pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系及其制备方法
阅读说明：本技术 pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系及其制备方法 (PH and alpha-amylase dual-response insulin embedding and transferring system and preparation method thereof ) 是由 管骁 陈雅琼 宋洪东 于 2021-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系及其制备方法,所述胰岛素包埋传递体系呈水凝胶状,包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔淀粉和胰岛素,所述海藻酸钠水凝胶包裹在多孔淀粉外,所述多孔淀粉中存在孔道和空腔,所述胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔淀粉的孔道和空腔内。制备方法具体包括以下步骤：(a)取多孔淀粉浆和胰岛素母液混合,使胰岛素进入到多孔淀粉的孔道和空腔内；(b)之后再加入海藻酸钠溶液,形成混合溶液；(c)取混合溶液滴加在CaCl-2溶液中发生凝胶化,得到所述胰岛素包埋传递体系。与现有技术相比,本发明的胰岛素包埋传递体系对pH和α-淀粉酶具有双响应,且操作简单,不引入有机溶剂及有毒有害化学试剂。(The invention relates to a pH and alpha-amylase dual-response insulin embedding and transferring system and a preparation method thereof, wherein the insulin embedding and transferring system is in a hydrogel shape and comprises sodium alginate hydrogel serving as a matrix, porous starch and insulin, the sodium alginate hydrogel is wrapped outside the porous starch, pore channels and cavities exist in the porous starch, and the insulin is distributed in the sodium alginate hydrogel and the pore channels and the cavities of the porous starch. The preparation method specifically comprises the following steps: (a) mixing the porous starch slurry and the insulin mother liquor to make the insulin enter into the pore canal and the cavity of the porous starch; (b) then adding a sodium alginate solution to form a mixed solution; (c) taking the mixed solutionDropwise adding into CaCl 2 And (3) gelation occurs in the solution, and the insulin embedding and transferring system is obtained. Compared with the prior art, the insulin embedding and transferring system has double response to pH and alpha-amylase, is simple to operate, and does not introduce organic solvents and toxic and harmful chemical reagents.)
