具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、种植体骨整合模型的建立

本实验动物严格按照青岛大学附属医院伦理委员会的规定进行。健康雄性新西兰白兔5-6个月，体重约3.5kg，随机分为对照组、低剂量普萘洛尔组(0.1mg/kg)、中剂量普萘洛尔组(1mg/kg)和高剂量普萘洛尔组(10mg/kg)。

普萘洛尔组皮下注射，术前将普萘洛尔靠近手术部位，对照组连续28天给予等量生理盐水。随后在兔胫骨干骺端接受常规手术腔准备，并使用植入机插入直径为3.4mm的纯钛种植体。一个在左后腿，另一个在右后腿，长度分别为8mm。术后第1天至第3天，每组兔皮下注射盐酸丁丙诺啡(0.03mg/kg)和多西环素(3.2mg/kg)，术后均愈合良好。植入后皮下注射普萘洛尔28天。在X线检查后，处死各组家兔，取出完整的胫骨组织进行后续实验。

2.骨髓间充质干细胞BMSCs的提取

将两只实验兔脱颈，置于75％酒精中15min。无菌条件下将兔的胫骨和股骨分离，放入PBS溶液中。立即取出结缔组织和骨膜，用无血清DMEM培养液冲洗髓腔，并将其转移至含有15％血清DMEM的离心管中。冲洗至髓腔变白，1000r/min超声振摇5min，弃上清液，加入含15％FBS的H-DMEM制备细胞悬浮液。细胞悬浮液吹匀后种植入培养瓶内，24h后更换新培养液。每2至3天更换新培养液一次。

3.茜素红染色鉴定

体外培养的BMSCs和OBs的完整培养基均含有50nM异丙肾上腺素，用于模拟交感神经的作用。将提取的BMSCs在完整培养基中培养24h后，用含有50nm异丙肾上腺素和普萘洛尔的的成骨分化培养基替换培养7天，随后进行矿化结节染色-茜素红染色。

染色具体步骤如下：丢弃原培养基，用PBS溶液进行三次洗涤，然后用4％多聚甲醛溶液固定20min。最后用PBS溶液冲洗干净，用0.1％茜素红色染料37℃下补充染色30min，然后用自来水冲洗，镜检。

4.碱性磷酸酶(ALP)染色

3周后，将细胞接种到培养皿中，按试剂盒说明书配置所需试剂，倒掉原培养基，用固定培养基固定标本3min；然后将底物溶液加入培养皿中，疏水膜覆盖，37℃烘箱中黑暗孵育15min，然后冲洗干净。最后，加入染料染色3min，自来水冲洗样品，镜检。

5.细胞增殖受EDU的影响

1×10⁷细胞接种于6孔板中培养。细胞培养过夜后，在终浓度为10μM时加入EDU，再孵育2小时，取出培养基；室温下用1ml 4％多聚甲醛的固定液固定细胞15min。取固定培养基后，每井加入洗涤液1ml，每次3-5min，对细胞进行3次洗涤；然后用内源性过氧化物酶阻断液在室温下孵育20分钟，使内源性过氧化物酶失活。然后用洗涤液冲洗细胞3次，每次2分钟。

6.流式细胞术对细胞增殖的影响

密度为1.5×10⁵/mL的细胞接种于直径为35mm的培养皿中1天。在含有0.4％FBS的培养基中同步3天，使大部分细胞进入G0期。加入1.0mg/mL的BrdU储存液，使其终浓度为0.03μg/mL，37℃下孵育40min，弃去培养基。细胞收集到流动管中，1000r/min下离心5min，弃去上清液。每管用1m l4％多聚甲醛固定15min，2000r/min离心10min，弃去上清液。每管加入2mL甘氨酸，水清洗后加入1mL 0.5％的Triton，孵育10min。然后用PBS洗涤3次，每次，1000r/min下离心5min，细胞重新悬浮，用流式细胞仪检测。

7.q PCR检测

用TAKARA试剂盒进行逆转录反应，反应体系为RNA，2.2μg；寡糖T，2μL；dNTP，4μL；5×缓冲液，4μL；反转录酶，1μL；RNA酶抑制剂，0.5μL；RNA酶双蒸水，20μL。反应条件为25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min。

按照青岛生物技术公司的QPCR试剂盒的说明书进行QPCR实验。反应体系为正向引物，0.4μL；反向引物，0.4μL；SYBR绿色，10μL；H₂O，5.2μL。反应条件为50℃2min，95℃10min，95℃30sec，60℃30sec，循环40次。

