盐酸安罗替尼在制备治疗多发性硬化药物中的用途
阅读说明：本技术 盐酸安罗替尼在制备治疗多发性硬化药物中的用途 (Application of nilotinib hydrochloride in preparation of medicine for treating multiple sclerosis ) 是由 李龙 诸浩然 尹洁 樊广跃 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了盐酸安罗替尼在制备治疗多发性硬化药物中的用途,相比于对照组,盐酸安罗替尼治疗组的EAE模型小鼠瘫痪程度明显降低；根据EAE模型的临床评分,盐酸安罗替尼能够显著抑制EAE的发生；盐酸安罗替尼对EAE模型小鼠体重无明显影响,表明在该剂量下,盐酸安罗替尼对EAE模型小鼠无毒性作用；盐酸安罗替尼能够抑制Th17细胞的体外分化。(The invention discloses an application of erlotinib hydrochloride in preparation of a drug for treating multiple sclerosis, compared with a control group, the paralysis degree of an EAE model mouse of an erlotinib hydrochloride treatment group is obviously reduced; according to the clinical score of an EAE model, the hydrochloric acid anrotinib can obviously inhibit the occurrence of EAE; the anrotinib hydrochloride has no obvious influence on the body weight of an EAE model mouse, and the result shows that the anrotinib hydrochloride has no toxic effect on the EAE model mouse under the dosage; the erlotinib hydrochloride can inhibit the in vitro differentiation of Th17 cells.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及盐酸安罗替尼在制备治疗多发性硬化药物中的用途。
背景技术
多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是中枢神经系统(Central NervousSystem，CNS)的典型炎性脱髓鞘疾病。据估计，它影响到全世界多达200万人。多发性硬化起病年龄多在20～40岁，多发于女性，男女比例接近1：3。临床上，多发性硬化表现为神经系统的功能障碍，具有复发缓解交替的特征，既可以完全康复，也可能遗留某种功能障碍，障碍可以涉及中枢神经系统的各个部分。多发性硬化是造成年轻人神经系统功能障碍的主要原因，造成了广泛的健康、心理、经济和社会影响[1-3]。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)在多个层面模拟了多发性硬化，是多发性硬化的主要动物模型，可以在多种哺乳动物中诱导出来。Th17细胞在EAE的发生发展中起了重要作用，EAE也是研究Th17细胞的模型之一。[4,5]
Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)是一种膜蛋白抗原，高表达于中枢神经系统。MOG及其肽段可以在多个小鼠品系中诱导出EAE[6]。诱导完成后10天左右进入发病高峰，表现为尾部无力、走路不稳、四肢瘫痪等，根据EAE模型的临床评分表可以评估小鼠发病的严重程度。
安罗替尼(Anlotinib)是一种新型口服酪氨酸激酶抑制剂，可靶向血管内皮生长因子受体(VEGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生性生长因子受体(PDGFR)和c-kit等，因此具有强大的抗肿瘤生长和抗血管生成的作用。安罗替尼于2018年5月在中国获批用于复发难治型非小细胞性肺腺癌(NSCLC)的三线治疗，于2019年6月获批用于腺泡状软组织肉瘤和其他多种类型的进展性软组织肉瘤(STS)的二线治疗[7]。
多发性硬化尚缺乏十分有效的治疗手段，目前的治疗多为传统的免疫抑制疗法，疾病进程长，病情反复，复发的频率和严重程度难于预测，给患者带来巨大的精神压力和经济压力。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供盐酸安罗替尼在制备治疗多发性硬化药物中的用途。
本发明的技术方案概述如下：
盐酸安罗替尼在制备治疗多发性硬化药物中的用途。
有益效果
相比于对照组，盐酸安罗替尼治疗组的EAE模型小鼠瘫痪程度明显降低。根据EAE模型的临床评分，盐酸安罗替尼能够显著抑制EAE的发生。
盐酸安罗替尼对EAE模型小鼠体重无明显影响。表明在该剂量下，盐酸安罗替尼对EAE模型小鼠无毒性作用。
盐酸安罗替尼能够抑制Th17细胞的体外分化。
附图说明
图1为盐酸安罗替尼治疗EAE模型体重变化。圆点代表用灌胃方式给予水的对照组，三角代表用灌胃方式给予盐酸安罗替尼的治疗组。(n＝6只每组；mean±SEM)
图2为盐酸安罗替尼治疗EAE模型评分变化。圆点代表用灌胃方式给予水的对照组，三角代表用灌胃方式给予盐酸安罗替尼的治疗组。(n＝6只每组；mean±SEM)
图3为盐酸安罗替尼对Th17细胞体外分化的影响。A和B为对照组和盐酸安罗替尼组代表的流式图，C为两次技术重复的柱状图。(n＝2每组；mean±SEM)(NS，无差异，*P＜0.1，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，图1图2数据分析采用双因素方差分析，图3数据分析采用t检验)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