技术领域
本发明属于生物医药
技术领域
，具体涉及一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系及其制备方法。背景技术
糖尿病因为其高发病率及其高继发性作用，已经成为最影响人类健康的代谢性疾病。目前，皮下注射胰岛素及其类似物是Ⅰ型糖尿病和晚期Ⅱ型糖尿病最有效的给药方式，但考虑到糖尿病的病程长及其终生性特征，长期注射给药的不便利及给病人带来的痛苦和副作用，使得患者用药的顺应性和依从性极差，从而影响治疗效果和患者的生活质量。由于胰岛素经肠道吸收进入门静脉和肝脏途径比皮下注射更能模拟胰岛素的正常生理分泌途径，因此口服给药作为典型的非侵入性给药途径，是重要的具有吸引力的开发方向。但胰岛素口服的主要障碍之一是胃中酸和胃蛋白酶环境对胰岛素的强烈破坏作用。胰岛素包封和递送系统被认为是解决该问题的有前途的方法，同时该系统可使胰岛素在肠道中可控释放。另外，胰岛素注射的定量给药或其它治疗糖尿病的口服药物的定量给药，与因食物摄入后的血糖升高速率的不匹配，会导致患者血糖的不稳定，增加了低血糖风险，这也成为口服降糖药物的障碍之一。所以，开发出安全有效的胰岛素控释传递体系是一项迫在眉睫且非常有意义的研究。
目前，环境敏感性材料由于对环境变化的快速响应和触发式释放方式，被广泛用于胰岛素的包封和递送系统的研究。公开号为CN102908627A的中国发明专利公布了一种用于口服胰岛素递送的pH敏感性纳米粒子，该pH敏感纳米粒子由pH敏感聚合物、疏水物质、内部稳定剂、外部稳定剂内容物和胰岛素组成，显示良好的pH敏感性，糖尿病大鼠口服该纳米粒子后血液葡萄糖含量显著降低，但该专利采用的包埋材料为人工合成高分子聚合物，而人工合成高分子聚合物由于其制备过程复杂、引入化学物质较多、降解性差及存在安全性方面的隐患，在口服胰岛素领域的应用被大大限制。
为克服上述合成高分子聚合物的缺陷，天然聚合物如天然多糖因其良好的生物相容性、易降解、无毒、亲水性和易于形成凝胶的特性，成为胰岛素包埋的优良材料。海藻酸钠是一种典型的多糖，分子结构中存在大量游离的羧基，这使得海藻酸钠在胃的酸性环境中收缩并在肠道的近中性环境中膨胀，这样的特性使海藻酸钠对于封装的蛋白质和多肽类药物是一种理想的天然pH敏感材料，可避免封装的蛋白质和多肽类药物在胃部恶劣环境中和肠道中被触发式释放。然而，由于疏松的网络结构，纯海藻酸钠水凝胶对低分子量和亲水性的胰岛素的包封和保护效果不能令人满意。为了克服这一缺点，近年来，由海藻酸盐和其他天然聚合物形成的复合水凝胶已成为一种有吸引力的趋势。论文(REACT FUNCT POLYM，SCI-US,2017,120,20)描述了一种用海藻酸钠和卡拉胶复合制备的口服胰岛素pH敏感水凝胶球，该水凝胶实现了在pH1.2时保护胰岛素不受胃酸环境破坏，而在pH 7.4时溶胀，实现胰岛素在肠道的渐进式释放。但该水凝胶对胰岛素的包封率较低，均低于30％，另外该水凝胶对pH的响应单一，即糖尿病患者服药后的低血糖风险这一问题依旧没有解决。
所以，仍需要进一步开发安全有效的口服胰岛素负载体系。
发明内容
本发明的目的就是提供一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系(具体为负载有胰岛素的海藻酸钠-多孔淀粉水凝胶，英文全名为insulin-loaded alginate-porous starch hydrogelbeads，下文中简称为INAS)，所述胰岛素包埋传递体系呈水凝胶状，包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔淀粉和胰岛素，所述海藻酸钠水凝胶包裹在多孔淀粉外，所述多孔淀粉中存在孔道和空腔，所述胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔淀粉的孔道和空腔内。胰岛素调节细胞对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的摄取、利用和储存，并且抑制糖原、蛋白质和脂肪的分解。
所述多孔淀粉来源于A型淀粉。
所述A型淀粉来源于玉米、蜡质玉米或大米中的一种或多种。
在胰岛素包埋传递体系中，海藻酸钠、多孔淀粉和胰岛素的质量比为(1-50):(10-1000):(0.1-10)。
所述胰岛素包埋传递体系的包埋率为80.14-93.79％。
