus cannabis protein ) 是由 孔令羽 刘胜贵 蒋永昌 李智高 薛红芬 张琼 于 2021-04-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种火麻仁蛋白制备抗氧化肽的方法,包括以下步骤：用超声波细胞粉碎器作用火麻仁得到火麻仁粕,用碱法提取火麻仁蛋白质；配制枯草芽孢杆菌液体发酵培养基,将火麻仁蛋白接种至发酵液中培养；发酵液离心取上清液,所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化,收集洗脱组分的第二峰,液质联用色谱分离鉴定,得到火麻仁抗氧化肽粗品；火麻仁抗氧化肽粗品经过二次纯化即得抗氧化纯品。有益效果为：本制备方法利用枯草芽孢杆菌进行发酵,具有酶产率和回收率高等优点,显著降低50～80%成本,提高10～20%得率,抗氧化肽纯品中火麻仁抗氧化肽的纯度较高,其对DPPH自由基和羟自由基的清除率达90%以上,且具有溶血栓和降血压的功效,有较高的经济价值。(The invention discloses a method for preparing antioxidant peptide from fructus cannabis protein, which comprises the following steps: using ultrasonic cell crusher to act fructus Cannabis to obtain fructus Cannabis dregs, and extracting fructus Cannabis protein with alkali method; preparing a bacillus subtilis liquid fermentation culture medium, and inoculating the hemp seed protein into the fermentation liquor for culture; centrifuging the fermentation liquor to obtain supernatant, separating and purifying the obtained peptide solution by using a gel chromatography column, collecting a second peak of an eluted component, and performing liquid chromatography-mass spectrometry to separate and identify to obtain a fructus cannabis antioxidant peptide crude product; and carrying out secondary purification on the hemp seed antioxidant peptide crude product to obtain an antioxidant pure product. The beneficial effects are that: the preparation method utilizes the bacillus subtilis to ferment, has the advantages of high enzyme yield and recovery rate and the like, obviously reduces the cost by 50-80%, improves the yield by 10-20%, has high purity of fructus cannabis antioxidant peptide in the pure antioxidant peptide product, has clearance rate of DPPH free radical and hydroxyl free radical of more than 90%, has the effects of dissolving thrombus and reducing blood pressure, and has high economic value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种火麻仁蛋白制备抗氧化肽的方法。
背景技术
人体内一切活性的物质均以肽的形式存在，人体内存在成百上千种肽，以大脑的肽最多，约占体内肽的70%，肽涉及人体激素、神经、内分泌、免疫、生殖等。几乎所有的细胞都受多肽的调节，如细胞生长、细胞分化、合成增殖、神经激素递质的调节、免疫调节等。这些内源性生物肽在体内发挥很强的生理功能和生物活性，是人体重要的生理调节剂。胰岛素、生长素、谷胱甘肽、超氧化歧化酶等是已知体内起功能作用的肽类。
