一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法
阅读说明：本技术 一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法 (Partial pressure filling method of high-efficiency sodium upgrading liquid chromatography column ) 是由 万建 汪兵 万翠红 李兵 周权 熊国梅 阮君 龚思颖 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法,解决了钠升级色谱柱价格昂贵,色谱柱的填充效率较低的问题。其包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；b)采用拉针仪将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um,拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；c)色谱柱填充；d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理；e)色谱柱组装,将聚酰亚胺石英毛细管色谱柱与四通阀完成组装；f)填充液置换,利用钠升级液相色谱,将填充色谱柱的甲醇利用流动相进行置换后置于洁净干燥处保存。本发明填充钠升级色谱柱的成本在80元-150元之间,极大程度上降低了成本,且分离效率较高。(A partial pressure filling method of a high-efficiency sodium upgrading liquid chromatographic column solves the problems of high price and low filling efficiency of the sodium upgrading liquid chromatographic column. Which comprises the following steps: a) preparing one polyimide quartz capillary tube; b) one end of the polyimide quartz capillary tube is thinned to 5um by adopting a needle drawing instrument, and the needle point of the drawn polyimide quartz capillary tube is smooth; c) filling a chromatographic column; d) processing a polyimide quartz capillary chromatographic column needle tip; e) assembling a chromatographic column, namely assembling a polyimide quartz capillary chromatographic column and a four-way valve; f) and (3) replacing the filling liquid, namely upgrading the liquid chromatography by using sodium, replacing the methanol filled in the chromatographic column by using a mobile phase, and then placing the methanol in a clean and dry place for storage. The cost of the sodium-filled upgraded chromatographic column is between 80 yuan and 150 yuan, the cost is greatly reduced, and the separation efficiency is higher.)
技术领域
本发明涉及液相色谱柱填充技术领域，尤其是涉及一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法。
背景技术
钠升级液相色谱与高分辨质谱联用是目前蛋白组学常用的技术手段。其中色谱柱的柱效是决定蛋白鉴定质量的一个关键指标。目前商业化的钠升级色谱柱技术成熟。但由于不同实验的需求以及蛋白制样技术的不同，对于色谱柱的填料以及填充方法的多样性提出了新的要求。蛋白组学实验样品群体大，色谱柱稳定性以及连续性至关重要，因此在可控范围内保证自天柱的经济性以及填充效果效率是必要的。现在市场上商品化钠升级色谱柱价格大多在8000元～12000元一根。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种高效钠升级液相色谱柱的分压填充方法，有效的解决了钠升级色谱柱柱价格昂贵，色谱柱的填充效率较低的问题。
为实现上述目的，本发明包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；
b)采用拉针仪将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um，拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；
c)色谱柱填充，1、利用甲醇混合色谱柱填料(以C18填料为例)，2、连接填充装置，将拉制好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱固定在填充装置上，3、分压填充设置：观察聚酰亚胺石英毛细管针尖悬浊液外溢状态，确保针尖正常无破损，填充开始时，设定压力值4MPa，填充在聚酰亚胺石英毛细管全柱长的1/3时，设定压力值4.2MPa，填充在全柱长的2/3时，设定压力值4.5MPa，直至填充完毕，填充完毕后，关掉氮气阀，待填充装置自动泄压后取下聚酰亚胺石英毛线管色谱柱；
