具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1.构建ΔCYP51A菌株和ΔCYP51B菌株

A.构建用于敲除子构建的片段

通过double-joint(DJ)PCR方法，构建用于CYP51A和CYP51B敲除子的融合PCR产物(Chen,S.,Yuan,N.,Schnabel,G.,Luo,C.2017.Function of the genetic element‘Mona’associated with fungicide resistance in Monilinia fructicola.Molecular plantpathology 18:90-97.)。所需引物如表1所示。以ΔCYP51A为例，通过引物NymA5-FOR/NymA5-REV以及NymA3-FOR/NymA3-REV从C.nymphaeae的基因组中，扩增CYP51A基因的5’端和3’端序列。通过引物HypF/HypR从载体pBHT2中扩增潮霉素基因的完整序列(包括A.nidulans的启动子、终止子以及潮霉素基因)。再通过NymA_5_nest/Hyp-nest-5R,以及Hyp-nest-3F/NymA_3_nest，对片段进行第二轮融合，得到敲除CYP51A基因的上游片段及下游片段，其中，用于敲除CYP51A的上游序列，如序列表中SEQ IDNO.1所示，用于敲除CYP51A的下游片段序列，如序列表中SEQ ID NO.2所示。

同理构建敲除CYP51B的融合PCR产物，其中所述引物如表1所示，得到用于敲除CYP51B的上游及下游片段，其中，用于敲除CYP51B的上游片段，如序列表中SEQ ID NO.3所示，用于敲除CYP51B的下游片段，如序列表中SEQ IDNO.4所示。

B.制备炭疽病菌原生质体

制备原生质体方法如Chen等所述(Chen et al.2017)，方法包括：

配制酶解液，现用现配：称取0.08g溶菌酶，0.08g崩溃酶，0.08g蜗牛酶，0.04g纤维素酶，溶于8ml 1M NH₄Cl溶液中，装于10ml的离心管中，摇床震荡30min，使酶液充分溶解，过滤灭菌。

按以下方法制备C.nymphaeae野生亲本菌株CaPH40的原生质体：

1)菌株接种于PDA平板22℃培养4d，用接种针挑新鲜菌丝接种于50mlPDB培养液中，置于22℃120r/min摇培。

2)3天后用双层灭菌纱布过滤，获得菌丝，用1M NH₄Cl溶液清洗菌丝。

3)将菌丝加入充分溶解的酶解液中，约1ml酶解液加入0.1g菌丝，27℃摇床震荡4h，充分酶解。4h后镜检可看到大量单独的半透明圆球状细胞，即为原生质体。

4)3000rpm离心l0 min，弃上淸。

5)加入5ml STC溶液清洗一次，3000rpm离心10min，弃上清。

6)加入适量STC溶液，用血球计数板镜检计数，使原生质体浓度调至10⁶个/ml。得到的原生质体直接转化或加入1/10体积的60％PEG4000，混匀后分装，-80℃短期保存，即为原生质体悬浮液。

C.PEG介导原生质体转化

1)取160μl配制好的原生质体悬浮液(步骤B所得)，加入10ml玻璃管中，再加入纯化后的上游片段、下游片段各35μl(步骤A所得)，用枪头轻轻吸吹混匀，在冰上放置15min。

2)先后沿管壁缓缓加入200μl PEG溶液，200μl PEG溶液，和800μl PEG溶液，每次边加入边转动离心管轻轻混匀，冰上静置15min。

3)加入1ml STC溶液，混匀。

4)取450μl转化混合液加入培养皿(Φ＝9cm)中，倒入20ml约45℃的再生培养基与转化混合液混匀，凝固后密封，22℃黑暗培养。

5)1～2d后，原生质体刚刚萌发，加盖含潮霉素150μg/ml的筛选培养基，22℃培养。

6)6d后，筛选培养基表面长出生长良好的单菌落。

D.敲除转化子验证

C.nymphaeae野生亲本菌株CaPH40没有潮霉素抗性基因(Hyp)，因此在含有潮霉素hygB 200μg/mL的PDA平板上不能生长，体外构建的含潮霉素抗性基因的载体片段如果成功同源置换了CYP51基因，则可以在hygB 200μg/mL的PDA平板上正常生长且对潮霉素的抗性稳定。因此根据转化子在hygB 200μg/mL的PDA平板上多代的生长情况，筛选得到的敲除转化子。

