雷帕霉素在制备治疗中耳炎药物中的应用
阅读说明：本技术 雷帕霉素在制备治疗中耳炎药物中的应用 (Application of rapamycin in preparing medicine for treating otitis media ) 是由 李博 郑庆印 赵彤 郑体花 张肖林 奎丽红 于 2021-03-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了雷帕霉素在制备治疗中耳炎药物中的应用,属于医药技术领域。雷帕霉素可减轻中耳炎炎症和听力损失,降低自噬体蛋白LC3-II和自噬底物蛋白p62的积累,治疗效果显著；并且其无肾毒性,在研发治疗中耳炎的药物方面具有广阔前景。(The invention discloses application of rapamycin in preparing a medicament for treating otitis media, and belongs to the technical field of medicines. Rapamycin can relieve inflammation and hearing loss of otitis media, reduce accumulation of autophagosome protein LC3-II and autophagy substrate protein p62, and has remarkable treatment effect; and the medicine has no nephrotoxicity, and has wide prospect in the aspect of researching and developing medicines for treating otitis media.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及雷帕霉素在制备治疗中耳炎药物中的应用。
背景技术
中耳炎(Otitis medium,OM)为累及中耳(包括咽鼓管、鼓室、鼓窦及乳突气房)全部或部分结构的炎性病变，是临床上最常见的儿童疾病之一，可导致颅内外严重的并发症。OM的发病机制与免疫系统功能障碍、遗传易感性、病原体暴露、咽鼓管功能障碍等多种因素有关，确切发病机制目前尚不清楚。
雷帕霉素(RPM)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，无肾毒性，毒副作用小，可抗真菌、抑制肿瘤生长，也可通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应，用于治疗器官移植的排斥反应。
目前尚无使用雷帕霉素治疗中耳炎的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明首次提出了雷帕霉素在制备治疗中耳炎药物中的应用。
Toll样受体2(Tlr2)参与OM炎症的启动和清除；如无Tlr2的参与，会加重炎症反应，延长疾病病程。本发明通过鼓膜穿刺将链球菌肽聚糖多糖(PGPS)接种到Tlr2tm1Kir(Tlr2-/-)小鼠(敲除Tlr2基因)中耳，构建成OM小鼠模型；与野生型(WT)小鼠相比，接种PGPS的OM小鼠能够表现出严重而持久的炎症和组织损伤，其所表现出OM症状相对稳定，为药物筛选和研究预防和治疗机制提供了较长的时间窗口。
对OM小鼠施用RPM，经(听觉脑干反应)ABR和鼓室测量以及中耳组织学分析，RPM能够减轻OM炎症症状，并能够挽救听力损失。
进一步研究其作用机制，发现PGPS诱导的OM小鼠发生自噬降解功能障碍(LC3-II和p62蛋白累积增加)，而RPM治疗减轻了自噬降解功能障碍；因此，RPM的治疗作用可能与调节mTORC1和/或自噬活性有关。
进一步地，以雷帕霉素为药效成分制备治疗中耳炎的药物，还可添加药学上可接受的辅料。
有益效果：雷帕霉素可减轻中耳炎炎症和听力损失，降低自噬体蛋白LC3-II和自噬底物蛋白p62的积累，治疗效果显著；并且其无肾毒性，在研发治疗中耳炎的药物方面具有广阔前景。
附图说明
图1所示为各组ABR波形图；
图2所示为各组ABR阈值；
图3所示为各组I波潜伏期；
图4所示为各组H&E染色图；
图5所示为各组小鼠中耳(ME)内炎症细胞相对覆盖面积；
图6所示为各组免疫组化染色图；图中EC为中耳上皮；
图7所示为各组western blot条带；
