具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例涉及有机酸类内源性物质的检测，具体提供了一种检测血液中甲基丙二酸含量的方法，该检测方法不用于疾病的诊断与治疗，可以包括以下步骤：

步骤101：利用高效液相色谱串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的甲基丙二酸标准品及内标物，不同标准溶液中甲基丙二酸标准品的浓度不同。

请参考图2，图2示出了甲基丙二酸的化学结构式。

在本发明一个实施例中，优选地，上述高效液相色谱串联质谱仪可以选用Sciex6500plus。使用该仪器来检测血液中甲基丙二酸的含量时，可解决使用其他检测仪器时所容易产生的灵敏度不足、基线噪音较高的问题。

步骤102：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到甲基丙二酸的标准曲线方程。

步骤103：将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，其中，内标工作液中含有浓度已知的内标物，复溶液为含0-2％甲酸和0-20％乙腈的水溶液。

详细地，乙腈为沉淀剂，通过加入乙腈，可去除待检测样品中的蛋白杂质而保留甲基丙二酸。

详细地，考虑到甲基丙二酸为水溶性物质，故本发明实施例中的复溶液可以为纯水。以纯水作为复溶液时，可简化复溶液的配制，减少有机试剂的使用。

本发明实施例中，先将内标和血液样本混匀，再加入乙腈并混匀以沉淀蛋白，离心取上清后用加热氮吹的方式吹干上清，吹干后加入复溶液进行复溶，最后再离心取上清液即可得到待测样本。这一样本前处理不仅能够在最大程度保留甲基丙二酸的同时去除干扰物，而且简单易操作、耗时短，无需采用繁琐的衍生化处理即可得到待测样本，从而可对血液中甲基丙二酸的含量进行检测。此外，这一样本前处理的成本显著低于现有超滤离心前处理的成本，故而有益于保证较低的样品检测成本。

步骤104：利用高效液相色谱串联质谱仪，在相同检测条件下检测待测样本，得到待测样本的色谱图。

步骤105：根据待测样本的色谱图和甲基丙二酸的标准曲线方程，计算血液样本中甲基丙二酸的含量。

本发明实施例中，基于上述血液样本前处理过程，在保证检测效果的同时，可使得样本前处理简单化，操作简单，能够减少或避免操作带来的误差，从而能够更准确的定量。此外，由于该前处理方法操作简单且检测成本低，故有利于实际检测的应用及推广。

在本发明一个实施例中，优选地，上述步骤103中，所述将一定量的内标工作液和一定量的血液样本混匀，再加入一定量的乙腈并混匀，离心取上清液，通过加热氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的复溶液并混匀，离心取上清液得到待测样本，包括：

用移液枪移取50-200μL(如50、100、150或200μL)血液样本于1.5mL离心管中，该血液样本为经处理至少1mL待检测血液而得到的血清或血浆，再加入一定量(如10μL)的内标工作液，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合20s-2min(如20、40、60或120s)；

再加入200-800μL(如200、400、500、600或800μL)乙腈，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合1-5min(如1、2、3、4或5min)，再在10000-12000rpm(如10000、10500、11000、11500或12000rpm)的转速下高速离心5-12min(如5、7、9、10或12min)，移取上清液200-950μL(如200、400、600、800或950μL)至另一1.5mL离心管中；

在35-70℃(如35、40、50、60或70℃)下用氮气吹干上清液，然后加入50-200μL(如50、100、150或200μL)复溶液，在1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)的转速下涡旋震荡混合1-3min，再在4-10℃(如4、6、8或10℃)的温度下及10000-14000rpm(如10000、11000、12000、13000或14000rpm)的转速下高速离心5-12min(如5、7、9、10或12min)，取上清液得到待测样本。

本发明实施例中，复溶液可为含0-2％甲酸和0-20％乙腈的水溶液，复溶液的用量可为50-200μL。此外，复溶液进样体积小，复溶液中的甲酸含量对峰形影响小。

详细地，上述血液样本可经处理至少1mL待检测血液而得到。待检测血液的用量不高，可低至1mL，采血量较少，使得被检测者的采血体验好。通常情况下，可将血液样本置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，内标工作液中含0.5-20nmol/mL(如0.5、1、5、10或20nmol/mL)的甲基丙二酸-d3，添加量为10μL。

详细地，本发明实施例中优选使用甲基丙二酸的同位素作为内标物。其中，d3表征有3个H原子被氘原子取代。以甲基丙二酸-d3同位素标记物为内标物，使得血液样本的检测不易受基质等影响，故使得甲基丙二酸的识别更为准确，可使得分析时间短、干扰小，且内标定量适宜，特异性强、准确度和灵敏度高。