一种如上述所述的胰岛素包埋传递体系的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(a)取多孔淀粉浆和胰岛素母液混合，使胰岛素进入到多孔淀粉的孔道和空腔内；
(b)之后再加入海藻酸钠溶液，形成混合溶液；
(c)取混合溶液滴加在CaCl2溶液中发生凝胶化，得到所述胰岛素包埋传递体系。
步骤(a)中，所述多孔淀粉采用物理法、化学法、酶解法或协同法制备得到。
步骤(a)中，所述多孔淀粉优选采用淀粉酶水解法制备得到，具体为：将淀粉加入到PBS缓冲液中以形成淀粉浆，并将α-淀粉酶与淀粉浆混合(α-淀粉酶的用量为0.5IU/毫克淀粉)，在37℃水浴中反应6小时，然后将得到的悬浮液放入试管中离心，得到的沉淀物用过量的无水乙醇重复洗涤3次，并在40℃的温度下真空干燥过夜。
步骤(a)中，所述多孔淀粉优选采用化学酸解法制备得到，具体为：将玉米淀粉加入2M HCl溶液中以形成淀粉浆，45℃下水浴搅拌反应20h，取出后抽滤，水洗至中性，并在40℃的温度下真空干燥过夜。
步骤(a)中，所述多孔淀粉优选采用物理超声法制备得到，具体为：通过将淀粉(以干基计)添加到蒸馏水中来制备淀粉浆，在30℃下用20kHz+25kHz双频超声波处理40min后，用蒸馏水冲洗三次，并在40℃的温度下真空干燥过夜。
步骤(a)中，所述多孔淀粉浆中多孔淀粉的浓度为0.01-1g/mL。
步骤(a)中，所述胰岛素母液中胰岛素的浓度为1-100mg/mL。
步骤(a)中，所述胰岛素母液的制备过程具体为：将胰岛素溶解在0.01M HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5使胰岛素不被酸降解。
步骤(a)中，所述胰岛素采用天然存在的胰岛素、重组胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物。胰岛素可以使用来自任何适合物种的胰岛素，例如人、猪、牛、狗、羊等，具有各种程度的生物活性的胰岛素都能购买得到。
步骤(a)中，所述胰岛素采用猪胰岛素。猪胰岛素作为优选方案，猪胰岛素是经过糖基化的双链多肽链，其含有51个氨基酸且具有5777道尔顿的分子量，α和β链通过两个链间二硫键连接起来，α链含有一个链内二硫键。在优选实施方案中，猪胰岛素的生物活性范围是27-28IU/mg。
步骤(b)中，所述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的浓度为0.001-0.05g/mL。
步骤(c)中，所述CaCl2溶液中CaCl2的浓度为0.005-0.1g/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)相比于现有的负载胰岛素的天然聚合物pH响应体系，本发明利用海藻酸钠上的羧基在酸性条件下的质子化和在近中性条件下的去质子化这种特性来实现包埋传递体系对pH的响应，同时，多孔淀粉会在α-淀粉酶的作用下逐渐水解，实现胰岛素的α-淀粉酶响应性释放。本发明的包埋传递体系在胃液的酸性条件下，实现了对胰岛素的有效保护，同时在人体摄入食物后，机体会调节反馈性分泌α-淀粉酶，从而实现胰岛素对α-淀粉酶的响应性释放，本发明的胰岛素对α-淀粉酶进行响应性释放，将对食物摄入后的餐后血糖起到针对性的调节。
2)相比于现有的人工合成聚合物的环境敏感材料，本发明采用海藻酸钠和多孔淀粉分别作为pH和α-淀粉酶响应材料，而海藻酸钠是天然多糖类物质，无需进行制备，并采用凝胶法使其呈水凝胶状，其余原料也都是天然物质，整个制备方法操作简单并且不引入有机溶剂及有毒有害化学试剂，解决了合成材料降解性差及在安全性方面存在的隐患，降低了制备成本，可操作性强。
附图说明
图1为胰岛素包埋传递体系的结构示意图及制备流程图；
图2为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制得的胰岛素包埋传递体系的SEM图(第一行和第三行的图片放大倍数为30倍，第二行和第四行图片的放大倍数是2.00k倍，第二行为第一行中方框处位置的放大图，第四行为第三行中方框处位置的放大图)；
图3为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制得的胰岛素包埋传递体系的CLSM图像；