但是，随着年龄的增大、或者各种因素有可能导致内分泌失调和神经系统失调，这时仅靠我们体内自身合成各种肽类来调节生理功能显然不能满足人体的正常生理需要。因此，靠摄食生物活性肽来维持人体的健康，越来越得到大众的认可。生物活性肽易于吸收，高营养，而且具有生理功能，其直接作用于神经传递、刺激肠道受体激素或刺激酶的分泌而发挥生理功能。活性肽是通过抑制慢性病的发生、提高自身的免疫途径来促进人体健康，因而应用越来越广泛，多肽产物作为婴幼儿食品、老年人食品、美容食品、肠道调节功能食品和免疫食品等食品基料来应用的，临床上可作为消化不良、创烧伤、脑病等患者的辅助治疗食品。
抗氧化肽就是生物活性肽其中重要的一种，是蛋白质类物质中比较有前途的肽类。因为最近十年来发现一些多肽和氨基酸具有较高的抗氧化性，多肽的抗氧化作用比维生素C和维生素E这些传统的抗氧化剂的优势在于它的抗氧化持续时间较长，与SOD酶相比较，抗氧化肽的结构简单，而且不会过敏。SOD可以清除超氧阳离子，但对于衰老和不健康状况所产生的超氧阳离子，摄入抗氧化肽来减少这些自由基的攻击很有意义。抗氧化肽的抗氧化性在某些方面比传统的抗氧化物质优越：较好的抗氧化活性、很高的安全性以及生理调节功能和营养因素，因此 ，抗氧化肽的医药、食品领域前景极好，具有广阔的开发和应用前景。
火麻为桑科植物大麻(Cannabis sativa L.)的干燥成熟种子，别名又叫大麻仁、火麻、线麻子。我国是火麻资源最丰富的国家，在云南、黑龙江、辽宁、广西、四川等地均有分布，秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干后为火麻仁。火麻仁味甘，性平，归脾、胃、大肠经，功效润肠通便、润燥杀虫。火麻仁中的有益物质非常丰富，特别是不饱和脂肪酸和γ-生育酚为其带来了较强的抗氧化、降低血脂，降压和延缓衰老的功效。
火麻仁它富含人体不能合成的必须脂肪酸，尤其是γ-亚麻酸，这种对人体健康十分有益的亚麻酸通常只在蓝绿藻及黑醋栗种子油中才含有；火麻仁中的油酸、亚油酸、花生四烯酸等对人体也非常有益。火麻仁蛋白质65-70%是麻仁球蛋白和麻仁清蛋白，其中麻仁球蛋白是所有蛋白质中最易被消化的；火麻仁蛋白中不含色氨酸抑制因子，故不会影响蛋白的吸收，也不会造成胃胀反胃。另外，火麻仁中维生素E含量也比较高。通过以往的的科学研究，正常的大鼠灌服火麻仁提取物，其血压显著降低；对照组饲喂高脂饲料，给药组在此基础上加10%火麻仁干品，结果表明，火麻仁有阻止大鼠血清胆固醇升高的作用。由此可见，火麻仁具有降血压，血脂功效。不仅如此，随着社会经济与文化的进步，越来越多的女性着重于自身的健康发展，对于抗氧化、抗衰老的需求日趋增高。研究发现，火麻油可通过增强机体抗氧化作用及对免疫疫系统的影响而延缓衰老；用火麻仁片每天给模型小鼠灌胃一次，连续给药40d后能显著增加小鼠排便次数。分析认为火麻仁具有润滑肠壁、轻度兴奋肠管、增加蠕动、减少大肠吸收水分的作用。
枯草芽孢杆菌作为芽孢杆菌属中发现和命名较早的种，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，存在着广泛的肽谱酶系。枯草芽孢杆菌是制造传统食物的重要微生物，其应用可以追溯到一千多年前，在日本平安时代就开始使用枯草芽孢杆菌生产传统食物纳豆，这些发酵物的特点是大豆蛋白水解成氨基酸、多肽和氨，使得豆制品的功能得到改进。另外，枯草芽孢杆菌对制备的抗氧化肽产品有重要贡献，如日本纳豆，具有溶血栓和降血压功效。枯草芽孢杆菌酶系特别丰富，在生长代谢过程中大量分泌多种胞外蛋白酶，如中性蛋白酶，碱性蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶，产酶能力强，酶解能力高、发酵时间短，因而比其他有益微生物有更多的优点，其研究和应用受到广泛重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗氧化肽的制备方法，本制备方法可通过作用于火麻仁蛋白制备方法利用枯草芽孢杆菌进行发酵，具有酶产率和回收率高等优点，显著降低50~80%成本，提高10~20%得率，抗氧化肽纯品中火麻仁抗氧化肽的纯度较高，其对DPPH自由基和羟自由基的清除率达90%以上，且具有溶血栓和降血压的功效，有较高的经济价值。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种抗氧化肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1，火麻仁蛋白的制备
将火麻仁真空干燥，去壳，麻仁粉碎机粉碎，用超声波细胞粉碎器去除火麻仁油脂得到火麻仁粕，用碱法提取蛋白质，真空干燥备用；
步骤2，菌株的活化和纯化
配制营养琼脂PDA培养基，灭菌；灭菌降温后倒入平板种子培养基；接种菌株进行活化，挑选出生长良好的菌种备用；
步骤3，制备抗氧化肽
