用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法
阅读说明：本技术 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法 (Nucleic acid extraction method of microbial feed additive for high-throughput sequencing ) 是由 饶正华 李明 孟庆石 冯潇慧 刘娜 焦京琳 谢秀兰 于 2021-02-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业技术领域,具体涉及用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。本发明用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法,包括以下步骤：取样品后进行清洗；裂解样品中的微生物；去除样品中的RNA；去除样品中的蛋白质；吸附DNA,进行清洗。本发明方法提取微生物饲料添加剂得到的核酸纯度高、完整度高,可用于后续的高通量测序分析。(The invention belongs to the technical field of agriculture, and particularly relates to a nucleic acid extraction method of a microbial feed additive for high-throughput sequencing. The invention relates to a nucleic acid extraction method of a microbial feed additive for high-throughput sequencing, which comprises the following steps: cleaning the sample; lysing the microorganisms in the sample; removing RNA from the sample; removing proteins from the sample; DNA was adsorbed and washed. The nucleic acid obtained by extracting the microbial feed additive by the method has high purity and high integrity, and can be used for subsequent high-throughput sequencing analysis.)
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。
背景技术
在全面禁止使用抗生素的背景下，我国药物饲料添加剂将在2020年全部退出，微生物饲料添加剂是抗生素的最佳替代品。然而，微生物饲料添加剂产品普遍存在如下安全问题：(1)产品中功能菌比例不高，含有杂菌、甚至致病菌；(2)菌种(甚至是菌属)标识错误；(3)功能菌含有耐药基因；(4)功能菌含有毒力基因；(5)功能菌在生产过程中发生突变、退化，失去原有功效。
现有技术评估微生物饲料添加剂安全性方法尚未成熟，传统的检测手段存在劳动量大、效率低、准确度差、通量不高等缺点。因此，建立轻松、高效、精准、高通的评估方法，迫在眉睫。
高通量测序作为新一代测序技术，能够有效评估上述微生物饲料添加剂产品的安全问题，从而为微生物饲料添加剂市场的规范和管理提供保障。然而，由于微生物饲料添加剂的组成成分比较复杂，其中包括大量的宿主DNA、蛋白质、多糖、脂质、无机盐等，建立高通量测序方法首先面临的棘手问题是饲料中微生物核酸的提取。
现有的核酸提取方法主要是针对土壤、动物、植物、微生物等样品建立的通用方法。面对微生物饲料添加剂这种复杂基质无法获得纯度高、完整度高的核酸，不能满足后续的高通量测序的建库要求。现有技术所使用的微生物饲料添加剂的核酸提取方法多为进口试剂盒，而试剂盒提取的效果差，样品无法进行测序分析，限制了微生物饲料添加剂安全性的评估，大大阻碍了该市场的管理和行业发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法。
根据本发明
具体实施方式
的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，包括以下步骤：
(1)取样品，用TE缓冲液清洗样品；
(2)裂解样品中的微生物；
(3)向步骤(2)所得的样品中加入核糖核酸酶，去除样品中的RNA；
(4)向步骤(3)所得的样品中加入蛋白酶，去除样品中的蛋白质；
(5)向步骤(4)所得样品中加入磁珠混合液，吸附细菌DNA，其中，磁珠混合液包括磁珠和PEG，磁珠和PEG的体积比为1：1～4。
(6)清洗步骤(5)所得的DNA。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(1)中，用10×TE缓冲液清洗样品。
其中，TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，10×TE缓冲液为TE缓冲液的10倍浓度液，试剂组成为Tris-HCl(100mM)，EDTA(10mM)，pH8.0。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(2)中，向步骤(1)所得样品中加入生理盐水，震荡悬起沉淀，再加入40～60mg/mL溶菌酶混匀，37℃反应0.5～4.5h后，离心，取上清液。
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(2)中，向收集的菌体中加入锆珠及裂解液，裂解样品中的微生物，样品与裂解液的体积比为1：3～7，所述裂解液的组成为包括1～5％SDS、0.5～10×TE缓冲液及0.3～3MNaCl，裂解液的pH为7.0～9.0。