图4为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制得的胰岛素包埋传递体系的溶胀行为比较图；
图5为实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制得的胰岛素包埋传递体系中国胰岛素的释放过程比较图；
图6为三种淀粉的体外消化速率比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系，呈水凝胶状，包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔玉米淀粉和胰岛素，海藻酸钠水凝胶包裹在多孔大米淀粉外，多孔玉米淀粉中存在孔道和空腔，胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔玉米淀粉的孔道和空腔内，采用以下步骤制备得到，如图1所示：
(1)将40mg猪胰岛素(生物活性范围是27-28IU/mg)溶解在2mL浓度为0.01M的HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5，得到胰岛素浓度为20mg/mL的胰岛素母液。
(2)多孔玉米淀粉采用以下步骤得到：将玉米淀粉(MS)加入到PBS缓冲液中以形成淀粉浆，并将α-淀粉酶与淀粉浆混合(α-淀粉酶的用量为0.5IU/毫克淀粉)，在37℃水浴中反应6小时，然后将得到的悬浮液放入试管中离心，沉淀物用过量的无水乙醇洗涤3次，并在40℃的温度下真空干燥过夜。之后取多孔玉米淀粉溶于蒸馏水中得到浓度为0.2g/mL的多孔玉米淀粉浆。
(3)取1mL胰岛素母液与7mL多孔玉米淀粉浆混合搅拌，再加入8mL浓度为0.02g/mL的海藻酸钠溶液(将海藻酸钠直接溶解在水中得到海藻酸钠溶液，下同)搅拌均匀，形成混合溶液。
(4)在室温下，将上述混合溶液滴入浓度为0.02g/mL的CaCl2溶液中来形成海藻酸钠-多孔玉米淀粉胰岛素包埋传递体系，命名为INA-MS，多孔玉米淀粉、胰岛素和海藻酸钠的质量比为1400mg:20mg:160mg，CaCl2溶液中残余1.68mg胰岛素，包埋率为92.34％，汇总于表1。其中，包埋率为加入的总胰岛素的量减去CaCl2滤液中的胰岛素量，与加入总胰岛素量的比值(下同)，具体计算公式为：
该INA-MS的SEM图如图2所示，图中从第一到第四行分别是整个凝胶珠形貌、凝胶珠表面放大形貌、凝胶珠剖面形貌和凝胶珠剖面放大形貌。可看到，INA-MS的结构致密，海藻酸钠填充在多孔淀粉颗粒之间并覆盖其表面。
该INA-MS的CLSM图如图3所示，图中从第一行到第三行分别是罗丹明染色、FITC染色、罗丹明和FITC重叠染色，当淀粉和蛋白质共存时，FITC(绿色)将优先对淀粉染色，而RhoB(红色)将优先对蛋白质染色，INA-MS中确实存在淀粉和胰岛素，而且从染色的分布区域来看，同时结合最后一行左上角放大图(原图放大16倍)，可看到，胰岛素除了分布在多孔淀粉颗粒之间的海藻酸盐水凝胶中，胰岛素也进入了多孔淀粉的孔道和空腔内。
该INA-MS在模拟胃液(SGF，pH 1.2)的环境中以及模拟肠液(SIF，pH 7.4)的环境中的溶胀行为如图4所示，可看到，INA-MS在模拟胃液中皱缩，在模拟肠液中溶胀，且20min后溶解逐渐解体溶解。
该INA-MS在模拟胃液(SGF，pH 1.2，不加α-淀粉酶)和模拟肠液(SIF，pH 7.4，分为加α-淀粉酶和不加α-淀粉酶两种情况)中的胰岛素释放行为如图5所示，可看到，INA-MS在SGF中2小时的累计胰岛素释放量约为12％(由于SGF区域的释放条件一样，所以INA-MS的两条曲线在SGF区域基本是重合的，下同)；INA-MS在接下来的SIF阶段，在不加α-淀粉酶的情况下，胰岛素的释放明显加速，在2h(即图中坐标轴的240min)内胰岛素累计释放量超过69％，而在加α-淀粉酶的情况下，释放速率进一步提高，在2h(即图中坐标轴的240min)内胰岛素累计释放量超过82％，在4h(即图中坐标轴的360min)内胰岛素累积释放量94.30％，即在模拟肠液环境中INA-MS在4h内几乎完全释放，说明INA-MS对pH和α-淀粉酶具有双响应。
该INA-MS的胰岛素释放速率可以通过水凝胶中所含的多孔玉米淀粉的体外消化率来进行解释，具体如图6所示(即图中的Maize starch)，可看到，多孔玉米淀粉的消化率与时间呈正相关关系。
实施例2
