具体实施方式

本发明的前述概要并不意图描述本发明公开的各个实施方式或全部方案。

本发明的后述说明更具体地例示了实例的实施方式。

在本说明书的多处通过例示提供指引，并且该例示可以在各种各样的组合中使用。

针对各个情况，例示的组可以起到非排他性和代表性的组的作用。

本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接通过引用的方式并入本说明书中。

术语

本说明书中的标记和简称只要没有特别限定，则可以按照本说明书的上下文，理解为在本发明所属技术领域中通常使用的含义。

本说明书中，语句“含有”意图包括语句“本质上由……组成”、和语句“由……组成”而使用。

只要没有特别限定，则本说明书中记载的步骤、处理或操作可以在室温下实施。

本说明书中，室温可以是指10～40℃的范围内的温度。

本说明书中，标记“C_n-m”(在此，n和m各自是数)如本领域技术人员通常理解那样，表示碳原子数为n以上且m以下。

本说明书中，卤素原子的例子包括氟、氯、溴和碘。

本说明书中，烷基的例子包括直链状或支链状C_1-20烷基[例如：甲基、乙基、丙基(正丙基、异丙基)、丁基(正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基)、戊基、己基、庚基、辛基、2-乙基己基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基和十八烷基]。

本说明书中，环烷基的例子包括C_3-10环烷基[例如：环戊基和环己基]。

本说明书中，芳基的例子包括C_6-10芳基[例如：苯基和萘基]。

本说明书中，芳烷基的例子包括C_6-10芳基-直链状或支链状C_1-10烷基[例如：苯甲基和苯乙基]。

本说明书中，烷氧基的例子包括直链状或支链状C_1-10烷氧基[例如：甲氧基、乙氧基和丙氧基]。

本说明书中，烷氧基烷氧基的例子包括直链状或支链状C_1-20烷氧基-直链状或支链状C_1-4烷氧基[例如：甲氧基甲氧基、甲氧基乙氧基、乙氧基乙氧基、十六烷基氧基丙氧基和十八烷基氧基乙氧基]。

本说明书中，酰氧基的例子包括直链状或支链状C_1-10烷基羰基氧基[例如：甲基羰基氧基、乙基羰基氧基和丙基羰基氧基]。

前述烷基、环烷基、芳基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、酰氧基和类固醇基各自可具有的取代基的例子包括卤素和有机基团，且

其适合的例子包括氟、氯、溴、烷氧基、烷基羰基氧基、烷基羰基硫基、烷基氧基羰基和烷基二硫基，且

其更适合的例子包括卤素、直链状或支链状C_1-20烷基氧基、直链状或支链状C_1-10烷基羰基氧基、直链状或支链状C_1-10烷基羰基硫基、直链状或支链状C_1-10烷基氧基羰基、和直链状或支链状C_1-10烷基二硫基。

抗乙型肝炎病毒剂

本发明中“抗乙型肝炎病毒剂”是指延迟或抑制乙型肝炎病毒的增殖的药剂。

前述乙型肝炎病毒可以是对现有的抗乙型肝炎病毒剂(例如：恩替卡韦、替诺福韦、阿德福韦二匹伏酯)具有耐性的病毒株。

对抗乙型肝炎病毒剂“具有耐性的病毒株”是指通过该抗乙型肝炎病毒剂不表现通常的病毒株表现出的增殖延迟或增殖抑制的效果的病毒株、或其效果表现的程度与通常的病毒株相比更低的病毒株。

本发明的一个实施方式的抗乙型肝炎病毒剂是含有2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷[别名:(2R,3R,4S,5R)-5-(6-氨基-2-氟-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羟基甲基)四氢呋喃-3-醇]或其前药、或它们的药学可接受的盐、或者它们的溶剂化物作为有效成分的抗乙型肝炎病毒剂。

＜2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷＞

2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷的制造方法没有特别限定，例如可以是包括下述步骤的方法:

步骤A：使下述式(I)：

【化2】

(式中，Q¹和Q²相同或不同，是羟基的保护基，X是溴或碘。)

所示的化合物与2-氟腺嘌呤反应；和

步骤B：将通过前述反应而得到的产物的羟基的保护基脱保护。

[步骤A]

式(I)中，只要Q¹和Q²各自是能够保护羟基的官能团，就没有特别限制，且其例子包括醚型保护基(例如：叔丁基、苯甲基、三苯甲基)、缩醛型保护基(例如：四氢吡喃基)、酰基型保护基(例如：乙酰基、苯甲酰基)和甲硅烷基醚型保护基(例如：叔丁基二甲基硅基等)。