配制火麻仁蛋白粉液体发酵培养基，灭菌；灭菌降温后将菌株接种至培养基中摇床发酵；发酵液离心取上清液，所得肽溶液以凝胶层析柱分离纯化，收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到火麻仁抗氧化肽粗品；
步骤4，纯化抗氧化肽
将所述火麻仁抗氧化肽粗品二次纯化得抗氧化肽纯品。
进一步的，所述步骤1中，火麻仁外皮去掉后，用药物粉碎机粉碎，过0.45-1.2mm网筛；超声波细胞粉碎器去除火麻仁油，作用温度25-27℃，功率200-250w，占空比20：20（s/s）,60-65min；碱液提取，PH为8.3-8.5，温度45-47℃，料液比1:12（g/mL）,60-65min。
进一步的，所述步骤2中，营养琼脂PDA培养基配比为：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，去离子水1L，调PH至7.0，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，121℃高压灭菌15min；
进一步的，所述步骤3中，火麻仁蛋白粉液体培养基：火麻仁蛋白粉3-5%，麸皮1%（w/v），0.5g红糖粉，调PH至7.0，经121℃高压灭菌15min；菌株接种量为5-15%，发酵液多肽得率最高，达32%；摇床转速为180r/min，发酵时间为24h；发酵液8000r/min离心10min；凝胶柱洗
进一步的，所述步骤4中，二次纯化包括以下步骤，
a)火麻仁抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤的抗氧化肽粗品溶液；
b)抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，依次在缓冲液和磁化水中透析后获得抗氧化肽初纯溶液；
c)抗氧化肽初纯溶液通过反相色谱法精纯后获得抗氧化肽精纯溶液；
d)抗氧化肽精纯溶液通过HPLC法转盐，获得抗氧化肽盐溶液；减压浓缩、干燥后得到火麻仁抗氧化肽纯品。
本发明的有益效果在于：
1）改善口感、提高营养价值：采用微生物发酵法，能对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽与氨基酸之间发生移接和重排，制得的抗氧化肽无苦味和异味； 制备的抗氧化肽混合物，富含氨基酸、矿物质，
2）利用超声波细胞粉碎机破碎细胞和强化传质，使溶剂分子渗透到组织细胞中去，更好的与溶剂分子接触，使细胞中可溶性分子更好的释放出来，粗蛋白得率为82.4%，提高了10.1%。碱液提取火麻仁最佳得率为84.6%，同时缩短提取1/3时间。
3）抗氧化肽对DPPH，HO-的清除能力，螯合铁能力和油酸过氧化体系的抑制力，发酵时间为48h制备的抗氧化肽对自由基的清除能力最强，游离氨基酸含量、多糖含量和蛋白酶活均比其他时间段高，氨基酸氮的含量为5.47%、多糖含量482.4mg/L，和蛋白酶活为328U/mL。
4）经多次纯化后，火麻仁抗氧化肽纯品纯度可大于99%，其有效成分的有效率可超过60%，经济价值较为显著；在溶解与透析抗氧化肽的磁化水中加入微量的乙酸有助于提高磁化水的活性。从而将火麻仁抗氧化肽粗品中的抗氧化肽和小分子蛋白质以及小肽更加充分的溶解，避免抗氧化肽在溶解和透析过程中发生散失，从而减损终产物中抗氧化肽的纯度与得率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
1.火麻仁蛋白的制备
火麻仁60℃真空干燥4h，水分为4%，去壳，麻仁粉碎机粉碎，过0.45mm网筛，用超声波细胞粉碎器去除火麻仁油脂，作用温度25℃，功率200w，占空比20：20（s/s）,60min得到火麻仁粕；碱液提取，PH为8.5，温度45℃，料液比1:12（g/mL）,60min。真空干燥备用。
2.菌株的活化和纯化
配制营养琼脂PDA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，去离子水1L，调PH至7.0，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，121℃高压灭菌15min；灭菌降温至40℃后倒入平板种子培养基；从原菌上接种2环枯草芽孢杆菌菌株到平板培养基上进行活化，在35℃下活化24h，挑选菌落形态较好的菌种再重复上述操作，直至挑选生长良好（菌落粗糙、不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色）的菌种接种到培养基上，备用。
3.制备抗氧化肽
配制火麻仁蛋白粉液体发酵培养基：火麻仁蛋白粉3%，麸皮1%（w/v），0.5g红糖粉，调PH至7.0，经121℃高压灭菌15min；灭菌降温至40℃，接种枯草芽孢杆菌5%至培养基中摇床发酵，摇床转速为180r/min，发酵时间为24；发酵液离心取上清液，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物，超滤后即可得到分子量小于2kDa的富含抗氧化肽的溶液；所得肽溶液以凝胶层析柱纯化分离，洗脱液氯化钾0.025mol/L-乙酸0.2mol/L，流速3ml/min；收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到火麻仁抗氧化肽粗品。