量取锆珠的体积与样品体积相等，锆珠的终浓度为0.1g/mL-0.85g/mL。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(2)中加入裂解液后，进行研磨震荡，在65～75℃条件下裂解5～200min，离心，取上清液。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(3)中，向步骤(2)所得样品中加入1～5mg/mL核糖核酸酶，在36.5～37.5℃条件下孵育5分钟-12小时。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(4)中，向步骤(3)所得样品中加入1～5mg/mL蛋白酶K，在65～75℃条件下孵育5分钟-2小时。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(5)中，磁珠的终浓度为0.5～5mg/mL。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(6)中，依次使用70％乙醇、水进行清洗和洗脱。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(6)中，吸附得到的DNA中加入70％乙醇，清洗后，使用纯水，震荡悬浮磁珠，70℃孵育后，离心，磁吸附，即得。
根据本发明具体实施方式的用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法，步骤(1)中，使用PCR管量取样品。
本发明的有益效果：
本发明的提取方法，使用TE缓冲液清洗微生物饲料添加剂样品中的游离DNA和杂质，使终产物的产量增加，并降低宿主DNA的污染；本发明的提取方法中核糖核酸酶和蛋白酶的使用量均较大，不但可以省去核酸沉淀、核酸洗涤等传统步骤，节约操作时间，而且能够得到更为纯净的总DNA；本发明的提取方法分别使用PCR管量取样品和磁珠，不但操作简单，而且称取量固定。
本发明方法提取得到的核酸纯度高、完整度高；可用于后续的高通量测序分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明方法DNA提取效果与市售试剂盒提取DNA的效果对比情况；
图2为不同样品中所含的耐药基因种类和个数情况；
图3为不同样品中所含的毒力基因种类和个数情况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1提取饲料添加剂中的微生物核酸
1、PCR管取样品200μL，加入2mL管中；
2、向步骤(1)所得样品中加1mL 10xTE，研磨器震荡1min，对菌体进行清洗2次；向菌体中加入生理盐水，震荡悬起沉淀，再加入50mg/mL溶菌酶母液混匀，37℃反应1h后，离心，弃清液，收集菌体；
3、PCR管取锆珠200μL，加入样品中，再加入1mL裂解液，研磨器震荡3min；
4、70℃裂解15min，期间每隔5min颠倒6次；
5、13000g 4℃离心15min；
6、取上清到新的1.5mL管中，加入40μL RNase A 37℃孵育15min；
7、加入40μL蛋白酶K，70℃孵育10min，70℃孵育10min；
8、加入磁珠混合液(磁珠与40％PEG按照体积比为1:2混合)300μL，颠倒混匀后静置3-5min；
9、用磁力架磁吸附2-5min，倒掉液体；
10、加入70％乙醇700微升1mL，颠倒几次进行清洗，磁吸附1min，倒掉液体，清洗两次；
11、通风橱干燥4min；
12、加入100μL纯水，震荡悬浮磁珠，70℃孵育5min；
13、微离心后磁吸附1-3min，将液体转移到新的1.5mL管中。
上述方法中，
10x TE(pH 8.0)配制方法：200ML 500mM的Tris-HCl(pH 8.0)、100ML0.1M的EDTA(pH 8.0)，定容至1L。
裂解液的配制方法为：取1.2g SDS、4mL 10xTE、4mL 5M NaCl加入纯水32mL，即得。
加入RNase的终浓度为1～5mg/mL，可选浓度包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，样品中加入RNase后，可在36.5、37或37.5℃条件下孵育5、10或15min,最多孵育12小时。
加入蛋白酶K的终浓度为1～5mg/mL，可选浓度包括1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL，样品中加入蛋白酶K后，可在65、70或75℃条件下孵育5、10或15min，最多孵育2小时。
磁珠和PEG的体积比为1:1～4，磁珠与PEG的体积比可选1:1、1:2、1:3或1:4，PEG的浓度可选为30％、35％、40％、45％或50％。
磁珠的终浓度为0.5～5mg/mL，磁珠的终浓度优选为0.5mg/mL、1mg/mL或1.5mg/mL,最多5mg/mL。
溶菌酶的浓度为40～60mg/mL，溶菌酶的终浓度优选为40mg/mL、40.5mg/mL、41mg/mL、41.5mg/mL、42mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL或60mg/mL。
实施例2
2.1对比本发明方法与现有试剂盒的效果
利用本发明实施例1的方法提取市售乳酸菌微生物饲料添加剂样本中的DNA，提取结果与DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit(QIAGEN)和FASTDNA TM Spin Kit for soil(MPbio)两款国外核酸提取试剂盒的比较。
结果如图1所示，相比Qiagen和MP核酸提取试剂盒，本发明方法提取的DNA，在大于2000bp的区域，均有明显的条带，说明本发明方法提取的核酸完整、纯净，适合用于高通量检测中DNA文库的构建。
2.2本发明方法提取DNA用于高通量检测
为了验证方法的可靠性，本发明选取了市场上19个微生物饲料添加剂产品的分装样品，分别对每个样品进行了菌成分分析、耐药基因分析和毒力基因分析。
使用试剂盒DNA Library Prep Kit V2对提取的总DNA进行建库，大致过程如下。
1、室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用。确认5×TS是否处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，37℃加热并涡旋振荡混匀，沉淀即可溶解。
2、在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
3、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