一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系，呈水凝胶状，包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔蜡质玉米淀粉和胰岛素，海藻酸钠水凝胶包裹在多孔蜡质玉米淀粉外，多孔蜡质玉米淀粉中存在孔道和空腔，胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔蜡质玉米淀粉的孔道和空腔内，采用以下步骤制备得到，如图1所示：
(1)将40mg猪胰岛素(生物活性范围是27-28IU/mg)溶解在2mL浓度为0.01M的HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5，得到胰岛素浓度为20mg/mL的胰岛素母液。
(2)多孔蜡质玉米淀粉采用以下步骤得到：将蜡质玉米淀粉(WS)加入到PBS缓冲液中以形成淀粉浆，并将α-淀粉酶与淀粉浆混合(α-淀粉酶的用量为0.5IU/毫克淀粉)，在37℃水浴中反应6小时，然后将得到的悬浮液放入试管中离心，沉淀物用过量的无水乙醇洗涤3次，并在40℃的温度下真空干燥过夜。之后取多孔蜡质玉米淀粉溶于蒸馏水中得到浓度为0.2g/mL的多孔玉米淀粉浆。
(3)取1mL胰岛素母液与7mL多孔蜡质玉米淀粉浆混合搅拌，再加入8mL浓度为0.02g/mL的海藻酸钠溶液搅拌均匀，形成混合溶液。
(4)在室温下，将上述混合溶液滴入浓度为0.02g/mL的CaCl2溶液中来形成海藻酸钠-多孔蜡质玉米淀粉胰岛素包埋传递体系，命名为INA-WS，多孔蜡质玉米淀粉、胰岛素和海藻酸钠的质量比为1400mg:20mg:160mg，CaCl2溶液中残余1.51mg胰岛素，包埋率为93.79％，汇总于表1。
该INA-WS的SEM图如图2所示，可看到，INA-WS的结构致密，海藻酸钠填充在多孔淀粉颗粒之间并覆盖其表面。
该INA-WS的CLSM图如图3所示，INA-WS中确实存在淀粉和胰岛素，而且从染色的分布区域来看，同时从最后一行左上角放大图(原图放大16倍)，可看到，胰岛素除了分布在多孔淀粉颗粒之间的海藻酸盐水凝胶中，胰岛素也进入了多孔淀粉的孔道和空腔内。
该INA-WS在模拟胃液(SGF，pH 1.2，不加α-淀粉酶)的环境中以及模拟肠液(SIF，pH 7.4)的环境中的溶胀行为如图4所示，可看到，INA-WS在模拟胃液中皱缩，在模拟肠液中溶胀，且20min后溶解逐渐解体溶解。
该INA-WS在模拟胃液(SGF，pH 1.2)和模拟肠液(SIF，pH 7.4，分为加α-淀粉酶和不加α-淀粉酶两种情况)中的胰岛素释放行为如图5所示，可看到，INA-WS在SGF中2小时的累计胰岛素释放量约为8％；INA-WS在接下来的SIF阶段，在不加α-淀粉酶的情况下，胰岛素的释放明显加速，在2h(即图中坐标轴的240min)内胰岛素累计释放量超过73％，而在加α-淀粉酶的情况下，释放速率进一步提高，在2h(即图中坐标轴的240min)内胰岛素累计释放量超过88％，在4h(即图中坐标轴的360min)内胰岛素累积释放量达96.77％，即在模拟肠液环境中INA-WS在4h内几乎完全释放，说明INA-WS对pH和α-淀粉酶具有双响应。
该INA-WS的胰岛素释放速率可以通过水凝胶中所含的多孔蜡质玉米淀粉的体外消化率来进行解释，具体如图6所示(即图中的Wax maize starch)，可看到，多孔蜡质玉米淀粉的消化率与时间呈正相关关系。
实施例3
一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系，呈水凝胶状，包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔大米淀粉和胰岛素，海藻酸钠水凝胶包裹在多孔大米淀粉外，多孔大米淀粉中存在孔道和空腔，胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔大米淀粉的孔道和空腔内，采用以下步骤制备得到，如图1所示：
(1)将40mg猪胰岛素(生物活性范围是27-28IU/mg)溶解在2mL浓度为0.01M的HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5，得到胰岛素浓度为20mg/mL的胰岛素母液。
