牛磺熊脱氧胆酸在治疗新生儿坏死性小肠结肠炎中的应用
阅读说明：本技术 牛磺熊脱氧胆酸在治疗新生儿坏死性小肠结肠炎中的应用 (Application of tauroursodeoxycholic acid in treatment of neonatal necrotizing enterocolitis ) 是由 付东 李朋 于 2021-01-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)或其药学上可接受盐在制备预防或治疗新生儿坏死性小肠结肠炎的药物中的新用途,TUDCA对新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)引起的内质网应激起到很好的保护作用,CHOP和BiP在TUDCA作用下显著降低,TUDCA干预可维持NEC模型新生小鼠的体重,降低小肠上皮细胞凋亡,提高NEC模型新生小鼠的存活率。本发明通过细胞和凋亡水平实验,证实TUDCA在NEC中可以通过抑制内质网应激、降低细胞凋亡比例,从而起到对NEC的保护作用,这为采用TUDCA进行新生儿坏死性小肠结肠炎的防治奠定了理论基础。(The invention provides a new application of tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) or pharmaceutically acceptable salts thereof in preparing a medicine for preventing or treating neonatal necrotizing enterocolitis, the TUDCA plays a good role in protecting endoplasmic reticulum stress caused by neonatal Necrotizing Enterocolitis (NEC), CHOP and BiP are remarkably reduced under the action of the TUDCA, and TUDCA intervention can maintain the weight of a neonatal mouse of an NEC model, reduce the apoptosis of epithelial cells of the small intestine and improve the survival rate of the neonatal mouse of the NEC model. The invention proves that TUDCA can play a role in protecting NEC by inhibiting endoplasmic reticulum stress and reducing apoptosis ratio in NEC through cell and apoptosis level experiments, which lays a theoretical foundation for preventing and treating necrotizing enterocolitis of newborn by TUDCA.)
技术领域
本发明涉及于医药技术领域，尤其涉及牛磺熊脱氧胆酸在治疗新生儿坏死性小肠结肠炎中的应用。
背景技术
新生儿坏死性小肠结肠炎(Necrotizing Enterocolitis，NEC)是新生儿时期最严重和最常见疾病之一，并且是早产儿因胃肠道疾病死亡的首要原因。目前在中国极低体重出生儿中，新生儿坏死性小肠结肠炎的发病率为4.53％，新生儿坏死性小肠结肠炎相关死亡率高达41.7％。新生儿坏死性小肠结肠炎的发生和发展涉及到早产儿的肠道的不成熟，细菌异常定植和过度免疫应答的复杂的病理生理过程上。由于确切病因和发病机制不清楚，目前临床上仍无有效的预防和治疗措施，而且手术治疗后常出现肠狭窄、短肠综合征、神经发育迟滞等严重的并发症。因此，寻求针对新生儿坏死性小肠结肠炎患儿更为有效、安全的防治措施一直是此项研究领域的热点。