4、将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：
5、片段化产物使用VAHTS DNA Clean Beads进行纯化
①涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取50μL至50μL片段化产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
②将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
③保持反应管始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
④重复步骤③，总计漂洗两次。
⑤保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。
⑥将反应管从磁力架上取出，加入26μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
⑦将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取24μL上清至新的灭菌PCR管中。
6、将PCR管置于冰上，配制如下反应体系：
试剂盒货号
TD501
TD502/TD503
ddH<sub>2</sub>O
------
4μL
步骤09-1产物
24μL
25μL
5×TAB
10μL
10μL
PPM
5μL
------
N5XX*
5μL
5μL
N7XX*
5μL
5μL
TAE
1μL
1μL
7、使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管置于PCR仪中，运行如下反应程序：
8、涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取30.0μL体积至50μL PCR产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
9、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠。
10、涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads并吸取7.5μL体积至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
11、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
12、保持反应管始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清。
13、重复步骤5，总计漂洗两次。
14、保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。
15、将反应管从磁力架上取出，加入22μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
16、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μL上清至新的灭菌PCR管中，-20℃保存。
通过高通量分析，19个微生物饲料添加剂产品的分装样品的菌成分分析结果见表1：
表1 19个微生物饲料添加剂的菌成分分析结果
如表1所示，本发明的核酸提取方法得到的DNA完整、纯净可以用于高通量检测，不但可以获得功能菌的含量，对于添加剂中的含量较少的杂菌也检出。
2.3分析微生物饲料添加剂产品中耐药基因
在实施例2.2对19个样品进行了菌成分分析的基础上，进一步进行样品中耐药基因的检测，具体步骤如下：
(1)过滤数据：利用fastp或Soapnuke对数据进行过滤，删除N碱基含量超过10％或Q值小于5的碱基超过50％的序列。
(2)序列拼接：利用megahit对过滤后的数据进行序列拼接；
(3)耐药基因的分析：利用abricate程序和CARD或Resfinder数据库分析组装后数据中的毒力基因。
毒力分析结果见表2：
表2不同样品中所含的抗性基因种类和个数
如图2所示，实施例2.2中所有样品包含的全部耐药基因共有16大类，分别为Aminocoumarins(氨基香豆素类)、Aminoglycosides(氨基糖苷类)、Bacitracin(杆菌肽)、betalactams(β内酰胺类)、Cationic antimicrobial peptides(阳离子抗菌肽类)、Elfamycins、Fluoroquinolones(氟喹诺酮类)、Fosfomycin(磷霉素)、Lipopeptides(脂肽类)、MLS、Multi-drug resistance(多药抗性)、Phenicol(苯丙醇)、Rifampin(利福平)、Sulfonamides(磺胺类)、Tetracyclines(四环素类)、Tunicamycin(衣霉素)。
样品1和样品9含有的耐药性基因较多，数目分别为46和57，说明安全性很差。而样品10和样品16并未检出任何耐药基因，说明安全性较好。利用本发明方法提取微生物饲料添加中的DNA后，利用高通量测序技术进行分析，可有效评价不同样品中耐药基因的风险性，而且区分度好，克服了传统方法工作量大、通量和效率不高等缺点。
2.4分析微生物饲料添加剂产品中毒力基因
在实施例2.2对19个样品进行了菌成分分析的基础上，进一步进行样品中毒力基因的检测，具体步骤如下：
(1)数据的过滤：利用fastp或Soapnuke对数据进行过滤，删除N碱基含量超过10％或Q值小于5的碱基超过50％的序列；
(2)序列拼接：利用megahit对过滤后的数据进行序列拼接；
(3)毒力基因的分析：利用abricate程序和VFDB数据库分析组装后数据中的毒力基因。
如图3所示，不同样品包含毒力基因总数目差异很大，如样品18和样品19，所含的毒力基因均在150以上，说明其对应的产品安全性很差，而样品10和11并未检出任何毒力基因，说明安全性较好。
因此，利用本发明方法提取微生物饲料添加中的DNA后，再利用高通量测序技术进行分析，可有效评价不同样品中毒力基因的风险性，而且区分度好，克服了传统方法工作量大、通量和效率不高等缺点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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