优选地，制备标准储备液、标准工作液、内标储备液和内标工作液时所使用的稀释液，均可以为含水量为5-60％的甲醇溶液。举例来说，稀释液中水分比例可以为5、10、20、30、40或60％。

在本发明一个实施例中，所述检测条件中的液相条件包括：己基-苯基色谱柱，流动相A为含0.4％甲酸和2mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱过程采用梯度洗脱的方式，分析时间为3-7min，柱温为20-45℃，进样量为3-20μL，流速为0.20-0.70mL/min。

举例来说，分析时间可以为3、4、5、6或7min，柱温可以为20、25、30、35、40或45℃，进样量可以为3、5、10、15或20μL，流速可以为0.20、0.30、0.40、0.50、0.60或0.70mL/min。

详细地，使用上述液相条件来检测血液中甲基丙二酸含量时，可以快速且较好的分离甲基丙二酸及其同分异构体杂质(丁二酸)，避免高浓度同分异构体杂质对甲基丙二酸的检测干扰，从而实现血液样本中甲基丙二酸含量的快速、准确检测。此外，使用该液相条件时，分析时间可在5.0min左右，分析时间短，以及可以具有批次间保留时间稳定、目标峰出峰效果好、分离效果的重复性好等特点。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，所述己基-苯基色谱柱包括：Phenomenex Gemini C6-Phenyl色谱柱，色谱柱的长度为150mm、内径为2.0mm、填料粒径为3μm。

本发明实施例中，使用上述色谱柱来检测血液中甲基丙二酸的含量，其填料特殊，内径小，柱长较长，可以实现甲基丙二酸与杂质丁二酸的良好分离。此外，与小粒径色谱柱相比，该色谱柱粒径中等，故不易堵塞，使用寿命长。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，流速为0.40mL/min；所述洗脱过程可以如下述表1所示。

表1中，流动相A为含0.4％甲酸和2mM甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。

表1

在本发明一个实施例中，所述检测条件中的串联质谱条件包括：ESI(-)检测模式，采集模式为MRM，气帘气压力为20-55psi，碰撞气压力为1-12psi，离子喷雾电压值为-1500至-4500V，离子化温度为200-750℃，雾化气压力为10-90psi，辅助气压力为10-90psi。

举例来说，气帘气压力可以为20、30、40、50或55psi，碰撞气压力可以为1、3、5、7、10或12psi，离子喷雾电压值可以为-1500、-2500、-3500或-4500V，离子化温度可以为200、350、500、650或750℃，雾化气压力可以为10、30、50、70或90psi，辅助气压力可以为10、30、50、70或90psi。

基于上述内容，在本发明一个实施例中，优选地，气帘气压力为20psi，碰撞气压力为5psi，离子喷雾电压值为-2000V，离子化温度为550℃，雾化气压力为80psi，辅助气压力为60psi。

通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需要预先配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出甲基丙二酸的标准曲线方程。

详细地，可以结合检测的人群、待检测血液的用量、血液样本稀释程度、标准工作液稀释程度，以及人体内甲基丙二酸的大致含量范围等，来设定线性范围，以保证大部分的临床样本检测结果落在可报告范围内。

在本发明一个实施例中，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的甲基丙二酸标准品，标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度在0.4-51.2nmol/mL范围内，不同标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度不同；利用移液器移取10μL标准工作液、10μL内标工作液置于离心管中，再移取加入所述复溶液80μL；将该离心管在转速为1000-2500rpm(如1000、1500、2000或2500rpm)下涡旋混匀0.5-1min(如30s、40s、50s或1min)后，得到标准溶液。

上面提到，复溶液可为纯水，即可使用纯水来溶解标品以制备标准溶液。

在本发明一个实施例中，优选地，各个标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度分别为0.4nmol/mL、0.8nmol/mL、1.6nmol/mL、3.2nmol/mL、6.4nmol/mL、12.8nmol/mL、25.6nmol/mL、51.2nmol/mL。

详细地，拟合得到的甲基丙二酸的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，甲基丙二酸标准品与相应内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，甲基丙二酸标准品与相应内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，甲基丙二酸与其内标物的峰面积比值，以及待测样本中该内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中甲基丙二酸的浓度。

通常情况下，标准曲线方程需要在每次检测之前重新测定，每次得到的标准曲线方程通常仅应用于当前次检测期间，比如在高效液相串联质谱仪的一次开关机期间，需测定一次标准曲线方程。

综上所述，本发明实施例提供了检测血液中甲基丙二酸含量的方法，将内标法与高效液相色谱串联质谱法相结合，从而提高了定量结果的准确性，消除系统误差；样品前处理简单，大大节约样本前处理的时间；仅使用常见的试剂及耗材即可实现样品前处理，使检测成本降低；结合特定的检测条件进行样本检测，使检测过程简便快速，样品分析时间缩短，更利于在临床治疗中对患者体内的甲基丙二酸的含量进行监测，以可快速准确的判断维生素B12补给量是否充足，从而可为相关药物的个性化给药、减少或避免维生素B12缺乏症状的发生提供实验基础，从而更加利于指导患者用药。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。

