发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的是提供一种瘢痕疙瘩(keloid)或者增生性瘢痕(Hypertrophicscars)的预防或者治疗用药学组合物。

本发明的其他目的是提供一种瘢痕疙瘩(keloid)或者增生性瘢痕(Hypertrophicscars)的预防或者治疗方法。

本发明的其他目的是提供一种瘢痕疙瘩(keloid)或者增生性瘢痕(Hypertrophicscars)的预防或者治疗物质的筛查方法。

本发明的另一个目的是提供一种诊断瘢痕疙瘩(keloid)或者增生性瘢痕(Hypertrophic scars)的方法。

用于解决问题的方案

为了上述目的，发明人比较在增生性瘢痕组织及正常组织显示的多个蛋白质表达差异，从而假设显示非正常表达状态的蛋白质标志物为增生性瘢痕的原因，并且选择与正常组织显示不同表达状态的蛋白质。

由此，本发明提供一种瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕诊断用组合物，所述诊断用组合物包括测量由硫氧还蛋白5(TXNDC5)、PRRC1、钙囊素(S100A11)、半乳糖凝集素1(Galectin1)、丝氨酰胺A(Filamin A)、真核起始因子-5A(eIF-5A)、膜联蛋白A2(Annexin A2)及脂肪酸结合蛋白-5(FABP5)形成的群中选择的一个以上的基因，或者由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的蛋白质的表达量的物质。

并且，本发明提供一种瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕诊断方法，所述诊断方法包括如下步骤：在瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕的组织中，测量由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的基因，或者由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的蛋白质的表达量；以及将所述测量结果与从正常组织的所述基因及蛋白质的表达量进行比较。

所述基因或者蛋白质表达量的测量可通过本领域公知的多种方法实施。例如，可利用RT-PCR(Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual,3rd ed.ColdSpring Harbor Press(2001))、RNA印迹法(Peter B.Kaufma et al.,Molecular andCellular Methods in Biology and Medicine,102-108,CRC press)、利用cDNA微阵列的杂交反应(Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual,3rd ed.Cold SpringHarbor Press(2001))、免疫印迹或者在体(in situ)杂交反应(Sambrook等，MolecularCloning.A Laboratory Manual,3rd ed.Cold Spring Harbor Press(2001))实施。

还有，发明者在瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕及正常组织，将所述选择的蛋白质表达确认为免疫印迹和免疫组织化学染色。在瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕组织中降低(knock-down)编码所述蛋白质的各个基因时，确认了类型I胶原蛋白、α-SMA及PCNA蛋白质表达减少。这些结果支撑所述蛋白质的抑制或者编码此的基因的降低对瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕治疗非常有用。

由此，本发明提供一种瘢痕疙瘩(keloid)或者增生性瘢痕(Hypertrophic scars)的预防或者治疗用药学组合物，所述医学组合物包括将抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的基因的表达，或者抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的蛋白质活性的物质作为有效成分。

还有，本发明提供一种治疗具有瘢痕疙瘩疾病或者增生性瘢痕的个体的方法，所述方法包括投药的医学组合物，所述医学组合物包括作为具有增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩伤口的个体的(a)有效成分，抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的基因的表达，或者抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的蛋白质的活性的物质。

本发明中，抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的基因表达的物质可包括shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)、siRNA(small interference RNA，小干扰RNA)、miRNA(microRNA，微小RNA)、Crispr-cas9、Crispr-cpf1、核酶(ribozyme)、脱氧核梅(DNAzyme)、PNA(peptide nucleic acids，肽核酸)、反义寡核苷酸，抑制由所述基因表达的蛋白质活性的物质可包括抗体、适体、天然提取物或者化学物质，只要是抑制所述基因的表达及蛋白质活性的物质，可以不受限制地包括在内。

