具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例涉及维生素类内源性物质的检测，具体提供了一种检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法，该检测方法不用于疾病的诊断与治疗，可以包括以下步骤：

步骤101：利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的维生素K2(MK-7)标准品及内标物，不同标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度不同。

请参考图2，图2示出了维生素K2(MK-7)的化学结构式。

步骤102：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到维生素K2(MK-7)的标准曲线方程。

步骤103：将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，该血液样本为经处理至少100μL待检测血液而得到的血清或血浆，内标工作液中含有浓度已知的内标物，稀释液为含0-0.1％甲酸和5-20％水的乙腈溶液。

详细地，无水乙醇为沉淀剂，可沉淀血液样本中的蛋白，并使与蛋白结合的维生素K2(MK-7)呈游离状态，正己烷为萃取剂，可萃取出血液样本中的维生素K2(MK-7)，稀释液用于复溶吹干后的物质。

本发明实施例中，基于无水乙醇和正己烷的配合使用，能够在最大程度保留维生素K2(MK-7)的同时，去除干扰物，以提高检测准确度。

本发明实施例中，先将内标和血液样本混匀，再加入无水乙醇并混匀，再加入正己烷并混匀，离心取上清后用氮气吹干上清，吹干后加入稀释液进行复溶并混匀，最后再离心取上清液即可得到待测样本。这一样本前处理仅使用沉淀蛋白及液液萃取的方式来处理血液样本，不仅能够在最大程度保留维生素K2(MK-7)的同时去除干扰物，而且简单易操作、耗时短，无需涉及到SPE即可得到待测样本，从而可对血液中维生素K2(MK-7)的含量进行检测，故可显著降低实验成本，且该方法避免了SPE过程中待测物维生素K2(MK-7)的损失，可减少血液样本用量。

详细地，上述血液样本可经处理至少100μL待检测血液而得到。待检测血液的用量不高，可低至100μL，采血量较少，使得被检测者的采血体验好。通常情况下，可将血液样本置于4℃冷藏保存至分析前备用。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

步骤104：利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图。

步骤105：根据待测样本的色谱图和维生素K2(MK-7)的标准曲线方程，计算血液样本中维生素K2(MK-7)的含量。

本发明实施例中，基于上述血液样本前处理过程，在保证检测效果的同时，可使得样本前处理更加简单化，操作简单，能够减少或避免操作带来的误差，从而能够更准确的定量，以及可以显著降低实验成本。此外，由于前处理方法较为简单，且实验成本低，血液用量少，故有利于实际检测的应用及推广。

在本发明一个实施例中，优选地，上述步骤103中，所述将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，然后加入一定量的无水乙醇并混匀，再加入一定量的正己烷并混匀，离心取上清液，通过氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀释液并混匀，离心取上清液得到待测样本，包括：

用移液枪移取血液样本50-200μL(如50、100、150或200μL)于一离心管中，然后加入一定量(如10μL)的内标工作液，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合20s-2min(如20s、30s、1min、1.5min或2min)；

然后加入无水乙醇0.3-1.0mL(如0.3、0.5、0.7、0.9或1.0mL)，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合1-4min(如1、2、3或4min)，再加入正己烷0.5-1.2mL(如0.5、0.7、0.9、1.0或1.2mL)，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合4-10min(如4、5、7、9或10min)，再在10000-12000rpm(如10000、10500、11000、11500或12000rpm)的转速下高速离心5-12min(如5、7、9、10或12min)，移取上清液至另一离心管中；

用氮气吹干移取的上清液，吹干后加入50-200μL(如50、100、150或200μL)稀释液，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合1-3min(如1、1.5、2.0、2.5或3min)，再在10000-14000rpm(如10000、11000、12000、13000或14000rpm)的转速下高速离心5-12min(如5、7、9、10或12min)，取上清液得到待测样本。

本发明实施例中，通过对血液样本前处理所用试剂的类别、用量及其配合使用进行优化，使用如上所述的前处理方式来处理血液样本，可在有效提取目标物的同时，减少基质中的杂质干扰，从而实现生物样本中更低的检测限(检测限可低至0.00606ng/mL)，以满足临床医学检验需求。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，内标工作液中含10-60ng/mL(如10、20、30、40、50或60ng/mL)的维生素K2(MK-7)-d7，添加量为10μL。

详细地，本发明实施例中优选使用维生素K2(MK-7)的同位素作为内标物。其中，d7表征有7个H原子被氘原子取代。以维生素K2(MK-7)-d7同位素标记物为内标物，使得血液样本的检测不易受基质等影响，故使得维生素K2(MK-7)的识别更为准确，可使得分析时间短、干扰小，且内标定量适宜，特异性强、准确度和灵敏度高。