实施例1

本发明实施例用于获取标准曲线方程。

1.1标准储备液的配制

采购得到甲基丙二酸标准品溶液，即用乙腈溶解的甲基丙二酸标准品，得到标准储备液，其中，甲基丙二酸标准品的浓度为1mg/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

1.2内标储备液的配制

精密称量甲基丙二酸-d3标准品2mg于2mL容量瓶，加入含50％甲醇的水溶液进行溶解并定容至2mL，得到内标储备液，其中，甲基丙二酸-d3标准品的浓度为1000μg/mL，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。

1.3检测用仪器

高效液相串联质谱仪：Sciex 6500plus。

1.4质谱条件

ESI(-)检测模式，采集模式为MRM，气帘气压力为20psi，碰撞气为5psi，离子喷雾电压值为-2000V，离子化温度为550℃，雾化气压力为80psi；辅助气压力为60psi。

基于此，质谱条件的其他参数请参考下述表2。

表2

表2中，MMA表征甲基丙二酸，IS/MMA-d3表征甲基丙二酸-d3，DP为正离子模式优化去簇电压，EP为聚焦电压，CE为碰撞电压，CXP为碰撞室射出电压。

1.5液相条件

1.5.1色谱柱

Phenomenex Gemini C6-Phenyl色谱柱(2*150mm,3μm)。

1.5.2流动相

流动相A：含0.4％甲酸与2mM甲酸铵的水溶液；

流动相B：乙腈。

1.5.3洗脱方式

采用梯度洗脱，流动相比例及流速如上述表1所示。

1.5.4其他

在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M；分析时间为5.0min；柱温为25℃；进样量为5μL；流速为0.4mL/min。

1.6标准工作液的配制

取适量标准储备液，用稀释液(含50％甲醇的水溶液，下同)进行稀释，配制成甲基丙二酸标准品的浓度为0.4-51.2nmol/mL的八个标准工作液，并在-80℃条件下保存。

其中，该八个标准工作液中，甲基丙二酸标准品的浓度分别为0.4nmol/mL、0.8nmol/mL、1.6nmol/mL、3.2nmol/mL、6.4nmol/mL、12.8nmol/mL、25.6nmol/mL、51.2nmol/mL。

1.7内标工作液的配制

吸取400μL内标储备液于10mL容量瓶中，用稀释液定容，再在2500r/min的转速下涡旋混匀3min，得到内标中间液；吸取94.5μL内标中间液于5mL容量瓶中，加入稀释液定容至5mL，振荡混匀，得到甲基丙二酸-d3标准品的浓度为8nmol/mL的内标工作液，并在-80℃条件下保存。

1.8标准溶液的配制

对于每一个标准工作液，用移液器移取10μL标准工作液、10μL内标工作液、80μL复溶液(含1％甲酸与5％乙腈的水溶液，下同)分别置于1.5mL离心管中，然后在转速为2500rpm下涡旋混匀1min后，得到混合液，移取该混合液作为待检测的标准溶液。

如此，针对八个标准工作液，可以得到八个标准溶液。

1.9检测标准溶液，生成标准曲线方程

得到各个标准溶液后，即可利用高效液相串联质谱仪对八个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图和质谱图。

请参考图3-图5，图3示出了一标准溶液中甲基丙二酸标准品的色谱图，图4示出了一标准溶液中甲基丙二酸-d3的色谱图，图5示出了一标准溶液中甲基丙二酸标准品和甲基丙二酸-d3的质谱图。

由图3-图5所示的色谱图可知，本发明实施例所述的检测方法对目标化合物识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。

从标准溶液的色谱图中，可以得到甲基丙二酸标准品的色谱峰面积和甲基丙二酸-d3的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中甲基丙二酸标准品和甲基丙二酸-d3的已知浓度，即可得到甲基丙二酸的标准曲线方程。

请参考图9，图9示出了得到的甲基丙二酸线性关系图。根据线性关系图，可以得到甲基丙二酸的标准曲线方程：Y＝2.22X+0.00127，r＝0.9991，相关系数R²＞0.999，Y为甲基丙二酸与甲基丙二酸-d3的峰面积比，X为甲基丙二酸与甲基丙二酸-d3的浓度比。

可以看出，相关系数R²＞0.9900，表示线性关系良好。基于该标准曲线方程来计算血液中甲基丙二酸含量时，准确性高，误差小。

得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中甲基丙二酸的含量。

实施例2

本发明实施例用于检测血液中甲基丙二酸的含量。

2.1获取血液样本

取待检测血液至少1mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清，该血清作为血液样本，置于4℃冷藏下保存至分析前备用。