牛磺熊脱氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的梭基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。TUDCA是一种结合型天然胆汁酸，广泛存在于人和动物的胆汁中，作为参与蛋白质折叠的分子伴侣，可减轻内质网应激反应。目前临床上主要用于治疗胆汁淤积性肝病和胆囊结石等疾病。TUDCA的结构式及合成路径如下所示：
目前临床NEC是一种严重危害新生儿健康的消化系统疾病，由于确切病因未知，临床治疗方法有限，多以对症治疗为主，包括抗生素、益生菌、营养支持、手术干预等。儿科在整个临床领域算一门及其薄弱学科，儿科疾病的研究投入相比成人更是少之又少，所以对儿科疾病的认识要慢得多，对儿科疾病的药物研发更是遥遥无期。如果采用传统药物进行临床NEC干预可能会引起一定的副作用，因此，寻找一种安全有效的药物或方法来进行坏死性小肠结肠炎的防治是迫在眉睫的。
而上述的牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)在新生儿疾病中的预防和治疗作用尚不明确。目前有研究表明内质网应激(Endoplasmic Reticulum stress，ER Stress)是引发NEC一个重要致病因素。NEC患儿往往伴有高水平的ER stress，此外NEC好发于早产儿，通过比较发现，早产相比于足月儿，ER stress水平也是显著升高的。由此进一步论证了ER stress在NEC发生、发展中的重要作用。而TUDCA的抗ER stress特点为其在NEC的药物作用研究提供了一定的理论依据。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的不足，本发明根据TUDCA的药学性质以及NEC的发病特点，即TUDCA的内质网应激缓解作用和NEC体内高内质网应激水平促进肠道炎症的发生和发展，对TUDCA在NEC可能发挥重要调控缓解作用进行了验证，并在充分理解已知TUDCA和NEC的相关特性，评估实验设计的可行性和安全性后，以NEC为研究对象，探索TUDCA的作用及其机制。本发明通过建立新生儿坏死性小肠结肠炎小鼠模型以寻找新的更有效的治疗手段，评价牛磺熊脱氧胆酸对新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型的干预作用，进一步验证了牛磺熊脱氧胆酸在治疗新生儿坏死性小肠结肠炎中的用途。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
本发明提供一种牛磺熊脱氧胆酸或其药学上可接受盐在制备预防或治疗新生儿坏死性小肠结肠炎的药物中的应用。
进一步地，所述牛磺熊脱氧胆酸或其药学上可接受盐具有减轻内质网应激反应的作用。
进一步地，所述牛磺熊脱氧胆酸或其药学上可接受盐能降低内质网应激标志物CHOP和BiP的表达。
进一步地，所述牛磺熊脱氧胆酸或其药学上可接受盐能降低Cleaved caspase3(CC3)蛋白的表达。
进一步地，所述牛磺熊脱氧胆酸或其药学上可接受盐能降低小肠上皮细胞的凋亡。
进一步地，所述牛磺熊脱氧胆酸药学上可接受盐为牛磺熊脱氧胆酸的碱金属盐、铵盐中的至少一种。更优选为牛磺熊脱氧胆酸钠盐。
进一步地，所述药物含有医学上可接受的辅料，其剂型包括片剂、油剂、颗粒剂、粉剂，更优选为可溶于水的粉剂。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了TUDCA的新用途，其对NEC引起的内质网应激起到很好的保护作用，CHOP和BiP在TUDCA作用下显著降低，TUDCA干预可维持NEC模型新生小鼠的体重，降低小肠上皮细胞的凋亡，提高NEC模型新生小鼠的存活率。本发明通过细胞和凋亡水平实验，证实TUDCA在NEC中可以通过抑制内质网应激、降低细胞凋亡比例从而起到对NEC的保护作用，这为采用TUDCA进行新生儿坏死性小肠结肠炎的防治奠定了有效的理论基础。
附图说明