关于式(I)所示的化合物和2-氟腺嘌呤的各自的使用量，只要反应能够进行，就没有特别限定，式(I)所示的化合物和2-氟腺嘌呤的摩尔比可以为例如1:1～1:5的范围内。

步骤A的反应通常在碱的存在下进行。该碱优选为非亲核碱，其例子包括金属烷醇盐(例如：叔丁醇钠和叔丁醇钾)。

步骤A的反应通常在溶剂中进行。

该溶剂的例子包括

卤素系溶剂(例如：二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷)、

醇系溶剂(例如：乙醇、丙醇、丁醇、戊醇)、

腈系溶剂(例如：乙腈)、和

它们的混合溶剂。

关于步骤A的反应温度，只要反应能够进行，就没有特别限定，可以为例如15～80℃的范围内的温度。

作为步骤A的反应时间，可采用能够充分得到目标物的时间，并且能够实施直至反应结束。

[步骤B]

对通过步骤A的反应得到的产物的羟基的保护基进行脱保护的方法和条件可以根据保护基的种类而适当选择，例如如果是苯甲酰基，则可以通过与金属烷醇盐(甲醇钠等)的反应等来脱保护。

关于步骤B的反应温度，只要反应能够进行，就没有特别限定，可以为例如15～80℃的范围内的温度。

作为步骤B的反应时间，可采用能够充分得到目标物的时间，并且能够实施直至反应结束。

通过步骤A和B的反应得到的产物，根据需要，可以通过过滤、柱色谱等手段进行精制。

式(I)所示的化合物的制造方法没有特别限定，可以是例如包括下述步骤的方法：

使下述式(II)：

【化3】

(式中，Q¹和Q²各自与前述为相同含义，且Q³为羟基的保护基)

所示的化合物与溴化氢或碘化氢反应。

关于式(II)所示的化合物、以及溴化氢或碘化氢的各自的使用量，只要反应能够进行就没有特别限定，式(II)所示的化合物与溴化氢或碘化氢的摩尔比例如为1:1～1:5的范围内。

式(II)所示的化合物与溴化氢或碘化氢的反应通常在溶剂中进行。

该溶剂的例子包括卤素系溶剂(例如：二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷)、羧酸系溶剂(例如：乙酸)、以及它们的混合溶剂。

对于反应温度，只要反应能够进行，就没有特别限定，可以为例如15～30℃的范围内的温度。

＜前药＞

关于2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷的前药，只要是能够在生物体内转化为其活性代谢物或2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷的物质，就没有特别限制，可以任意使用用作核酸类似物的前药的物质。

该前药的代表例包括酯和酯酰胺。

前述酯的例子包括磷酸酯。其适合的例子包括：

下述式所示的磷酸单酯：

【化4】

(式中，R¹和R²相同或不同，为氢原子、可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的环烷基、可具有1个以上的取代基的芳基、或可具有1个以上的取代基的芳烷基；或者彼此键合而与该结构式中的构成磷酸酯部分的磷原子和氧原子一起形成环)、和

下述式所示的磷酸二酯或三酯：

【化5】

(式中，

R³和每次出现时的R⁴相同或不同，为氢原子、可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的环烷基、可具有1个以上的取代基的芳基、或可具有1个以上的取代基的芳烷基，

R⁵为可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的烷氧基、可具有1个以上的取代基的烷氧基烷氧基、可具有1个以上的取代基的酰氧基、或可具有1个以上的取代基的类固醇基(含有环五菲或氢化环五菲的基团)，且

n为1或2。)。

R¹优选为可具有1个以上的取代基的烷基，进一步优选为可具有选自烷氧基、烷基羰基氧基、烷基羰基硫基和烷基二硫基中的取代基的烷基。

R²优选为氢原子、可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的芳基、或可具有1个以上的取代基的芳烷基，进一步优选为氢原子、烷基、芳基、或芳烷基。

R¹和R²彼此键合而与构成磷酸酯部分的磷原子和氧原子一起形成的前述环可以是单环或稠合环。

前述环的构成原子数例如为6～10的范围内的整数。

前述环的具体例包括下述式：

【化6】

所示的环。

前述环可具有1个以上的取代基。该取代基的例子包括卤素、烷基、环烷基、芳基和芳烷基。

R³和R⁴优选为氢原子、可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的芳基、或可具有1个以上的取代基的芳烷基，进一步优选为氢原子、烷基、芳基、或芳烷基。