详细地，可以用含异丙醇量为15-30％(如15、20、25或30％)的乙腈溶液，来溶解维生素K2(MK-7)-d7标准品，以得到内标标准储备液，进而可用稀释液来稀释内标标准储备液，以得到内标工作液。

在本发明一个实施例中，所述检测条件中的液相条件包括：五氟苯基色谱柱，流动相A为含0.5％甲酸的水溶液，流动相B为甲醇与乙腈的混合溶液，该混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为1:4，洗脱过程采用梯度洗脱的方式。

本发明实施例中，基于五氟苯基色谱柱和上述特定流动相的配合使用来检测血液样本时，可以使目标物与杂质更好的分离，在不进行SPE前处理的前提下，实现更低的血清定量限，并降低了血液样本用量，同时缩短了分析时间，进一步降低了人员成本及仪器使用成本。

详细地，使用上述液相条件来检测血液中维生素K2(MK-7)含量时，维生素K2(MK-7)的保留时间可低至2.31min，分析时间可为6min甚至更低，分析时间短，可以实现血液样本中维生素K2(MK-7)含量的快速、准确检测，以及可以具有批次间保留时间稳定、目标峰出峰效果好、分离效果的重复性好等特点。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，所述五氟苯基色谱柱包括：Phenomenex Kinetex F5色谱柱，色谱柱的长度为100mm、内径为2.1mm、填料粒径为1.7μm。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，流速为0.80mL/min；所述洗脱过程如下述表1所示。

表1

表1中，流动相A为含0.5％甲酸的水溶液，流动相B为甲醇与乙腈的混合溶液，且甲醇与乙腈的体积比为1:4。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，分析时长为4-10min，柱温为30-50℃，进样量为5-50μL，流速为0.50-1.00mL/min。

举例来说，分析时长可以为4、5、6、7、8、9或10min。详细地，分析时长的长短受流动相流速大小的影响，比如当流速为1ml/min时，分析时长可缩短到4min。

举例来说，柱温可以为30、35、40、45或50℃，进样量可以为5、10、20、30、40或50μL，流速可以为0.50、0.60、0.70、0.80、0.90或1.00mL/min。

在本发明一个实施例中，所述检测条件中的串联质谱条件包括：APCI(+)检测模式，采集模式为MRM，气帘气压力为20-55psi，碰撞气压力为1-12psi，雾化电流值为1-5μA，离子化温度为200-750℃，雾化气压力为10-90psi；辅助气压力为0psi。

举例来说，气帘气压力可以为20、30、40、50或55psi，碰撞气压力可以为1、4、7、10或12psi，雾化电流值可以为1、2、3、4或5μA，离子化温度可以为200、350、500、600或750℃，雾化气压力可以为10、30、50、70或90psi。

通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需要预先配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出维生素K2(MK-7)的标准曲线方程。

详细地，可以结合检测的人群、待检测血液的用量、血液样本稀释程度、标准工作液稀释程度，以及人体内维生素K2(MK-7)的大致含量范围等，来设定线性范围，以保证大部分的临床样本检测结果落在可报告范围内。

在本发明一个实施例中，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的维生素K2(MK-7)标准品，标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度在0.3-153.6ng/mL范围内，不同标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度不同；利用移液器移取10μL标准工作液、10μL内标工作液置于离心管中，再移取加入所述稀释液80μL；将该离心管在转速为1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)下涡旋混匀0.5-1min(如30s、40s、50s或1min)后，得到标准溶液。

在本发明一个实施例中，优选地，各个标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度分别为0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL、2.4ng/mL、4.8ng/mL、9.6ng/mL、19.2ng/mL、38.4ng/mL、76.8ng/mL、153.6ng/mL。

详细地，拟合得到的维生素K2(MK-7)的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，维生素K2(MK-7)标准品与相应内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，维生素K2(MK-7)标准品与相应内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，维生素K2(MK-7)与其内标物的峰面积比值，以及待测样本中该内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中维生素K2(MK-7)的浓度。

通常情况下，标准曲线方程需要在每次检测之前重新测定，每次得到的标准曲线方程通常仅应用于当前次检测期间，比如在高效液相串联质谱仪的一次开关机期间，需测定一次标准曲线方程。

综上所述，本发明实施例提供了检测血液中维生素K2(MK-7)含量的方法，将内标法与高效液相色谱串联质谱法相结合，从而提高了定量结果的准确性，消除系统误差；样品前处理简单，大大节约样本前处理的时间，并节省了实验成本；结合特定的检测条件进行样本检测，使检测过程简便快速，样品分析时间缩短，更利于在临床治疗中对患者体内的维生素K2(MK-7)的含量进行监测，从而可为相关药物的个性化给药、减少或避免维生素K2(MK-7)缺乏症状的发生提供实验基础，从而更加利于指导患者用药。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。