d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理，利用乙腈浸泡聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖30分钟，取出浸泡好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱的针尖，用无尘纸擦洗干净；
e)色谱柱组装，将聚酰亚胺石英毛细管色谱柱与四通阀完成组装；
f)填充液置换，利用钠升级液相色谱，将填充色谱柱的甲醇利用流动相进行置换后置于洁净干燥处保存。
聚酰亚胺石英毛细管本发明填充钠升级色谱柱的成本在80元-150元之间，极大程度上降低了成本，且分离效率较高，与质谱联用时离子化效率高。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明透视镜下观察的针尖效果。
图2为本发明色谱组装示意图。
图3为本发明色谱柱柱效检测示意图
具体实施方式
下面结合附图1-3对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。
由图1-3可知，本发明包括如下步骤：a)准备聚酰亚胺石英毛细管一根；
目前常用的聚酰亚胺石英毛细管的规格为外径360um，内径有75um、100um、150um三种规格。
b)采用拉针仪将聚酰亚胺石英毛细管一端拉细至5um，拉出的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑；
如图1所示，拉制后的聚酰亚胺石英毛细管的针尖平滑，其针尖端拉细至5um左右，针尖的形状决定着液相色谱质谱联用时的离子化效率，本发明中采用的拉针仪为SUTTER公司的P-2000拉针仪。
拉针仪拉制聚酰亚胺石英毛细管采用多次循环，循环1：加热指数400℃，电压值25V，延迟时间200S；
循环2，加热指数390℃，电压值15V，延迟时间200S
循环3，加热指数390℃，电压值15V，延迟时间200S；
循环4，加热指数400℃，电压值20V，延迟时间200S；
循环5，加热知识410℃，电压值15V，延迟时间110S，拉力值240N。
拉针仪的方法设定影响拉针效果，此参数经多次试验得出，拉出的聚酰亚胺石英毛细管针尖平滑，易于填充且在液相色谱与质谱联用时离子化效率高。
c)色谱柱填充，1、利用甲醇混合色谱柱填料(以C18填料为例)，2、连接填充装置，将拉制好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱固定在填充装置上，3、分压填充设置：观察聚酰亚胺石英毛细管针尖悬浊液外溢状态，确保针尖正常无破损，填充开始时，设定压力值4MPa，填充在聚酰亚胺石英毛细管全柱长的1/3时，设定压力值4.2MPa，填充在全柱长的2/3时，设定压力值4.5MPa，直至填充完毕，填充完毕后，关掉氮气阀，待填充装置自动泄压后取下聚酰亚胺毛线管色谱柱；
填充装置为现有的技术，现在有很多的填充装置，都可以使用本方法，本申请中以C18填料为例进行说明，填充装置利用磁力搅拌器不断搅拌得到C18填料的C18甲醇混合悬浊液，高压氮气将混匀的填料甲醇悬液压入聚酰亚胺石英毛细管色谱柱，针尖可保证填料无法外泄。
d)聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖处理，利用乙腈浸泡聚酰亚胺石英毛细管色谱柱针尖30分钟，取出浸泡好的聚酰亚胺石英毛细管色谱柱的针尖，用无尘纸擦洗干净；
e)色谱柱组装，将聚酰亚胺石英毛细管色谱柱与四通阀完成组装；
色谱柱的组装如图2所示，其包括HPLC泵、自动加样器、预柱、四通阀、聚酰亚胺石英毛细管(作为分析柱)、穴通转向阀等，利用带加电端的360um四通阀完成组装，也可以用1/32英寸内径的四通阀加1/32转360um套管完成组装，
f)填充液置换，利用钠升级液相色谱，将填充色谱柱的甲醇利用流动相进行置换后置于洁净干燥处保存；
g)色谱柱柱效检测
在赛默飞Q Exactive Plus液相色谱质谱联用仪上连接填充好的聚酰亚胺石英毛细管柱。流动相：A相为含有0.1％甲酸的纯水；B相为含有10％纯水的乙腈，并加有0.1％的甲酸。流速为300nl/min，洗脱梯度见下表。色谱流出样品直接通过HESI离子源进入质谱。液相色谱进样量1ul。
色谱洗脱梯度
纳升级液相色谱分离后的多肽组分进入质谱进行检测分析。主要质谱参数：离子源电压2KV；质谱采集模式为正离子模式；一级质谱采集分子量范围350～2000m/z；分辨率70000；最大离子注入时间20ms；二级质谱采集分辨率17500；最大离子注入时间50ms；TopN设定为20；碎裂能量设定为27eV。
在开放的蛋白数据库网站Uniport(http://www.uniprot.org/)上查找人类全蛋白(BSA)的蛋白序列，并以FSATA格式进行下载[11]。导入到Proteome Discoverer 2.1 SP1软件中进行蛋白数据库检索。检索参数设定：比对多肽质量范围350Da-5000Da；信噪比(S/N)>1.5；多肽片段中氨基酸个数范围6-144；母离子误差<10PPM；多肽片段误差<0.2Da；正反数据库比对检验阈值，显著0.05，极显著0.01。
使用专业的蛋白质组学分析软件Proteome Discoverer 2.1 SP1完成蛋白质的鉴定[14]。依据button-up的策略，首先将大蛋白酶解为多肽片段，通过对多肽片段的鉴定，根据多肽片段的覆盖度完成蛋白的组装，从而完成蛋白质的鉴定[15]。首先筛选得到质量较好的质谱图42625张，通过与Uniport数据库网站中的人类全蛋白氨基酸序列比对，匹配上的质谱图22592张，鉴定到肽段序列15368条，这些肽段与数据库中的3617个蛋白序列匹配。对这些蛋白序列去除重复最终鉴定到2939个蛋白质，蛋白鉴定数量与商业化色谱柱效果相当。
本发明填充钠升级色谱柱的成本在80元-150元之间，极大程度上降低了成本，且分离效率较高，与质谱联用时离子化效率高。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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