盐酸安罗替尼结构式(I)：
诱导EAE模型：
采用将MOG35-55肽段与弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)混合免疫小鼠的方式诱导EAE。
具体操作方法：用两只连通的注射器将50μgMOG35-55肽段(溶于200μlPBS)与CFA等体积混匀，尾基部皮下注射。分别于第0天、第2天腹腔注射200ng百日咳毒素(溶于200μlPBS)。
在12只C57BL/6小鼠中诱导EAE，将造模后的小鼠随机分为对照组和盐酸安罗替尼治疗组，每组6只，考虑到盐酸安罗替尼药物在临床中多为口服片剂，本发明采用灌胃的方式在小鼠中给药，模拟口服的给药形式。盐酸安罗替尼治疗组小鼠每天定时用灌胃方式给予盐酸安罗替尼药物(6mg/kg)，对照组小鼠每天定时用灌胃方式给予水。每天依据临床评分表对每只小鼠进行评分，量取体重。
EAE模型临床评分表：
0分：未出现明显变化
1分：小鼠尾巴出现无力下垂
2分：在1分基础上新出现走路不稳、摇晃的状态
2.5分：在2分的基础上出现单侧后肢运动无力，瘫痪
3分：双侧后肢均无法正常运动
3.5分：在3分的基础上新增单侧前肢运动障碍
4分：四肢均无法正常运动
5分：濒死状态或死亡
体外分化Th17细胞：
取6-10周大的C57BL/6小鼠的淋巴结，制成单细胞悬液，分选出初始CD4+T细胞(CD4+CD25-CD44low)，种入96孔板中，板底预先包被anti-CD3抗体(5μg/ml)及anti-CD28抗体(5μg/ml)，细胞培养在添加了10％FBS和1％青链霉素混合液的RPMI1640培养基中。培养体系中加入rmIL-6(50ng/ml)、rhTGF-β(10ng/ml)、rmIL-1β(10μg/ml)、rmIL-23(10ng/ml)、Anti-IL-4(10μg/ml)、Anti-IFN-γ(10μg/ml)。安罗替尼药物(1μM)在培养后10小时加入到培养体系中。培养3天后收细胞流式分析。
流式细胞术：
分化完成后用细胞刺激剂(Cell Activation Cocktail)刺激细胞4小时，将细胞收入流式管中，PBS洗一遍，用Fc block(抗鼠CD16/32抗体)进行封闭，随后进行流式荧光抗体染色(FITC TCRβ，PE CD4)，之后用Fixable Viability Kit进行细胞固定，细胞内染色(APC IL-17A)，用流式细胞仪进行检测，流式数据用FlowJo 10进行分析，圈出IL-17A阳性细胞占CD4+T细胞的比例。
小鼠：
诱导EAE模型所用的小鼠为C57BL/6雌鼠，6周大，购自于北京斯贝福生物技术有限公司。主要试剂及实验用品：
MOG35-55肽段购自于上海强耀生物科技有限公司。CFA购自于德国默克公司。CellActivation Cocktail、APC CD44、APC/Cy7 CD25、FITC TCRβ、PE CD4、APC IL-17A、Fcblock、Fixable Viability Kit购自美国Biolegend公司，anti-CD3抗体、anti-CD28抗体、rmIL-6、rhTGF-β、rmIL-1β、rmIL-23、Anti-IL-4、Anti-IFN-γ、购自美国R&D公司。
盐酸安罗替尼对小鼠体重无明显影响。见图1。表明在该剂量下，相比于对照组，盐酸安罗替尼对小鼠无毒性作用。
根据EAE模型的临床评分，盐酸安罗替尼能够显著抑制EAE的发生。见图2。
盐酸安罗替尼能够抑制Th17细胞的体外分化。见图3。
References:
[1].Kipp,M.,et al.,Experimental in vivo and in vitro models ofmultiple sclerosis:EAE and beyond.Mult Scler Relat Disord,2012.1(1):p.15-28.
[2].Oh,J.,A.Vidal-Jordana and X.Montalban,Multiple sclerosis:clinicalaspects.Curr Opin Neurol,2018.31(6):p.752-759.
[3].Constantinescu，C.S.，et al.,Experimental autoimmuneencephalomyelitis(EAE)as a model for multiple sclerosis(MS).Br J Pharmacol，2011.164(4):p.1079-106.
[4].Morianos,I.,et al.,Activin-A limits Th17 pathogenicity andautoimmune neuroinflammation via CD39 and CD73 ectonucleotidases and Hif1-alpha-dependent pathways.Proc Natl Acad Sci U S A,2020.117(22):p.12269-12280.
[5].Zhang,S.,et al.,Reversing SKI–SMAD4-mediated suppression isessential for TH17 cell differentiation.Nature,2017.551(7678):p.105-109.
[6].Glatigny,S.and E.Bettelli,Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis(EAE)as Animal Models of Multiple Sclerosis(MS).Cold SpringHarb Perspect Med,2018.8(11).
[7].Gao,Y.,P.Liu and R.Shi,Anlotinib as a molecular targeted therapyfor tumors.Oncol Lett,2020.20(2):p.1001-1014.
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