4.纯化抗氧化肽
火麻仁抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤的抗氧化肽粗品溶液，磁化水中含有10ppm的乙酸；抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，置于缓冲液中，与室温下搅拌渗透至缓冲液PH=3.2，然后将抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗透至半透膜内溶液PH=4.6；抗氧化肽初纯溶液采用反相色谱：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为10mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节PH值至2.0；B相以10%的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min得到抗氧化肽精纯溶液；通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐获得抗氧化肽盐溶液；再减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50℃保持2h，使真空度恒定在0.01Mbar，升温干燥至12h得到火麻仁抗氧化纯品。
实施例2
1.火麻仁蛋白的制备
火麻仁60℃真空干燥4h，水分为4%，去壳，麻仁粉碎机粉碎，过0.7mm网筛，用超声波细胞粉碎器去除火麻仁油脂，作用温度26℃，功率210..0w，占空比20：20（s/s）,60min得到火麻仁粕；碱液提取，PH为8.5，温度45℃，料液比1:12（g/mL）,60min。真空干燥备用。
2.菌株的活化和纯化
配制营养琼脂PDA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，去离子水1L，调PH至7.0，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，121℃高压灭菌15min；灭菌降温至40℃后倒入平板种子培养基；从原菌上接种2环枯草芽孢杆菌菌株到平板培养基上进行活化，在35℃下活化24h，菌种接种到培养基上，备用。
3.制备抗氧化肽
配制火麻仁蛋白粉液体发酵培养基：火麻仁蛋白粉5%，麸皮1%（w/v），0.5g红糖粉，调PH至7.0，经121℃高压灭菌15min；灭菌降温至40℃，接种枯草芽孢杆菌7%至培养基中摇床发酵，摇床转速为180r/min，发酵时间为24h；发酵液离心取上清液，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物，超滤后即可得到分子量小于2kDa的富含抗氧化肽的溶液；所得肽溶液以凝胶层析柱纯化分离，洗脱液氯化钾0.025mol/L-乙酸0.2mol/L，流速2ml/min；收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到火麻仁抗氧化肽粗品。
4.纯化抗氧化肽
火麻仁抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤的抗氧化肽粗品溶液，磁化水中含有10ppm的乙酸；抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，置于缓冲液中，与室温下搅拌渗透至缓冲液PH=3.2，然后将抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗透至半透膜内溶液PH=4.6；抗氧化肽初纯溶液采用反相色谱：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为20mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节PH值至3.0；B相以20%的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min得到抗氧化肽精纯溶液；通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐获得抗氧化肽盐溶液；再减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50℃保持2h，使真空度恒定在0.01Mbar，升温干燥至12h得到火麻仁抗氧化纯品。
实施例3
1.火麻仁蛋白的制备