R⁵优选为烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、酰氧基、或类固醇基。

前述酯酰胺的具体例包括例如磷酸酯酰胺。其适合的例子包括下述式所示的化合物：

【化7】

(式中，

R⁸为-NR^8aR^8b、或-OR^8c，且

R⁶、R⁷、R^8a、R^8b和R^8c相同或不同，为氢原子、可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的环烷基、可具有1个以上的取代基的芳基、或可具有1个以上的取代基的芳烷基。)。

R⁶和R^8a优选为可具有1个以上的取代基的烷基，进一步优选为可具有选自卤素和烷基氧基羰基中的取代基的烷基。

R⁷和R^8b优选为氢原子、或可具有1个以上的取代基的烷基，进一步优选为氢原子或烷基。

R^8c优选为氢原子、可具有1个以上的取代基的烷基、可具有1个以上的取代基的芳基、可具有1个以上的取代基的芳基、可具有1个以上的取代基的芳烷基，进一步优选为氢原子、烷基、芳基、或芳烷基。

所述前药的进一步适合的例子包括下述式所示的化合物。

【化8】

(式中，

R^1a、R^6a和R^8d分别为烷基，

R^1b为卤素或烷基，

R²和R⁷与前述为相同含义，

Ar为芳基，

Nu为下述式：

【化9】

所示的基团，

m1为1～18的范围内的整数，且

m2为1～10的范围内的整数)

关于所述前药的制造，根据其化学结构，可以参照公知的方法(例如ChemicalReviews 2014,114,9154-9218所述的方法)，基于技术常识而实施。

＜盐＞

2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷或其前药的药学可接受的盐的例子包括

(1)与无机酸[例如：盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、焦硫酸和偏磷酸等]的盐；和

(2)与有机酸[例如：柠檬酸、苯甲酸、乙酸、丙酸、富马酸、马来酸和磺酸(例如：甲磺酸、对甲苯磺酸和萘磺酸)]的盐；以及

(3)碱金属盐[例如：钠盐和钾盐]。

＜溶剂化物＞

2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷或其前药、或它们的药学可接受的盐的溶剂化物的例子包括水合物和有机溶剂化物(例如：甲醇化物、乙醇化物、二甲基亚砜化物等)。

＜其他活性成分＞

抗乙型肝炎病毒剂可以进一步含有其他活性成分。

该“其他活性成分”的例子包括其他核酸类似物(2'-脱氧-2'-氟-核苷等)和其他抗乙型肝炎病毒剂。

抗乙型肝炎病毒剂可以含有2种以上的制剂。

2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷或其前药、或它们的药学可接受的盐、或者它们的溶剂化物可以与该“其他活性成分”各自制剂化为单独的制剂。

2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷或其前药、或它们的药学可接受的盐、或者它们的溶剂化物可以与该“其他活性成分”同时、依次、或交替地向对象给药。

＜有效成分的含量＞

有效成分的含量的下限值从活性的观点出发，相对于抗乙型肝炎病毒剂的总质量，可以设定为例如0.001质量％、优选为0.01质量％、更优选为0.05质量％。有效成分的含量的上限值没有特别限定，相对于抗乙型肝炎病毒剂的总质量，可以设定为例如99.99质量％、优选为90质量％、更优选为80质量％。有效成分的含量在任意选择前述下限值和上限值而得到的范围内，可以为例如0.001～99.99质量％、优选为0.01～90质量％、更优选为0.05～80质量％的范围内。

＜添加剂＞

抗乙型肝炎病毒剂可以含有药学可接受的添加剂。

抗乙型肝炎病毒剂的形态的例子包括固体制剂(例如：颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、干糖浆剂)、半固体制剂(例如：霜剂、软膏剂、凝胶剂)和液体制剂(例如：溶液剂、混悬剂)。

所述固体制剂可以例如通过将有效成分和添加剂(例如：赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂)混合，并根据期望进行造粒、整粒、压缩和/或包衣而制造。

所述赋形剂的例子包括乳糖、乳糖水合物、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、结晶纤维素、淀粉(例如：玉米淀粉)、水合二氧化硅、以及它们的组合。

所述结合剂的例子包括琼脂、阿拉伯胶、透明质酸、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、以及它们的组合。

所述崩解剂的例子包括海藻酸、羧甲基纤维素(羧甲纤维素)、交联羧甲基纤维素钠、低取代度羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮(聚维酮)、交联聚维酮、以及它们的组合。