对能在含潮霉素200μg/ml的PDA培养基上正常生长，且转接5代以上仍稳定生长的单菌落，为敲除转化子。

采用特异性引物,通过PCR扩增筛选和验证ΔCYP51A及ΔCYP51B敲除子。具体而言，用DNA提取试剂盒(北京全式金生物有限公司)提取亲本菌株CaPH40和ΔCYP51A、ΔCYP51B敲除子DNA做为模板。根据同源置换后的基因序列设计特异性引物Check_CNA_For/Check_Hyg_Rev和Check_Hyg_For/Check_CNA_Rev，分别特异性扩增同源置换后ΔCYP51A敲除子中上下游接合区2460bp和1845bp片段。设计特异性引物Check_CNB_For/Check_Hyg_Rev和Check_Hyg_For/Check_CNB_Rev，分别特异性扩增同源置换后ΔCYP51B敲除子中上下游接合区2405bp和2185bp片段。

根据上述方法，共获得ΔCYP51A敲除子9株，ΔCYP51B敲除子10株，随机挑取3个转化子进行后续药剂敏感性试验。

表1.引物信息

实施例2

野生型炭疽病菌、ΔCYP51A菌株和ΔCYP51B菌株DMI类药剂敏感性测定。

通过菌落生长测定法，用咪酰胺、丙环唑、烯菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、氟环唑测试野生型炭疽病菌菌株(CaPH40)、其ΔCYP51A菌株和ΔCYP51B菌株对以上药剂的敏感性。具体步骤包括如下：

(1)将咪酰胺、丙环唑、烯菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、氟环唑分别用二甲酰亚砜配制成10⁴μg/ml的母液。

(2)将上述母液分别加入已灭菌、冷却至45℃的PDA培养基中，利用每种药剂制成终浓度为0,0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30,100μg/ml的，直径为9cm的含药平板，每个比例药剂设3次重复。

(3)于各平板上接种野生型亲本菌株CaPH40、ΔCYP51A菌株(随机选取3个转化子)和ΔCYP51B(随机选取3个转化子)菌株，并在PDA平板上培养5天后，沿菌落边沿用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤(2)中的带药和对照(浓度为0μg/ml的平板)培养基中，置于28℃培养箱黑暗培养，7d后测量菌落直径。

(4)当对照菌落直径达到培养皿直径的80﹪以上时，用十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复，计算各药剂的不同浓度的抑制率(即和对照相比，抑制菌丝生长的百分率)，通过抑制率和系列药剂浓度的对数之间的线性回归分析，得到毒力回归方程，然后求出各药剂的EC₅₀。

结果如表1-3所示。其中，各药剂对野生型菌株CaPH40、其敲除CYP51A基因后的ΔCYP51A敲除子、敲除CYP51B基因后的ΔCYP51B敲除子的毒力回归方程及相关系数如表1、表2和表3所示，并根据毒力回归方程计算每种药剂对于各菌株的EC₅₀值。

具体而言，表1中显示野生型亲本菌株对于各DMI类药剂的EC₅₀值，及其毒力回归方程、相关系数；EC₅₀值由毒力回归方程计算得来。

表2、表3显示ΔCYP51A、ΔCYP51B敲除子对各DMI类药剂的EC₅₀值，及其毒力回归方程、相关系数；其中，毒力回归方程由随机挑选的3个敲除子，在含不同药剂浓度平板上菌丝生长抑制率的平均值计算得来，并根据毒力回归方程计算每种药剂对于各菌株的EC₅₀值。

表1.各药剂对野生型炭疽病菌CAPH40的EC₅₀值

；

表2.各药剂对ΔCYP51A敲除子的EC₅₀值

；

表3.各药剂对ΔCYP51B敲除子的EC₅₀值

根据各菌株对于各DMI类药剂的EC₅₀值，将各DMI类药剂分为三类：

I类：和野生型菌株相比，ΔCYP51B的EC₅₀降低，而ΔCYP51A的EC₅₀保持不变的DMI类药剂；组I中药剂对ΔCYP51B转化子更为有效，意味着其对CYP51A(ΔCYP51B转化子中仅含CYP51A)抑制力更强；

II类：和野生型菌株相比，ΔCYP51A的EC₅₀降低，而ΔCYP51B的EC₅₀保持不变的DMI类药剂；组I中药剂对ΔCYP51A转化子更为有效，意味着其对CYP51B(ΔCYP51B转化子中仅含CYP51A)抑制力更强；