实施例1

本发明实施例用于获取标准曲线方程。

1.1标准储备液的配制

精确称取维生素K2(MK-7)标准品2.33mg置于2mL容量瓶，用无水乙醇进行溶解并定容至2mL，得到标准储备液。其中，由于标准品质检报告标注纯度为95％，故得到的标准储备液中，维生素K2(MK-7)标准品的浓度为1.10675mg/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。

1.2内标储备液的配制

开封维生素K2(MK-7)-d7标准品0.25mg，加入1mL乙腈与200μL异丙醇溶解，得到内标储备液，其中，维生素K2(MK-7)-d7标准品的浓度为187.5μg/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

1.3检测用仪器

高效液相串联质谱仪：Sciex 6500plus。

1.4质谱条件

APCI(+)检测模式，采集模式为MRM，气帘气压力为20psi，碰撞气为9psi，雾化电流值为3μA，离子化温度为400℃，雾化气压力为65psi；辅助气压力为0psi。

基于此，质谱条件的其他参数请参考下述表2。

表2

表2中，MK-7表征维生素K2(MK-7)，IS/MK-7-d7表征维生素K2(MK-7)-d7，DP为正离子模式优化去簇电压，EP为聚焦电压，CE为碰撞电压，CXP为碰撞室射出电压。

1.5液相条件

1.5.1色谱柱

Phenomenex Kinetex F5色谱柱(2.1*100mm,1.7μm)。

1.5.2流动相

流动相A：含0.5％甲酸的水溶液；

流动相B：甲醇与乙腈的混合溶液，且甲醇与乙腈的体积比为1:4。

1.5.3洗脱方式

采用梯度洗脱，流动相比例及流速如上述表1所示。

1.5.4其他

在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M；分析时间为6.0min；柱温为40℃；进样量为20μL；流速为0.80mL/min。

1.6标准工作液的配制

取适量标准储备液，用稀释液(含0.1％甲酸与5％水的乙腈溶液，下同)进行稀释，配制成维生素K2(MK-7)标准品的浓度为0.3-153.6ng/mL的十个标准工作液，并在-80℃条件下保存。

其中，该十个标准工作液中，维生素K2(MK-7)标准品的浓度分别为0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL、2.4ng/mL、4.8ng/mL、9.6ng/mL、19.2ng/mL、38.4ng/mL、76.8ng/mL、153.6ng/mL。

1.7内标工作液的配制

吸取10μL内标储备液于1.5mL离心管中，加入615μL稀释液，在2500r/min的转速下涡旋混匀1min，得内标中间液；吸取100μL内标中间液于10mL容量瓶中，加入稀释液定容至10mL，振荡混匀，得到维生素K2(MK-7)-d7标准品的浓度为30ng/mL的内标工作液，并在-80℃条件下保存。

1.8标准溶液的配制

对于每一个标准工作液，用移液器移取10μL标准工作液、10μL内标工作液、80μL稀释液分别置于1.5mL离心管中，然后在转速为2500rpm下涡旋混匀1min后，得到混合液，移取该混合液作为待检测的标准溶液。

如此，针对十个标准工作液，可以得到十个标准溶液。

1.9检测标准溶液，生成标准曲线方程

得到各个标准溶液后，即可利用高效液相串联质谱仪对十个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图和质谱图。

请参考图3-图5，图3示出了一标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品的色谱图，图4示出了一标准溶液中维生素K2(MK-7)-d7的色谱图，图5示出了一标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品和维生素K2(MK-7)-d7的质谱图。

由图3-图5所示的色谱图可知，本发明实施例所述的检测方法对目标化合物识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。

从标准溶液的色谱图中，可以得到维生素K2(MK-7)标准品的色谱峰面积和维生素K2(MK-7)-d7的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中维生素K2(MK-7)标准品和维生素K2(MK-7)-d7的已知浓度，即可得到维生素K2(MK-7)的标准曲线方程。

请参考图9，图9示出了得到的维生素K2(MK-7)线性关系图。根据线性关系图，可以得到维生素K2(MK-7)的标准曲线方程：Y＝0.35X-0.0024，r＝0.9995，相关系数R²＞0.999，Y为维生素K2(MK-7)与维生素K2(MK-7)-d7的峰面积比，X为维生素K2(MK-7)与维生素K2(MK-7)-d7的浓度比。