图1为本发明一实施例中NEC模型新生小鼠的造模过程的示意图；其中，A为造模所需要的的氮气瓶，氮气浓度为99.99％；B为造模所需的缺氧瓶；C为小鼠配方喂饲的奶粉，喂养所需要的1.9F经外周静脉置人中心静脉导管；D为喂养的操作；E为通氮气后小鼠缺氧的状态；F为4℃冰箱对小鼠进行冷刺激的操作。
图2为本发明一实施例中正常对照组(CONTROL)、新生儿坏死性小肠结肠炎模型组(NEC)、新生儿坏死性小肠结肠炎模型TUDCA干预组(TUDCA+NEC)实验后解剖所得的肠壁的示意图；
图3为图2所示的肠壁在肠道组织镜下观察和病理学评分的结果示意图；
图4A为本发明一实施例中CONTROL、NEC、TUDCA+NEC组小鼠的体重示意图；
图4B为本发明一实施例中CONTROL、NEC、TUDCA+NEC组小鼠的存活率示意图；
图5A为本发明一实施例中CONTROL、NEC、TUDCA+NEC组小鼠肠道组织内质网应激标志物CHOP和BiP的表达示意图；
图5B为CHOP和BiP随着生理年龄的增加的表达水平变化示意图；
图6为本发明一实施例中CONTROL、NEC、TUDCA+NEC组小鼠回肠末端组织BiP和Tunel免疫荧光染色的结果示意图；
图7为分离图6所述的三组小鼠回肠末端组织小肠上皮细胞的流式凋亡检测的结果示意图；
图8为本发明一实施例中大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6细胞)培养的照片示意图；
图9为本发明一实施例中检测TUDCA对脂多糖lps处理的IEC-6细胞内质网应激及凋亡相关蛋白CHOP、BiP和CC3的表达影响结果示意图；
图10为本发明一实施例中IEC-6细胞体外Tunel细胞凋亡实验的结果示意图；
图11为本发明一实施例中IEC-6细胞体外流式凋亡检测实验的结果示意图。
具体实施方式
本发明涉及牛磺熊脱氧胆酸或其药学上可接受盐在制备预防或治疗新生儿坏死性小肠结肠炎的药物中的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例通过如图1所示的建模过程采用人工喂养联合缺氧及冷刺激方法制备5日龄C57BL/6新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型。实验分为三组：正常对照组(10只)，新生儿坏死性小肠结肠炎模型组(15只)，新生儿坏死性小肠结肠炎模型TUDCA干预组(20只)。
具体实验过程如下：
小鼠人工喂养：采用鼠乳替代品如petag品牌奶粉，总能量840kJ/kg/d，喂养量为50μl/g，间隔4h定时喂养。
缺氧及冷刺激：缺氧冷刺激控制在餐后1h。先置于含100％氮气的缺氧瓶内60秒，随即置于4℃冰箱10分钟，每24h缺氧冷刺激2次，造模过程共96h。建立模型后，密切观察小鼠鼠进食、排便、腹部情况及活动反应等。于实验前和造模后每天称量新生小鼠的体重。出现明显临床症状(严重腹胀、血便和紫绀)时或者于造模后第96h颈椎脱臼处死小鼠，观察小鼠肠管的大体形态，收集肠管标本进行组织切片，HE染色，病理观察，进行组织学评分，并进行病理评分(双盲法)。
TUDCA干预：TUDCA的使用剂量为500mg/kg，使用1ml注射器腹腔注射TUDCA。于缺氧冷刺激前0.5h注射，每24h注射1次，造模过程中共注射4次。
TUDCA的配制：取50mg的TUDCA，溶于1ml的生理盐水中，每g小鼠注射约10ul溶液。
实验分组：45只小鼠随机分为三组：
正常对照组：母鼠喂养，10只。(CONTROL)
NEC模型组：缺氧冷刺激联合人工喂养，15只。(NEC)
NEC模型TUDCA干预组：腹腔注射TUDCA(于缺氧冷刺激前30分钟注射，每天1次，剂量500mg/kg，20只)。(TUDCA+NEC)
收集肠管。比较三组间肠道大体改变、生长发育以及体重改变。其实验结果如图2～图7所示。