III类：和野生型菌株相比，ΔCYP51A和ΔCYP51B的EC₅₀均降低的DMI类药剂；意味着药剂对CYP51A和CYP51B均有抑制力。

通过比较敲除子和野生型炭疽病菌对不同DMI类杀菌剂的敏感性差异，将测试的DMI类药剂按照敏感性变化程度进行分组，其中咪酰胺属于组I，相较于野生型菌株，ΔCYP51A的敏感性不变，ΔCYP51B显著性变敏感；丙环唑和烯菌唑属于组II，ΔCYP51B的敏感性不变，ΔCYP51A显著性变敏感；环丙唑醇,苯醚甲环唑和氟环唑属于组III，ΔCYP51A和ΔCYP51B的敏感性均显著性增加，结果如表4所示。

组I中药剂对ΔCYP51B转化子更为有效，意味着其对CYP51A(ΔCYP51B转化子中仅含CYP51A)抑制力更强；同理，组II中药剂对CYP51B抑制力更强；而组III中药剂对CYP51A和CYP51B均有抑制作用。

表4.DMI类药剂的分组各菌株对不同DMI类杀菌剂的EC₅₀值

平均值±标准差(SD)；用SPSS13.0软件对数据进行ANOVA分析(LSD；P＝0.01，同一列数值后的字母相同，则表示两者间没有显著性差异。

进一步，计算出敲除子ΔCYP51A和ΔCYP51B较其野生亲本菌株而言，对不同DMI杀菌剂的EC₅₀变化的百分比，结果见表5。

表5.相较于亲本炭疽病菌，敲除子对不同DMI类杀菌剂的EC₅₀变化百分比

百分比为敲除子EC₅₀较野生型菌株EC₅₀的变化值，具体计算方法为：(1-敲除子EC₅₀/野生型EC₅₀)％。NS代表敲除子和野生型亲本菌株相比，EC₅₀值没有显著性差异(LSD方法，P＝0.01)。

实例3.不同药剂组合的增效作用

1、根据以上分组，将DMI类杀菌剂组I和组II，组II和组III，组I和组III药剂，按照1:1的比例进行混合，验证其增效作用。

2.菌株：为了使样本具有一定的遗传多样性，选择来自C.nymphaeae菌株5株，分别为：CaPH40,CaCO3-35,CaCO42,CaCO51,CaCO9。

3.分别测试其对咪酰胺、丙环唑、烯菌唑、环丙唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑的EC₅₀值，及对复配组合的EC₅₀值，具体步骤见步骤一，复配组合为：

咪酰胺/丙环唑(组I+组II)，咪酰胺/烯菌唑(组I+组II)；

咪酰胺/环丙唑醇(组I+组III)，咪酰胺/氟环唑(组I+组III)，咪酰胺/苯醚甲环唑(组I+组III)；

丙环唑/烯菌唑(组II+组II)；

丙环唑/氟环唑(组II+组III)，烯菌唑/苯醚甲环唑(组II+组III)。

4.根据孙云沛法(Sun,Y.,Johnson,E.1960.Analysis of joint action ofinsecticides against house flies.Journal of Economic Entomology 53:887-892.),通过EC₅₀计算复配剂的实测毒力指数(ATI)、理论毒力指数(TTI)和共毒系数(CTC)。计算方法如下：

复配剂实测毒力指数(ATI)＝单剂EC₅₀/复配剂EC₅₀×100。

复配剂理论毒力指数(TTI)＝A毒力指数×A在复配剂中含量(％)+B毒力指数×B在复配剂中含量(％)。

共毒系数(CTC)＝ATI/TTI×100。

CTC≤80为拮抗作用，80<CTC<120为相加作用，CTC≥120为增效作用。

5.结果如表6-表12所示，其毒力回归方程由步骤2中所述5株C.nymphaeae菌株在含不同药剂浓度平板上菌丝生长抑制率的平均值计算得来，并根据毒力回归方程计算每种药剂、及其复配，对于菌株的EC₅₀值。