(2)多孔大米淀粉采用以下步骤得到：将大米淀粉(RS)加入到PBS缓冲液中以形成淀粉浆，并将α-淀粉酶与淀粉浆混合(α-淀粉酶的用量为0.5IU/毫克淀粉)，在37℃水浴中反应6小时，然后将得到的悬浮液放入试管中离心，沉淀物用过量的无水乙醇洗涤3次，并在40℃的温度下真空干燥过夜。之后取多孔大米淀粉溶于蒸馏水中得到浓度为0.2g/mL的多孔大米淀粉浆。
(3)取1mL胰岛素母液与7mL多孔大米淀粉浆混合搅拌，再加入8mL浓度为0.02g/mL的海藻酸钠溶液搅拌均匀，形成混合溶液。
(4)在室温下，将上述混合溶液滴入浓度为0.02g/mL的CaCl2溶液中来形成海藻酸钠-多孔大米淀粉胰岛素包埋传递体系，命名为INA-RS，多孔大米淀粉、胰岛素和海藻酸钠的质量比为1400mg:20mg:160mg，CaCl2溶液中残余4.79mg胰岛素，包埋率为80.14％，汇总于表1。
该INA-RS的SEM图如图2所示，可看到，INA-RS的结构致密，海藻酸钠填充在多孔淀粉颗粒之间并覆盖其表面。
该INA-RS的CLSM图如图3所示，INA-RS中确实存在淀粉和胰岛素，而且从染色的分布区域来看，同时从最后一行左上角放大图(原图放大16倍)，可看到，胰岛素除了分布在多孔淀粉颗粒之间的海藻酸盐水凝胶中，胰岛素也进入了多孔淀粉的孔道和空腔内。
该INA-RS在模拟胃液(SGF，pH 1.2，不加α-淀粉酶)的环境中以及模拟肠液(SIF，pH 7.4)的环境中的溶胀行为如图4所示，可看到，INA-RS在模拟胃液中皱缩，在模拟肠液中溶胀，且20min后溶解逐渐解体溶解。
该INA-RS在模拟胃液(SGF，pH 1.2)和模拟肠液(SIF，pH 7.4，分为加α-淀粉酶和不加α-淀粉酶两种情况)中的胰岛素释放行为如图5所示，可看到，INA-RS在SGF中2小时的累计胰岛素释放量约为11％；INA-RS在接下来的SIF阶段，在不加α-淀粉酶的情况下，胰岛素的释放明显加速，在2h(即图中坐标轴的240min)内胰岛素累计释放量超过60％，在加α-淀粉酶的情况下，释放速率进一步提高，在2h(即图中坐标轴的240min)内胰岛素累计释放量超过96.98％，在4h(即图中坐标轴的360min)内胰岛素累积释放量达99.78％，即在模拟肠液环境中INA-RS在4h内几乎完全释放，说明INA-RS对pH和α-淀粉酶具有双响应。
该INA-RS的胰岛素释放速率可以通过水凝胶中所含的大米淀粉的体外消化率来进行解释，具体如图6所示(即图中的Rice starch)，可看到，大米淀粉的消化率与时间呈正相关关系。图6可以说明，胰岛素的累计释放速率随着淀粉消化速率的增加而增加。
对比例1
一种包埋有胰岛素的海藻酸钠水凝胶(英文全名为：insulin-loaded alginatehydrogel beads，下文简称为INA)，采用以下步骤制备得到：
(1)将40mg猪胰岛素(生物活性范围是27-28IU/mg)溶解在2mL浓度为0.01M的HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5，得到胰岛素浓度为20mg/mL的胰岛素母液。
(3)取1mL胰岛素母液与7mL蒸馏水混合搅拌，再加入8mL浓度为0.02g/mL的海藻酸钠溶液搅拌均匀，形成混合溶液。
(4)在室温下，将上述混合溶液滴入浓度为0.02g/mL的CaCl2溶液中来形成海藻酸钠胰岛素包埋传递体系，命名为INA，胰岛素和海藻酸钠的质量比为20mg:160mg，CaCl2溶液中残余8.17mg胰岛素，包埋率为64.14％，汇总于表1。表1说明相比较INA水凝胶而言，本发明的包埋传递体系中胰岛素的包埋率可从约65％增加到80％以上，且多孔淀粉加入的量与包埋率呈正相关关系。
该INA的SEM图如图2所示，可看到，INA-RS的结构不致密，胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中。图2中的各图证明本发明的海藻酸钠-多孔淀粉水凝胶胰岛素包埋传递体系相比较INA水凝胶的结构更加致密，海藻酸钠填充在多孔淀粉颗粒之间并覆盖其表面。
该INA的CLSM图如图3所示，可看到，胰岛素只分布在海藻酸盐水凝胶中。
该INA在模拟胃液(SGF，pH 1.2)的环境中以及模拟肠液(SIF，pH 7.4)的环境中的溶胀行为如图4所示，可看到，INA在模拟胃液中皱缩，在模拟肠液中溶胀，但皱缩和溶胀程度较大。图4说明本发明的包埋传递体系具有优异的pH响应，这使得患者可采用口服的方式摄取胰岛素。