可以看出，相关系数R²＞0.9900，表示线性关系良好。基于该标准曲线方程来计算血液中维生素K2(MK-7)含量时，准确性高，误差小。

得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中维生素K2(MK-7)的含量。

实施例2

本发明实施例用于检测血液中维生素K2(MK-7)的含量。

2.1获取血液样本

取待检测血液至少100μL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清，该血清作为血液样本，置于4℃冷藏下保存至分析前备用。

得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

2.2血液样本前处理

用移液枪移取血清100μL于2mL离心管中，然后加入内标工作液10μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；然后加入无水乙醇700μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合3min；然后加入正己烷800μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合5min，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取上清液至1.5mL离心管；用氮气吹干移取的上清液，再加入100μL稀释液进行复溶，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合1min后，再在14000rpm的转速下高速离心10min，移取高速离心得到的上清液90μL即得到待测样本。

2.3待测样本检测

在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相串联质谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图。

请参考图6-图8，图6示出了一待测样本中维生素K2(MK-7)的色谱图，图7示出了一待测样本中维生素K2(MK-7)-d7的色谱图，图8示出了一待测样本中维生素K2(MK-7)和维生素K2(MK-7)-d7的质谱图。

请参考图3至图8，待测样本中维生素K2(MK-7)的保留时间和维生素K2(MK-7)-d7的保留时间相一致，且分别与标准溶液中维生素K2(MK-7)的保留时间和维生素K2(MK-7)-d7的保留时间相比略有延迟，但延迟时间保持一致，本发明实施例提供的检测方法具有目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度、灵敏度高等优点。

2.4待测样本中维生素K2(MK-7)含量的计算

根据待测样本的色谱图中，维生素K2(MK-7)和维生素K2(MK-7)-d7的色谱峰面积，以及待测样本中维生素K2(MK-7)-d7的已知浓度，对应代入上述标准曲线方程，即可计算出待测样本中维生素K2(MK-7)的含量。

上述步骤1.6中配制的标准工作液中维生素K2(MK-7)标准品的浓度范围为0.3-153.6ng/mL，结合上述步骤1.8中所述的标准溶液配制过程和上述步骤2.2中所述的血液样本前处理过程，可知标曲稀释和样本处理存在10倍的换算关系，故可认为维生素K2(MK-7)的线性范围(临床可报告范围)为0.03-15.36ng/mL，维生素K2(MK-7)在0.03-15.36ng/mL范围内线性良好。

实施例3

本发明实施例用于检测血浆中维生素K2(MK-7)的含量。

上述步骤2.1中，是处理待检测血液以得到血清。与此不同，本发明实施例是处理待检测血液以得到血浆，以得到的血浆作为血液样本，而其他处理过程与上述实施例2保持一致。

通过检测血浆中维生素K2(MK-7)的含量，发现得到的检测结果与实施例2中得到的检测结果在允许的误差范围内保持一致。

实施例4

本发明实施例用于测定定量限和检测限。

选择低浓度的质控样本，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血液样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血液样本稀释液进行测定。经检测发现，维生素K2(MK-7)的检测限和定量限如下所示：

(1)检测限(LOD)：0.00606ng/mL。

(2)定量限(LOQ)：0.0202ng/mL。

本实施例中，维生素K2(MK-7)的检测限可低至0.00606ng/mL，定量限可低至0.0202ng/mL。可见，本发明实施例提供的检测方法灵敏度高，可以提高低浓度样本的平行性，增强准确度，可满足临床需求。

由于灵敏度高，故本发明实施例对待检测血液的样本量的要求会更加的宽泛，从而提高样本检测的整体准确度。此外，本发明实施例对维生素K2(MK-7)含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

此外，本发明实施例所提供检测方法的检测限和定量限均较低，且待检测血液的用量少，血液用量可低至100μL。可见，本发明实施例所提供检测方法可在实现人体血清/血浆中维生素K2(MK-7)含量正常检测的前提下，有效降低了血液样本用量。

实施例5

本发明实施例用于测定回收率和精密度。

分别取含维生素K2(MK-7)标准品的标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，重复分析测定3批次，维生素K2(MK-7)的回收率和精密度如表3所示。

表3

可以看出，维生素K2(MK-7)在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为95-102％，重现性良好，加样回收率良好，相对标准偏差为1.60-3.94％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。

基于上述内容可知，上述实施例2所述检测方法的检测限、定量限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

综上所述，本发明实施例提供的这一检测血液中维生素K2(MK-7)血药浓度含量的方法，将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，样品前处理简单，标曲无需前处理，大大节约样本前处理的时间，且定量准确、重现性好、特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，且成本低、分析时间短，符合临床需求，适用于临床大批量血液样本的检测，可为相关药物的个性化给药、减少或避免维生素K2(MK-7)缺乏症状的发生提供实验基础。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。