火麻仁60℃真空干燥4h，水分为4%，去壳，麻仁粉碎机粉碎，过1.2mm网筛，用超声波细胞粉碎器去除火麻仁油脂，作用温度27℃，功率220w，占空比20：20（s/s）,60min得到火麻仁粕；碱液提取，PH为8.5，温度45℃，料液比1:12（g/mL）,60min。真空干燥备用。
2.菌株的活化和纯化
配制营养琼脂PDA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，去离子水1L，调PH至7.0，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，121℃高压灭菌15min；灭菌降温至40℃后倒入平板种子培养基；从原菌上接种2环枯草芽孢杆菌菌株到平板培养基上进行活化，在35℃下活化24h，挑选菌落形态较好的菌种再重复上述操作，直至挑选生长良好（菌落粗糙、不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色）的菌种接种到培养基上，备用。
3.制备抗氧化肽
配制火麻仁蛋白粉液体发酵培养基：火麻仁蛋白粉4%，麸皮1%（w/v），0.5g红糖粉，调PH至7.0，经121℃高压灭菌15min；灭菌降温至40℃，接种枯草芽孢杆菌15%至培养基中摇床发酵，摇床转速为180r/min，发酵时间为24；发酵液离心取上清液，将小于2kDa的滤液低温浓缩得浓缩提取物，超滤后即可得到分子量小于2kDa的富含抗氧化肽的溶液；所得肽溶液以凝胶层析柱纯化分离，洗脱液氯化钾0.025mol/L-乙酸0.2mol/L，流速1ml/min；收集洗脱组分的第二峰，液质联用色谱分离鉴定，得到火麻仁抗氧化肽粗品。
4.纯化抗氧化肽
火麻仁抗氧化肽粗品通过磁化水溶解后过滤的抗氧化肽粗品溶液，磁化水中含有10ppm的乙酸；抗氧化肽粗品溶液加入半透膜中，置于缓冲液中，与室温下搅拌渗透至缓冲液PH=3.2，然后将抗氧化肽溶液的半透膜转移至磁化水中，室温下搅拌渗透至半透膜内溶液PH=4.6；抗氧化肽初纯溶液采用反相色谱：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，浓度为10mM的硫酸铵水溶液为A相，乙腈为B相；A相采用硫酸调节PH值至2.0；B相以10%的梯度进行洗脱，洗脱时间为60min得到抗氧化肽精纯溶液；通过HPLC法转盐为通过醋酸铵和醋酸条件离子交换转盐获得抗氧化肽盐溶液；再减压冷冻干燥的方式实现，操作过程为：预冻至-50℃保持2h，使真空度恒定在0.01Mbar，升温干燥至12h得到火麻仁抗氧化纯品。
试验例
1、抗氧化活性测定
通过体外抗氧化试验，测定本发明火麻仁抗氧化肽对自由基的清除效果，从而验证其抗氧化能力。
DPPH是一种稳定的自由基，当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸光度减小，而吸光度减小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率（SR）来表示，清除率越大，抗氧化能力越强。
试验材料：实施例1—3、市售抗氧化肽。
实验方法：取1ml火麻仁抗氧化肽，溶于2ml无水乙醇，完全混匀后，加入2mL的60μmol/L的DPPH溶液混匀，放置30min，以无水乙醇调零，在517nm处测得吸光度为Ai；同样的方法取2mL无水乙醇溶剂+2mL DPPH溶液混匀测定吸光度为Ac；再取1ml火麻仁抗氧化肽溶于2mL无水乙醇，混匀后加入2mL无水乙醇溶剂混匀测定吸光度为Aj。按下述公式计算其自由基清除率。
清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％
其中，Aj反应样品自身对吸光度的贡献；Ai样品对DPPH作用后的吸光度数值；Ac为DPPH本身在测定波长的吸收。
实验结果如表1所示：
表1 本发明火麻仁抗氧化肽对自由基（DPPH）清除效果
样品
清除率（%）
实施例1
89.3
实施例2
92.0
实施例3
90.5
市售火麻仁抗氧化肽
64.3
表1结果可以看出，实施例1-3对自由基DPPH的清除率明显高于市售抗氧化肽，说明水溶性大麻二酚对自由基DPPH有较好的清除能力，表明本发明火麻仁抗氧化肽具有较好的抗氧化效果。
、稳定性试验
高温、低温实验：将实施例1-3制备的火麻仁抗氧化肽密封包装后，置于烘箱（40±1℃）、室温（25±1℃）、冰箱（4±1℃）中60天，分别观察其外观颜色、性状以及是否有霉变现象。结果显示，在高温、常温、低温环境下，该火麻仁抗氧化肽颜色均未改变，也无杂质沉淀、无霉变絮凝现象，性状保持稳定。
以上实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于未特别注明的工艺参数或条件，可参照常规技术进行。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。
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