该INA在模拟胃液(SGF，pH 1.2)和模拟肠液(SIF，pH 7.4，分为加α-淀粉酶和不加α-淀粉酶两种情况)中的胰岛素释放行为如图5所示，可看到，INA水凝胶在SGF中释放了约80％的封装胰岛素，并在随后的SIF释放期间(包括加α-淀粉酶和不加α-淀粉酶两种情况)残留的胰岛素在1小时内几乎都完全释放。图5中，三种类型的INAS在SGF中2小时的累计胰岛素释放量比INA小得多，最大值仅约为12％，这意味着本发明的包埋传递体系可以更好地保护胰岛素免受低pH和胃液中的胃蛋白酶的破坏。在接下来的SIF阶段，在α-淀粉酶存在的情况下，三种类型的INAS在2h内胰岛素累计释放量均超过82％，并在4h内几乎完全释放，证明本发明的包埋传递体系增加了α-淀粉触发式释放特征，肠道中α-淀粉酶会在食物摄入后反馈调节性分泌，而INAS在α-淀粉酶存在时会加速胰岛素的释放速率，这种胰岛素在肠腔中因α-淀粉酶在食物摄入后反馈调节性增加而加速释放的模式，对于餐后血糖针对性的治疗和平稳有着重要的意义，将对平稳糖尿病病人餐后血糖提供了有效的治疗方案。
表1实施例1、2、3和对比例1制得的胰岛素包埋传递体系的包埋率一览表
(表中，同一列中的不同字母a，b，c表示显著差异(p<0.05))
实施例4
一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系，呈水凝胶状，包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔玉米淀粉和胰岛素，海藻酸钠水凝胶包裹在多孔大米淀粉外，多孔玉米淀粉中存在孔道和空腔，胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔玉米淀粉的孔道和空腔内，采用以下步骤制备得到，如图1所示：
(1)将10mg重组胰岛素溶解在10mL浓度为0.01M的HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5，得到胰岛素浓度为1mg/mL的胰岛素母液。
(2)多孔玉米淀粉采用以下步骤得到：将玉米淀粉加入2M HCl溶液中以形成淀粉浆，45℃下水浴搅拌反应20h，取出后抽滤，水洗至中性，并真空干燥40℃过夜。之后取多孔玉米淀粉溶于蒸馏水中得到浓度为0.01g/mL的多孔玉米淀粉浆。
(3)取10mL胰岛素母液与100mL多孔玉米淀粉浆混合搅拌，再加入100mL浓度为0.001g/mL的海藻酸钠溶液搅拌均匀，形成混合溶液。
(4)在室温下，将上述混合溶液滴入浓度为0.005g/mL的CaCl2溶液中来形成海藻酸钠-多孔玉米淀粉水凝胶胰岛素包埋传递体系，命名为INA-MS，多孔玉米淀粉、胰岛素和海藻酸钠的质量比为1000mg:10mg:100mg。
实施例5
一种pH和α-淀粉酶双响应的胰岛素包埋传递体系，呈水凝胶状，包括作为基质的海藻酸钠水凝胶、多孔玉米淀粉和胰岛素，海藻酸钠水凝胶包裹在多孔大米淀粉外，多孔玉米淀粉中存在孔道和空腔，胰岛素分布在海藻酸钠水凝胶中及多孔玉米淀粉的孔道和空腔内，采用以下步骤制备得到，如图1所示：
(1)将1000mg胰岛素衍生物溶解在10mL浓度为0.01M的HCl溶液中，并使用1M NaOH溶液将pH调节至7.5，得到胰岛素浓度为100mg/mL的胰岛素母液。
(2)多孔玉米淀粉采用以下步骤得到：通过将5g淀粉(以干基计)添加到95g蒸馏水中来制备5％(w/w)淀粉浆，在30℃下用20kHz+25kHz双频超声波处理40min后,用蒸馏水冲洗三次，并在40℃的温度下真空干燥过夜。之后取多孔玉米淀粉溶于蒸馏水中得到浓度为1g/mL的多孔玉米淀粉浆。
(3)取1mL胰岛素母液与10mL多孔玉米淀粉浆混合搅拌，再加入10mL浓度为0.05g/mL的海藻酸钠溶液搅拌均匀，形成混合溶液。
(4)在室温下，将上述混合溶液滴入浓度为0.1g/mL的CaCl2溶液中来形成海藻酸钠-多孔玉米淀粉水凝胶胰岛素包埋传递体系，命名为INA-MS，多孔玉米淀粉、胰岛素和海藻酸钠的质量比为10000mg:100mg:500mg。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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