图8所示为各组蛋白积累量。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1.OM小鼠模型构建与RPM治疗
Tlr2tm1Kir(Tlr2-/-)小鼠(来源于Jackon Lab)随机分为4组，每组5只，各组小鼠施用药物如下：
NS+DMSO组：生理盐水+0.0032％DMSO；
PGPS组：生理盐水+60μgPGPS；
PGPS+0.35μM RPM组：生理盐水+60μgPGPS+0.0032％DMSO+0.35μM RPM；
PGPS+0.7μM RPM组：生理盐水+60μgPGPS+0.0032％DMSO+0.7μM RPM；
各组药物统一经鼓膜穿刺注射于小鼠右耳中耳，注射剂量10μL，注射后第3天对小鼠中耳及内耳组织进行功能及机制研究。
2.听觉脑干反应(ABR)和鼓室测量
在注射后第3天对各组实验小鼠的ABR和鼓室测量进行评估。
用计算机辅助诱发电位系统(IHS3.30 Intelligent Hearing Systems,Miami,FL,USA)来测量ABR阈值(指识别清晰和可重复波形的最低刺激水平)。具体地，click、8kHz、16kHz和32kHz的音频通过耳机插入右耳。
鼓室测量使用MT 10鼓室仪(Interacoustics,Assens,Denmark)。
实验结果如图1-3所示，相较于NS+DMSO组，PGPS组OM小鼠ABR阈值明显升高，I波潜伏期延后；而经RPM治疗后OM小鼠听力损失显著减轻。
3.中耳组织学分析
注射后第3天处死各组实验小鼠，解剖右耳耳泡(包括中耳和内耳)，进行病理检查。
具体地，耳泡组织用4％多聚甲醛在4℃下固定24小时，用10％EDTA溶液脱钙5天，包埋石蜡；石蜡切片用苏木精-伊红(H&E)染色，光镜下观察。
结果如图4-5所示，相较于NS+DMSO组，PGPS组OM小鼠中耳部分炎症细胞覆盖面积显著增加，而经RPM治疗后炎症明显减轻。
4.免疫组化实验
各组小鼠右侧耳泡用4％多聚甲醛固定，脱钙后再包埋石蜡；耳泡组织切片5-7μm，脱蜡、复水和抗原恢复后，用抗p62抗体进行免疫组织化学染色(Abcam,ab56416,Cambridge,England,UK)。
样品载玻片在光学显微镜下观察，并使用LAS X软件(Leica DM4500 B,LeicaMicrosystems Inc.，Buffalo Grove,IL,USA)成像。
结果如图6所示，相较于NS+DMSO组，PGPS组OM小鼠中耳上皮增厚，大量积累p62蛋白，而经RPM治疗后，中耳上皮厚度降低，p62蛋白积累量明显减少。
5.Western blot
各组小鼠耳泡组织用RIPA裂解缓冲液和提取缓冲液裂解(Thermo FisherScientific,89900,Rockford,IL,USA)，获得蛋白提取物。取30-50μg蛋白提取物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移到PVDF(Merck Millipore,IPVH00010)上，在15V下用半干燥转移系统转移40分钟，用5％的脱脂奶粉封闭膜，然后在4℃下用以下一抗进行过夜检测：抗LC3b(Novus bioicals,NB100-2220)、抗p62(Abcam,ab56416)、抗TNF-α(Proteintech,17590-1-AP)和抗GAPDH(Proteintech,10494-1-AP)。
用Tris缓冲的Saline-Tween 20(TBS-T)洗涤后，用物种特异性二抗和辣根过氧化物酶在室温下孵育膜1小时。使用HRP化学发光底物试剂盒(Merck Millipore,WBKLS0100)检测western blot条带，并使用ChemiDoc XRS+系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行观察。如Miller(http://lukemiller.org/journal/2007/08/quantifying-western-blots-without.html)所述，利用美国国立卫生研究院的ImageJ软件对蛋白条带的灰度值强度进行测量和量化。
结果如图7、8所示，经RPM治疗后，TNF-α、LC3-I、LC3-2、p62蛋白积累量相较于PGPS组明显减少。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。