得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。

2.2血液样本前处理

用移液枪移取血清100μL于1.5mL离心管中，然后加入内标工作液10μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合1min；然后加入乙腈300μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合3min，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取上清液350μL至另一1.5mL离心管；在55℃下用氮气吹干移取的上清液，再用100μL复溶液进行复溶，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合1min后，再在10℃的温度下及在14000rpm的转速下高速离心5min，移取高速离心得到的上清液90μL即得到待测样本。

2.3待测样本检测

在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相串联质谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图。

请参考图6-图8，图6示出了一待测样本中甲基丙二酸的色谱图，图7示出了一待测样本中甲基丙二酸-d3的色谱图，图8示出了一待测样本中甲基丙二酸和甲基丙二酸-d3的质谱图。

请参考图3至图8，可知待测样本中甲基丙二酸的保留时间与标准溶液中甲基丙二酸标准品的保留时间相一致，待测样本中甲基丙二酸-d3的保留时间与标准溶液中甲基丙二酸-d3的保留时间相一致，且本发明实施例提供的检测方法具有目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度、灵敏度高等优点。

以及，请参考图6，待测样本中甲基丙二酸的保留时间在2.35min，而丁二酸的保留时间约为2.00min，两者相差约0.35min，说明两者的分离情况良好，实现了有效的色谱分离，且甲基丙二酸和丁二酸的色谱峰均无拖尾情况，说明对两者的检测效果良好，检测准确度高。基于此可以认为，虽然丁二酸为甲基丙二酸的同分异构体杂质，但在本发明实施例中，丁二酸并不会影响对甲基丙二酸的准确检测。

此外，由于甲基丙二酸及甲基丙二酸-d3的保留时间均在2.35min，故可使得分析时间可低至5min，甚至更低。

2.4待测样本中甲基丙二酸含量的计算

根据待测样本的色谱图中，甲基丙二酸和甲基丙二酸-d3的色谱峰面积，以及待测样本中甲基丙二酸-d3的已知浓度，对应代入上述标准曲线方程，即可计算出待测样本中甲基丙二酸的含量。

上述步骤1.6中配制的标准工作液中甲基丙二酸标准品的浓度范围为0.4-51.2nmol/mL，结合上述步骤1.8中所述的标准溶液配制过程和上述步骤2.2中所述的血液样本前处理过程，可知标曲稀释和样本处理存在10倍的换算关系，故可认为甲基丙二酸的线性范围(临床可报告范围)为0.04-5.12nmol/mL，甲基丙二酸在0.04-5.12nmol/mL范围内线性良好。

实施例3

本发明实施例用于检测血浆中甲基丙二酸的含量。

上述步骤2.1中，是处理待检测血液以得到血清。与此不同，本发明实施例是处理待检测血液以得到血浆，以得到的血浆作为血液样本，而其他处理过程与上述实施例2保持一致。

通过检测血浆中甲基丙二酸的含量，发现得到的检测结果与实施例2中得到的检测结果在允许的误差范围内保持一致。

实施例4

本发明实施例用于测定定量限和检测限。

选择低浓度的质控样本，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血液样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血液样本稀释液进行测定。经检测发现，甲基丙二酸的检测限和定量限如下所示：

(1)检测限(LOD)：0.01126nmol/mL。

(2)定量限(LOQ)：0.0379nmol/mL。

本实施例中，甲基丙二酸的检测限可低至0.01126nmol/mL，定量限可低至0.0379nmol/mL。可见，本发明实施例提供的检测方法灵敏度高，可以提高低浓度样本的平行性，增强准确度，可满足临床需求。

由于灵敏度高，故本发明实施例对待检测血液的样本量的要求会更加的宽泛，从而提高样本检测的整体准确度。此外，本发明实施例对甲基丙二酸含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例5

本发明实施例用于测定回收率和精密度。

分别取含甲基丙二酸标准品的标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，重复分析测定3批次，甲基丙二酸的回收率和精密度如表3所示。

表3

可以看出，甲基丙二酸在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为98-104％，重现性良好，加样回收率良好，相对标准偏差为1.47-2.02％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。

基于上述内容可知，上述实施例2所述检测方法的检测限、定量限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

综上所述，本发明实施例提供的这一检测血液中甲基丙二酸血药浓度含量的方法，将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，样品前处理简单，标曲无需前处理，大大节约样本前处理的时间，且定量准确、重现性好、特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，且成本低、分析时间短，符合临床需求，适用于临床大批量血液样本的检测，可为相关药物的个性化给药、减少或避免维生素B12缺乏症状的发生提供实验基础。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。