如图2所示，在实验结束后，解剖上述三组实验组的小鼠，发现正常对照组正常小鼠肠壁色泽红润，弹性好，呈黄色。NEC模型组病变肠壁水肿、充血、坏死，呈红黑色，黄红色，以回盲部病变最为严重；肠道弹性差，易碎。在镜下出现与临床上NEC患儿肠管的病理改变类似：有不同程度黏膜层和黏膜下层充血、水肿，部分绒毛脱落坏死，腺体排列紊乱，肌层变薄或断裂，炎细胞浸润，严重者肠绒毛消失并伴全层坏死。NEC模型TUDCA干预组肠壁轻度水肿，弹性较好，镜下观察虽有腺体部分消失，但上皮完整，炎症细胞浸润不明显。
图3为肠道组织镜下观察和病理学评分(HE染色，200×)。其中A.0分；B.1分；C.2分；D.3分；E.4分。由该图可知，TUDCA能够降低NEC病理评分等级且有统计学差异(P＜0.05)，正常对照组病理评分为：0.30±0.466，NEC组为：2.80±1.11，NEC模型TUDCA干预组为：1.78±0.97(图3的F)。
如图4A所示，TUDCA可以维持NEC模型新生小鼠的体重，NEC模型TUDCA干预组较NEC组体重下降减少且有统计学差异(P＜0.05)，正常对照组96h后体重为：5.99±0.25，NEC模型组为：2.98±0.25，NEC模型TUDCA干预组为：3.89±0.22。如图4B所示，TUDCA能够提高生存率，NEC模型TUDCA干预组较NEC组生存率提高且有统计学差异(P＜0.05)。正常对照组96h后生存率为100％，NEC组为：46.67％，NEC模型TUDCA干预组为：66.67％。
如图5A所示，NEC模型组小鼠肠道组织内质网应激标志物CHOP和BiP的表达要显著高于正常对照组，而TUDCA对NEC引起的内质网应激起到很好的保护作用，CHOP和BiP在TUDCA作用下显著降低。如图5B所示，随着生理年龄的增加，CHOP和BiP表达水平呈下降趋势。早产儿的内质网应激水平要显著高于足月儿。
图6为三组小鼠回肠末端组织BiP和Tunel免疫荧光染色(200×)。BiP在NEC模型组表达较正常对照组明显升高，经TUDCA干预后BiP蛋白的表达下降(图6的A、B、C部分)。BiP蛋白表达于小肠上皮细胞质，NEC模型组BiP在炎症区域明显染色，干预组染色强度和范围明显低于炎症组。经Tunel免疫荧光染色观察，正常对照对照组和TUDCA组凋亡细胞计数极少，NEC模型组可在绒毛轴和隐窝处检测到阳性凋亡细胞(图6的D、E、F部分)。
图7为分离三组小鼠回肠末端组织小肠上皮细胞进行的流式凋亡检测。小肠上皮细胞在NEC模型组凋亡明显增加，经TUDCA干预后小肠上皮细胞凋亡明显减少。(*：与正常对照组相比，P＜0.05)。
实施例2
本实施例为进一步验证TUDCA的效果进行了IEC-6细胞系体外实验。
IEC-6在添加10％胎牛血清的Dulbecco's modifed Eagle's medium培养基中生长，按照1×106cells/mL浓度接种到6孔细胞培养板，37℃，5％CO2培养12h使细胞完全贴壁。使用生理盐水配制lps和TUDCA，。用lps(50μg/ml)处理IEC-6细胞6h，外加TUDCA至终浓度为50μM、100μM、200μM共同处理，之后收集细胞进行后续的研究。图8为IEC-6细胞培养的照片，如图8的B部分所示，lps诱导IEC-6细胞死亡增加，如图8的C部分所示，TUDCA的干预可以改善IEC-6的死亡，促进细胞的存活。上述体外实验结果如图9～11所示。图9为检测TUDCA对lps处理的IEC-6细胞体外实验的影响。在lps(50ng/ml)处理6h后的IEC-6细胞中，TUDCA(50μM、100μM、200μM)干预可降低IEC-6细胞BiP、CHOP和CC3蛋白的的表达。
图10为IEC-6细胞体外Tunel实验。TUDCA(50μM、100μM、200μM)干预可降低IEC-6细胞的凋亡。
图11为IEC-6细胞体外流式凋亡检测实验。C、D、E的TUDCA(50μM、100μM、200μM)干预可降低IEC-6细胞的凋亡。(*：与正常对照组相比，P＜0.05)
由上述实施例可知，本发明通过细胞和凋亡水平实验，证实TUDCA在NEC中可以通过抑制内质网应激、降低细胞凋亡比例、从而起到对NEC的保护作用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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