使用的引物如下：BMP2-F：5‘-TGGAAGGGCCCATTTAGAG-3’，

BMP2-R：5’-GC TTTT CTCTGTGTGGAGC-3’；

运行X2-F，5‘-TTACCTACACCCC GCCAGTC-3’；

运行X2-R，5‘-TGCTGGTCTGGAAGGGTCC-3’；

科尔-1-f，5‘-ggcttcagtggttggatg-3’，

col-1-r，5’-caccaacagcaccatcgtta-3’；

OCN-f，5’-gctctgtctctctcacaca-3’；

ocn-r，5’-ccctcctgctggacatgaa-3’；

β2-AR-F，5′-GATCAAGCTTATGGGGCAACCCGGGAACGGCAGC-3′，

β2-AR-R，5‘-gatcgtcgaccagcagtagataa gggg attg-3’。

8.westernblot检测蛋白质表达水平

在从肾脏组织中提取总蛋白后，用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，分别孵育抗BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR抗体，并孵育相应的二次抗体。随后通过ECL发光检测蛋白带。使用的抗体如下：BMP2(稀释1：500，BM19970，IGEE，中国)，RunX2(稀释1：500，BM16360，IGEE，中国)，COL-1(稀释1：500，BM2319，IGEE，中国)，OC N(稀释1：500，BM18692，IGEE，中国)，β2-AR(稀释1：500，BMP0265，IGEE，中国)和β-肌动蛋白(稀释1：2000，BMC026，IGEE，中国)。HRP山羊抗兔IgG(稀释1：2000，BMS014，IGEE，中国)。

9.免疫荧光检测

将4μm厚度的石蜡切片60℃烘烤2h，脱蜡，用二甲苯和酒精水化。切片置于柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行抗原修复，在微波炉中加热20min，保持原状自然冷却至室温。PBS洗涤3次，每次5min。采用5％BSA阻断30min。加入一次抗体，4℃放置过夜。用PBS洗涤3次，复温30min，每次5min。加入相应的二次抗体(，室温孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min。用DAPI在黑暗中孵育5-10min。PBS洗涤3次，每次1min。切片在荧光显微镜下进行阻断，观察，拍照。使用的抗体如下：BMP2(稀释1：100，BM19970，IGEE，中国)，RunX2(稀释1：100，BM16360，IGEE，中国)，COL-1(稀释1：100，BM2319，IGEE，中国)，OC N(稀释1：100，BM18692，IGEE，中国)。HRP山羊抗兔IgG(稀释1：1000，BMS014，IGEE，中国)。

10.统计分析

用SPSS23.0软件对实验数据进行统计分析。测量数据以平均±标准差(x±s)表示，同一组治疗前后采用配对T检验。方差分析进行组间比较。其中P<0.05被认为差异显著，P<0.01被认为差异极显著。

实验结果

1.普萘洛尔可促进种植体的骨整合

在新西兰白兔中建立了种植体骨整合模型，并向家兔注射不同剂量的普萘洛尔(0.1mg/kg，1mg/kg，10mg/kg)。术后14天，用X线检查骨组织与种植体结合和骨组织吸收情况。结果如图1a、b所示，结果表明，种植体与骨组织的联合优于对照组，注射普萘洛尔后，种植体与骨组织的联合效应以与普萘洛尔剂量无关的方式增加。

采集种植体附近的骨组织样品，用qPCR检测BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的mRNA表达。检测结果如图1c、d，结果表明，普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN的mRNA表达，降低β2-AR的表达。用westernblot检测BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的蛋白表达，结果与qPCR一致。

2.普萘洛尔抑制MSCs的增殖，促进OBs的增殖

为阐明普萘洛尔对MSCs和OBs增殖的影响，体外培养MSCs和OBs。在含有异丙肾上腺素的完整培养基条件下，加入不同浓度的普萘洛尔孵育24小时，用EDU染色检测细胞增殖。结果如图2a、b所示，结果表明：在MSCs中，随着普萘洛尔的加入，EDU的阳性率显著下降，10μM普萘洛尔组EDU的阳性率最低，表明普萘洛尔抑制MSCs的增殖。如图2c、d所示，在OBs中，添加普萘洛尔可促进细胞增殖，0.1μM普萘洛尔可显著提高OBs中EDU的阳性率，1μM和10μM普萘洛尔组EDU的阳性率接近。上述结果表明，普萘洛尔抑制MSCs的增殖，促进OBs的增殖。

3.普萘洛尔抑制MSCs的迁移，促进OBs的迁移

然后通过细胞划痕试验检测普萘洛尔对细胞迁移的影响，并分别在24小时和48小时观察划痕愈合情况。试验结果表明，当普萘洛尔加入到含有异丙肾上腺素的完整培养基中时，MSCs在体外培养的MSCs和OBs中的迁移受到抑制。此外，划痕的愈合速度明显慢于对照组，浓度越高，划痕的愈合速度越慢(图3A-3B)。相反，普萘洛尔可以提高OBs中划痕的愈合率，细胞迁移程度高于对照组(图3C-3D)。这些结果提示普萘洛尔抑制MSCs迁移，促进OBs迁移。