表6咪酰胺与丙环唑组合对炭疽病菌的室内毒力测定

；

表7咪酰胺与烯菌唑组合对炭疽病菌的室内毒力测定

；

表8咪酰胺与环丙唑醇组合对炭疽病菌的室内毒力测定

；

表9咪酰胺与氟环唑对炭疽病菌的室内毒力测定

表10丙环唑与烯菌唑对炭疽病菌的室内毒力测定

；

表11丙环唑与氟环唑对炭疽病菌的室内毒力测定

；

表12烯菌唑与苯醚甲环唑对炭疽病菌的室内毒力测定

。

结果与分析

从上述表中可以得出，将不同组别的DMI类药剂按1:1混配时，均具有增效作用，咪酰胺/苯醚甲环唑(组I+组III)和咪酰胺/环丙唑醇(组I+组III)具有相近的毒力系数，也为增效。而同组DMI类药剂混配时，如丙环唑/烯菌唑(组II+组II)，在1:1配比时，共毒系数为77，不表现为相加/增效作用。

由此，将不同组别的两种DMI类药剂进行复配时，由于二者对CYP51A和CYP51B靶标结合具有不同的偏好性，复配具有增效作用。而将同组别的药剂进行复配时，由于其对CYP51A和CYP51B靶标结合的偏好性不明显，将不表现为增效作用。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种快速筛选防治炭疽病菌复配药剂的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggaaagagg tgtatttggc tgactggcaa cagcataacc ccttgggtcg aaaatatggg 60

ttaccaaaac gcatttttag ttgccgcgtt tgctgctttg gcgcagatct catcgtactt 120

cgccatgatc aaatggggtc gacagattcg tgcagcgagt gtcacccggt attggaagta 180

ttgccagaaa gagtaagatt ttgaaagcag caagtctgat gttccgaaag agacttgaat 240

ttaatccctt acttttgtgt attctaagtg atgagaggta gttttgggta gaccaatatc 300

cgacttatat gatacccaac ctgctccaag ttgatacctt agctgtgctt gaagagcata 360

atctgcatac tggcgactgc atcccaccat agtcggacac gctttatgaa acgcggtaat 420

tgtgcattta tcaacaaaga tgttttagta gatcacagtg atttcctagt gcttatgtat 480

ttcctaggcc cactgatctc aactgaaatc agcagcgcct gcagcttaat aggagtgggt 540

acgtacctaa tacgaatacg aaccgccttt gcgctccagg gtcatcaagg aaagcaggga 600

actcgatgtg gacatcgccg tcactaacac ctcgaaggct tgtaggtcca gccgaatacg 660

aattcgaaag acattcgagt ttttgtcact caggttgcta gacttggctc caaatcaccg 720

acggagtttt ggatatttgc cattgcctac tgtacacgtc tgaattgaag agaaatatcg 780

tcgtctttcc tggctgagct atcgaaatgt ctactttact tatgttgtac tggtcctgac 840

acagctctcg tcctcttatt aactacaaat gttttttgat cgttgtacaa aatcttgaca 900

aaacccaacc actgaaattc gacagaagat gatattgaag gagcattttt gggcttggct 960

ggagctagtg gaggtcaaca catcaatgct attttggttt agtcgtccag gcggatcaca 1020

aaatttgtgt cgtttgacaa gatggttcat ttaggcaact ggtcagatca gcccacttgt 1080

aagcagtagc ggcggcgctc gaagtgtgac tcttattagc agacaggaac gaggacatta 1140

ttatcatctg ctgcttggtg cacgataact tgtgcgtttg tcaagcaagg taagtgaacg 1200

acccggtcat accttcttaa gttcgccctt cctcccttta tttcagattc aatctgactt 1260

acctattcta cccaagcatc gatatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga 1320

agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag 1380

aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct 1440

gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc 1500

cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctgacctat tgcatctccc 1560

gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc 1620

agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt 1680

tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg 1740

cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt 1800

ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc 1830

<210> 2

<211> 1729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggcgaaga atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg 60

taaatagctg cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg 120

ccgcgctccc gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt 180

gcatctcccg ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg 240

ctgttctgca gccggtcgcg gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga 300

cgagcgggtt cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt 360

tcatatgcgc gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg 420

tcagtgcgtc cgtcgcgcag gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg 480