本说明书中使用的术语“shRNA(short hairpin RNA)”作为具有45至70核苷酸长度的单条线的RNA，在目标基因siRNA碱基序列的意义(sense)与互补的无义之间合成连接3-10个碱基连接肽(linker)的寡核苷酸DNA之后克隆到质粒载体，或者将shRNA插入到逆转录病毒的慢病毒(lentivirus)及腺病毒(adenovirus)并进行表达，则制成具有循环的发夹结构的shRNA，并由细胞内的Dicer转换成siRNA显示RNAi效果。

本发明中的术语“siRNA”意味着妨碍RNA或者可介导基因沉默的核酸分子(参照WO00/44895、WO01/36646、WO99/32619、WO01/29058、WO99/07409及WO00/44914)。siRNA可以抑制目标基因的表达，因此被提供为有效的基因降低方法或者基因治疗方法。siRNA在植物、蠕虫、果蝇及寄生虫首次被发现，并且最近开发/利用siRNA应用于哺乳类细胞研究(Degot S,et al.2002；Degot S,et al.2004；Ballut L,et al.2005)。

本发明的siRNA分子可具有意义线(在所述各基因mRNA序列相应的(corresponding)序列)与反义线(在所述各基因mRNA序列互补的序列)位于相互的相反侧形成的双链结构。还有，本发明的siRNA分子可具有具备自补(self-complementary)意义及反义线的单链结构。siRNA不限定于只在RNA之间配对形成的双链RNA部分的完全配对，可包括由错误配对(对应的碱基不互补)、凸起(没有对应于一侧链条的碱基)等，未形成配对的部分。整个长度是10至100碱基，优选为15至8碱基，更有选为20至70碱基，最优选为20-30碱基。

在本发明使用的术语“miRNA(microRNA)”作为21-25核苷酸的单条线RNA分子，是通过目标mRNA的破坏或者解毒步骤中的抑制控制真核生物的基因表达的调节物质。这些miRNA由两个步骤的过程形成。miRNA初级转录物(primary miRNA)在核内通过Drosha的RNase III类型酶，被制作成70-90碱基程度的茎环结构，即premiRNA，之后移动至细胞质通过Dicer酶被切断制作21-25碱基的成熟的miRNA。如此形成的miRNA互补地结合在mRNA作用为转录后基因抑制器(post-transcriptional gene suppressor)，并且诱导翻译抑制和mRNA不稳定性。miRNA涉及多种生理学现象及疾病。

在本说明书使用的术语“反义寡核苷酸”意味着在特定mRNA的序列含有的互补核算序列的DNA或者RNA，或者这些衍生物，结合在mRNA内的互补序列，其作用为妨碍mRNA作为蛋白质的翻译。本发明的反义序列意味着在所述各基因互补，且可结合在所述各基因mRNA的DNA或者RNA序列，可妨碍对所述基因mRNA的翻译、细胞质内的转位(translocation)、成熟(maturation)或者其他所有整体生物学功能的必要活性。反义核酸的长度可以是6至100碱基，优选为8至60碱基，更有选为10至40碱基。

根据本发明的一个具体示例，所述物质可以是siRNA。更具体地，降低硫氧还蛋白-5的siRNA可由sense 5'-GGCCCUAACUAGAGUUCUAtt-3'(SEQ ID NO.1)及反义5'-UAGAACUCUAGUUAGGGCCtt-3'(SEQ ID NO.2)；降低PRRC1的两种siRNA由sense 5'-CAAGAAGACCCUAGAAUUAtt-3'(SEQ ID NO.3)及反义5'-UAAUUCUAGGGUCUUCUUGtt-3'(SEQ IDNO.4)及sense5'-UAUCAAAUCUGGUGAAtt-3'(SEQ ID NO.5)及反义siRNAUUCACCUCCAGAUUUGAUAtt-3'(SEQ ID NO.6)；并且降低钙囊素的siRNA由senseGAACUAGCUGCCACAAtt-3'(SEQ ID NO.7)、反义5'-UUGUGAAGGCAGCUAGUUCtt-3'(SEQ IDNO.8)的碱基序列形成。

在本说明书中术语“治疗”意味着(i)瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕的预防；(ii)抑制或者改善瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕的形成；以及(iii)根据抑制或者改善瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕的形成的相关疾病或者疾病的缓解。在本说明书中术语“治疗学有效量”意味着达到所述药理效果的充分的量。