4.普萘洛尔促进MSCs和OBs的成骨分化

为了阐明普萘洛尔对MSCs和OBs成骨分化的影响，在体外培养的MSCs和OBs中，将不同浓度的普萘洛尔补充到含有异丙肾上腺素的成骨分化培养基中。诱导7天后，用茜素红染色检测细胞成骨分化。有趣的是，我们发现普萘洛尔可以促进MSCs和OBs的成骨分化，并在诱导后增加细胞内钙结节。普萘洛尔处理细胞的钙含量和ALP活性明显高于对照组(图4A-4F)。

5.普萘洛尔对成骨相关基因的调控作用

接下来，为了阐明普萘洛尔调节MSCs和OBs的成骨机制，我们通过免疫荧光检测了成骨相关基因BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的表达。结果表明，普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN的蛋白表达，并以剂量依赖性的方式降低β2-AR的表达(图5A-5H)。的qPCR和westernblot结果与免疫荧光结果一致，表明普萘洛尔可以上调成骨基因的表达，促进MSCs和OB的成骨分化(图6A-6D)。

早期快速骨整合被认为是成功植入的关键，但它受到材料表面本身的生物惯性、高弹性模量和有限的生物效应的限制。因此，如何提高钛种植体的性能，促进和加速骨结合仍是近年来许多学者关注的焦点。虽然钛和钛合金种植体在医学领域取得了巨大的成功，但感染和骨整合不良仍然是种植体手术失败的两个主要原因。除了改善种植体材料外，通过药物辅助方法改善种植体早期骨整合具有很大的潜在价值。

交感神经系统作为人体自主神经系统的一个组成部分，在调节生命活动和身体稳态方面起着至关重要的作用。越来越多的证据表明，交感神经系统参与了骨重塑的过程。骨组织交感神经调节的组织学基础在于其对骨组织和骨细胞的神经支配。相关实验证明了交感神经纤维在骨和骨膜上的存在。现有技术表明：通过组织化学和荧光电镜观察兔骨组织，发现骨内血管表面覆盖着丰富的肾上腺素能神经纤维。成熟大鼠的骨组织中存在交感神经，用免疫组织化学染色观察交感神经中存在NE和神经肽Y。指出了交感神经的分布特征，即交感神经纤维大多位于血液流动丰富的骨髓腔中，而骨膜中的交感神经纤维较少。研究证实，瘦素可以调节骨形成和骨吸收，瘦素的这种作用是通过交感神经实现的。交感神经兴奋时，可促进骨吸收，减少骨形成。这种作用取决于成骨细胞表面的β2-肾上腺素能受体。免疫荧光技术β2受体位于人成骨细胞表面。此外，还发现β2受体激动剂能抑制成骨细胞的增殖。

普萘洛尔被公认为治疗高血压的药物，是治疗心血管疾病的首选药物之一。近年来，普萘洛尔对骨代谢的影响逐渐引起学者们的关注。现有报道表明：普萘洛尔治疗9周的外科骨折大鼠的矿物质沉积和骨形成增加。小剂量普萘洛尔在治疗骨质疏松症方面具有明显的优势。一些流行病学研究还表明，β2-AR阻滞剂是治疗骨质疏松症和骨折的潜在候选药物。

本发明探讨了β-AR阻滞剂普萘洛尔对细胞水平动物模型成骨的影响。结果表明，普萘洛尔能促进种植体的骨整合，增强MSCs和OBs的成骨分化。普萘洛尔可促进骨代谢和骨量，提高其疗效。

本发明表明普萘洛尔可提高BMP2、RunX2、COL-1和OCN在组织和细胞中的表达，同时降低β2-AR的表达。这一结果也为普萘洛尔的调节机制提供了新的思路。

目前关于不同浓度下普萘洛尔对成骨作用的作用及其作用机制的研究仍存在争议。本申请实验说明：中(1mg/kg)、高(10mg/kg)浓度相较于低(0.1mg/kg)浓度下的普萘洛尔对成骨作用的促进作用显著增强(p＜0.01)，但高浓度组并未表现出比中浓度组更佳的成骨效果(p＞0.05)。这能够给临床上药物的应用带来指导作用。

本发明表明，β受体阻滞剂普萘洛尔通过调节成骨相关蛋白BMP2、RunX2、COL-1、OCN和β2-AR的表达，促进OBs和MSCs的成骨分化，增强种植体的骨整合。有望为普萘洛尔的应用和调控机制提供新的见解。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。