所述润滑剂的例子包括硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、以及它们的组合。

所述着色剂的例子包括三氧化二铁、氧化钛、以及它们的组合。所述半固体制剂例如可以通过将有效成分、半固体载体和根据期望的其他添加剂混合而制造。

所述液体制剂例如可以通过将有效成分、液状载体[例如：水性载体(例如：精制水)、油性载体]和根据期望的其他添加剂(例如：乳化剂、分散剂、混悬剂、缓冲剂、抗氧化剂、表面活性剂、渗透压调节剂、螯合剂、抗菌剂)混合、并根据需要进行灭菌而制造。

＜给药的形态＞

抗乙型肝炎病毒剂的给药方法可以是经口给药或非经口给药(例如：静脉给药、肌肉给药、皮下给药)。

抗乙型肝炎病毒剂的给药方法可以是局部给药。

抗乙型肝炎病毒剂的给药对象可以是人、非人哺乳动物(例如：猴子、绵羊、狗、小鼠、大鼠)和非哺乳动物中任一者。

抗乙型肝炎病毒剂的给药次数可以根据给药对象的年龄、体重、病况等而适当选择，可以为例如1天1次、2次、或3次；2天1次、3天1次、4天1次、5天1次、6天1次、或1周1次。

抗乙型肝炎病毒剂的1次的给药量根据给药对象和给药次数等，可以为0.1mg～1000mg的范围内。

抗乙型肝炎病毒剂的适合的例子是经口给药制剂，其具体例包括：

包含有效成分、结晶纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚维酮、硬脂酸镁和氧化钛的片剂；和

在硬明胶胶囊中包含有效成分、聚维酮和硬脂酸镁的胶囊剂。

乙型肝炎病毒相关疾病的预防或治疗剂

“乙型肝炎病毒相关疾病”是指因乙型肝炎病毒的感染而发病的疾病。乙型肝炎病毒相关疾病可以是例如选自乙型肝炎(例如：急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎)、乙肝肝硬化和乙肝肝癌中的1种以上。

本发明的一个实施方式的乙型肝炎病毒相关疾病的预防或治疗剂含有2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷或其前药、或它们的药学可接受的盐、或者它们的溶剂化物作为有效成分。

所述预防或治疗剂中含有的其他活性成分和添加剂、以及所述预防或治疗剂的剂形、给药的形态(例如：给药途径、给药对象、给药次数和给药量)可以从例如针对前述抗乙型肝炎病毒剂中描述的内容中进行选择。

延迟或抑制乙型肝炎病毒的增殖的方法、或者预防或治疗乙型肝炎病毒相关疾病 的方法

本发明的一个实施方式的延迟或抑制乙型肝炎病毒的增殖的方法、或者预防或治疗乙型肝炎病毒相关疾病的方法，包括对需要其的对象给药2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷或其前药、或它们的药学可接受的盐、或者它们的溶剂化物的步骤。

其给药的形态(例如：给药途径、给药对象、给药次数和给药量)可以从例如针对前述抗乙型肝炎病毒剂中描述的内容中进行选择。

实施例

以下，通过实施例，进一步详细说明本发明的一个实施方式，但本发明不限于此。

实施例1(合成例)

(1)

使2-脱氧-2-氟-1,3,5-三-O-苯甲酰基-α-D-阿拉伯呋喃糖2g溶解于二氯甲烷20mL中，添加溴化氢乙酸溶液(5.1mol/L)4mL，搅拌。反应结束后，添加饱和碳酸氢钠水溶液，将未反应的HBr中和。

其后，分液，将用二氯甲烷萃取得到的溶液浓缩，得到1.7g的1-溴-2-脱氧-2-氟-3,5-二-O-苯甲酰基-α-D-阿拉伯呋喃糖的粗品。将其用于下述步骤。

(2)与2-氟腺嘌呤的反应

使2-氟腺嘌呤1g分散于叔戊醇:乙腈的共溶剂中。

向其中添加叔丁醇钾，升温至50℃，搅拌一会使其溶解。

向其中滴加溶解于乙腈中的1-溴-2-脱氧-2-氟-3,5-二-O-苯甲酰基-α-D-阿拉伯呋喃糖粗品1.7g，使其反应。

反应结束后，用二氯乙烷稀释并过滤固体成分后，将滤液浓缩，并通过柱色谱精制。

得到反应产物(2'-脱氧-2'-氟-3',5'-二-O-苯甲酰基-β-2-氟-D-腺苷)200mg。

(3)脱保护

使2'-脱氧-2'-氟-3',5'-二-O-苯甲酰基-β-2-氟-D-腺苷100mg溶解于甲醇中，添加甲醇钠10mg，搅拌。

反应结束后，将反应产物用制备型TLC精制，得到60mg的2'-脱氧-2'-氟-β-2-氟-D-腺苷(下述式)。

【化10】

¹H NMR(400MHz,丙酮-D6)δ8.14-8.19(m,1H),7.08(br,2H),6.36(dd,J＝15.3,4.3Hz,1H),5.14-5.29(m,2H),4.61-4.68(m,1H),4.29(br,1H)3.71-3.99(m,3H)