根据本发明的其他方面，本发明提供一种瘢痕疙瘩性(keloid)疾病或者增生性瘢痕的预防或者治疗用药学组合物，所述药学组合物包括(a)作为有效成分抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的基因表达，或者抑制由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的蛋白质活性的物质的治疗学有效量；以及(b)药学上允许的载体(carriers)。

包括在本发明的组合物的药学上允许的载体作为通常用于制剂中，包括：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。本发明的药学组合物除了所述成分之外，还可包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

本发明的药学组合物优选为投药在肠胃外，例如，利用静脉内投药、腹腔内投药、肿瘤内投药、肌肉内投药、皮下投药、肝门静脉投药、肝动脉投药或者局部透药进行投药。

本发明的药学组合物的适当的投药量可由如制剂方法、投药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、饮食、投药时间、投药路径、排泄速度及反应感应性要素多样化，并且通常熟练的医生可便于确定及处方对目标治疗的有效投药量。

根据本领域技术人员便于实施的方法，本发明的药学组合物利用药学上允许的载体和/或赋形剂而被制剂，从而以单位容量的形态制造或者装在多容量容器内进行制造。此时，剂型可以是油或者水性介质中的溶液、悬浮液或者乳液形态或者抽取物、粉末、颗粒、片剂或者胶囊剂形态，还可包括分散剂或者稳定剂。

本发明的药学组合物可用于瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕改善或者治疗用皮肤外用剂。在此情况下，根据身体部位，其剂型不被特别的限定。具体地，例如可以是具有软化乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、面膜、凝胶或者皮肤粘附型化妆料的剂型的化妆料组合物，并且可以是如乳液、软膏、凝胶、霜剂、贴剂或者喷雾剂的透皮投药性剂型。并且，在由各剂型的外用剂组合物中，除上述的本发明的药剂组合物以外的其他成分，根据其他皮肤外用剂的剂型或者使用目的等，本领域的技术人员可方便地进行选择并组合，并且此时与其他原料同时使用时，可产生上升效果。

此外，本发明可提供包括如下步骤的瘢痕疙瘩(keloid)疾病或者增生性瘢痕的预防或者治疗物质的筛查方法。作为(a)对于在瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕细胞进行试验物质处理的步骤；以及(b)从所述试验物质处理的组织或者细胞中分析由硫氧还蛋白5、PRRC1、钙囊素、半乳糖凝集素1、丝氨酰胺A、真核起始因子-5A、膜联蛋白A2及脂肪酸结合蛋白-5形成的群中选择的一个以上的蛋白质的活性或者编码所述蛋白质的基因的表达量的步骤，与在正常组织的所述蛋白质活性或者编码此的基因的表达状态不同时，可将所述试验物质判断为瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕的预防或者治疗物质。

根据本发明的方法，首先在瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕组织接触所要分析的试验物质。提及本发明的筛查方法所使用的术语“试验物质”意味着为了检查所述基因的表达量或者所述蛋白质的量或者是否影响活性而用在筛查的未知的物质。所述试验物质包括化学物质、核苷酸、反义RNA、shRNA、miRNA、siRNA(small interference RNA，小干扰RNA)及天然物提取物，但不限定于此。

接着，从试验物质被处理的组织或者细胞，分析细胞内的所述基因及这些蛋白质的表达量。测量结果为细胞内的所述基因的表达减少或者蛋白质的活性或者表达减少时，可将所述试验物质判定为瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕的预防或者治疗物质。

发明效果

本发明澄清可成为瘢痕疙瘩或者增生性瘢痕原因的参与伤口部位的非正常胶原蛋白形成的蛋白质，可利用相应蛋白质或者编码此的基因准确地诊断增生性瘢痕。还有，提供抑制所述蛋白质或者基因的表达及活性的物质，从而可有效地利用在瘢痕疙瘩性或者增生性瘢痕的改善或者治疗。