aagtccggca cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc 540

gcataacagc ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg 600

ccaacatctt cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg 660

agcggaggca tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg 720

gtcttgacca actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc 780

agggtcgatg cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg 840

cccgcagaag cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa 900

accgacgccc cagcactcgt ccgagggcaa aggaatagag tagatgccgg atccacttaa 960

ccaatgtttg ttcctctcca tgaggtgaaa taaaagtgat gatacgcact ttcaatcggg 1020

attctaagcg ctattacctg gttgtcttgt attgagcgga ctggcttatt cgaaatacta 1080

catgcttgtc cccagctagc aaagttgagt tgatcaagat ctagaatacg gtatttgaag 1140

tcggttaaca cagctacatg atgcttgttc tacatcctaa attcagaaga tgtctgcggt 1200

agaacgttga agctaatcat cgtgtcaaat tgaagctttg aagtttggtc taagcgaaag 1260

gcaacaagcg ccaacacttt attattaaac cttgttgcga agcgcaagga cccatccgag 1320

ctggaacatg ttcctaaaaa ggcaacatct ggatgatcat ccgaagcttt gccgactcaa 1380

ctctcgagcc ctgaaaccgt taataatcac tgacaccctc catttcaagc cgtcaactta 1440

ccccaatgtc atagtcaagg gagctacata ccagatgctc ttcgttcaca gcgaccccaa 1500

cagcacggat tatggcgcct ctcacttcat cacctcattt caatgatgca acagaatcag 1560

aacggttgct tggcactaga agtgctgatt cgaatatcga gccaacgtca tctatcaacg 1620

gacaagaccg agaagccatc gcattgaagc ttgccgcggc agcttactct ttcgtagtcg 1680

cgggtctttt cgtggctaca attggagtta cactaccgca ccagcaaac 1729

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca 60

atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg 120

gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg 180

agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc 240

gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt 300

tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga 360

ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag 420

aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca aaggaataga 480

gtagatgccg gatccactta acgttactga aatcatcaaa cagcttgacg gaggcaattt 540

tgaaatggct tgatcgcgtt caaaggtggt ttccagagtc tggggaattg gagcacacat 600

cgaatcattc ccatctccca ttgcttgaat aggcagggag ggtctccaga tacgaatacg 660

aacggcccgt cattggatga gctgctggtg ccaccgattg gtccctcccc tgttcccgat 720

tttctggcgc aacgtccaac atggaccaac agggacgcac aggtgcttcc gagtggaaag 780

ggggccactg gggggcacct agcatttcat ggaagcaaac atgggaaaga aagggcagaa 840

aacaaaagga agaagagctt gcggtgcagc attctctgcc acaatgcact aggtaccctg 900

tgacagacgc ctcaaaatcg attcgggtgg ccagatgtca cagattcttg gctccacgac 960

aatcttttga cgtgcaaaat gcttgaccgc ctacccagcc atggcagtca tgcaaccttc 1020

cttactttgg atactttggt acattagctt agctgctggc tggctaaggt acctaggtat 1080

ggtgaggtac ctaaggtagg cgcacacaga cgtaaggtaa ggtagtggtg ctccttggtt 1140

acgcaaagaa aatgtggaac ccaacaaaac gcggcaggta tctaatctca ttaatggata 1200

atttaaaacc actgctggac cccccttctc gatgccttcc actttcttcg tgccactgat 1260

attcgtcttg tgcgtgcggt cactactctc gaaaacacag gcaga 1305

<210> 4

<211> 1717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agggcgaaga atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg 60

taaatagctg cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg 120

ccgcgctccc gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt 180

gcatctcccg ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg 240

ctgttctgca gccggtcgcg gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga 300

cgagcgggtt cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt 360

tcatatgcgc gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg 420

tcagtgcgtc cgtcgcgcag gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg 480

aagtccggca cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc 540

gcataacagc ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg 600

ccaacatctt cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg 660

agcggaggca tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg 720

gtcttgacca actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc 780

agggtcgatg cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg 840

cccgcagaag cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa 900

accgacgccc cagcactcgt ccgagggcaa aggaatagag tagatgccgg atccacttaa 960

cgttactgaa atcatcaaac agcttgacgc aagtttgtca ttcccaccag ccacaccctc 1020

cttgccgccc ccggtgtctc tggctccgac cccgtctact tccccgagcc cgaggaatgg 1080

aacccccacc gctgggacgc cgactcccct atcgccccca gacttggacg ccccgaagat 1140

gccgatgatg agaagatcga ttacggttac ggcttggtta gcaagggtgc cggatcgcct 1200

tacctcccct tcggcgccgg tcgtcaccgc tgcatcggtg agcactttgc caacctgcag 1260

ttgcagacca ttaccgccat gattgtcaga gaattcaagt tccgcaacgc cgacggtagc 1320

aacaagatca acggcaccga ttacgcctcc ctcttctcac ggccattgga gcccgccaac 1380

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