比较例1(合成例)

实施例1的步骤(2)中，使用2,6-二氯嘌呤代替2-氟腺嘌呤，除此之外，以与实施例1同样操作，得到2,6-二氯-9-((2R,3S,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤(下述式)。

【化11】

¹H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.53(s,1H),6.41(dd,J＝12.3,4.6Hz,1H),5.97(s,1H),5.25(dt,J＝52.8,4.6Hz,1H),5.09(t,J＝5.5Hz,1H),4.38-4.43(m,1H),3.81-3.91(m,1H),3.58-3.68(m,2H)

试验例1(抗HBV活性)

抗HBV活性的评价中，使用向人肝癌细胞株HepG2中导入了HBV基因组的2倍长度的基因的HBV产生细胞、即HepG2.2.15细胞株，通过定量PCR法评价药剂添加后第7天的细胞内HBV DNA量。HBV DNA的PCR中，使用正向引物(HBV-S190F；5'-GCT CGT GTT ACA GGC GGG-3’：SEQ ID No:1)和反向引物(HBV-S703R；5'-GAA CCA CTG AAC AAA TGG CAC TAG TA-3'：SEQ ID No:2)。PCR以95℃、10秒至62℃、10秒至72℃、30秒作为1个反应，实施35个循环。

具体而言，将HepG2.2.15细胞以达到1×10⁵个细胞/孔的方式进行接种。24小时后，将实施例1和比较例1的化合物稀释到0、0.49、0.97、1.95、3.90、7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000nM，添加至前述细胞中。将前述细胞培养7天后，回收细胞质级分，用苯酚·氯仿萃取，对DNA进行精制。使用精制的DNA 20ng，通过定量PCR法测定细胞内HBV DNA量。

试验例2(HBs抗原量)

HBs抗原量使用向人肝癌细胞株HepG2中导入了HBV基因组的2倍长度的基因的HBV产生细胞、即HepG2.2.15细胞株，通过CLIA法(chemiluminescent immunoassay：化学发光免疫测定法)测定添加药剂后第4天的培养上清液。

试验例3(细胞毒性试验)

将HepG2 NTCP-myc细胞以达到2x10⁴个细胞/孔的方式接种。24小时后，将药剂稀释到0、0.49、0.97、1.95、3.90、7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000nM，添加至前述细胞中。将HepG2 NTCP-myc细胞培养7天。培养后，添加Premix WST-1Cell ProliferationAssay System(TaKaRa)10μl，在37℃下培养2小时后，在450nm下使用微盘分析仪测定吸光度。

试验例1～3的结果

1.抗HBV活性

EC₅₀(50％有效浓度)根据示出化合物的浓度与抗HBV活性的关系的图算出。

【表1】

根据表1可知，实施例1的化合物与比较例1的化合物相比，具有显著更高的抗HBV活性。

2.HBs抗原量

HBs抗原量的测定结果示于图2。根据图2可知，实施例1的化合物与现有的抗乙型肝炎病毒剂(恩替卡韦和富马酸替诺福韦二吡呋酯)相比，HBs抗原量显著减少。

3.细胞毒性

CC₅₀(50％细胞毒性浓度)根据示出化合物的浓度与细胞毒性的关系的图算出。

【表2】

根据表2可知，实施例1的化合物的细胞毒性低。

4.SI值(选择性指数)

SI值是作为药品的利用可能性的指标，其通过将细胞毒性浓度(CC₅₀)除以有效浓度(EC₅₀)而算出。即，SI＝CC₅₀/EC₅₀。

【表3】

根据表3可知，实施例1的化合物的SI值大(作为药品的利用可能性高)。

序列表

<110> 大金工业株式会社（DAIKIN INDUSTRIES, LTD.）

国立大学法人鹿儿岛大学（KAGOSHIMA UNIVERSITY）

<120> 抗乙型肝炎病毒剂

<130> FP210329JP（P19-189WO）

<150> JP 2018-189216

<151> 2018-10-04

<150> JP 2019-078616

<151> 2019-04-17

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

gctcgtgtta caggcggg 18

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gaaccactga acaaatggca ctagta 26