金属β-内酰胺酶抑制剂吡啶二羧酸胺衍生物及其制备方法
阅读说明：本技术 金属β-内酰胺酶抑制剂吡啶二羧酸胺衍生物及其制备方法 (Pyridine dicarboxylic acid amine derivative as metal beta-lactamase inhibitor and preparation method thereof ) 是由 秦上尚 张恩 刘闻天 白蒙蒙 陈方方 孔洪涛 闫婷婷 沈渤渊 董会玥 闫大钞 彭 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物化学技术领域,涉及金属β-内酰胺酶抑制剂吡啶二羧酸胺衍生物及其制备方法及其在抗菌领域的应用。其具有如下结构式：该化合物具有较好的金属β-内酰胺酶(NDM-1、IMP-4和VIM-1)抑制活性,并且可以恢复产金属β-内酰胺酶的工程菌株和临床分离肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的抗菌活性,其最高可以提高美罗培南对碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌(产NDM-1型金属β-内酰胺酶)的药效至少1024倍。化合物1与美罗培南联用可以快速杀灭产MBL的菌株。化合物毒性实验证明该化合物具有很小的体外细胞毒性及体内毒性,小鼠体内实验表明该化合物与美罗培南联合治疗可以显著提高感染产金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌小鼠的存活率。其可以作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂的候选药物。(The invention belongs to the technical field of medicinal chemistry, and relates to a pyridine dicarboxamide derivative serving as a metal beta-lactamase inhibitor, a preparation method thereof and application thereof in the antibacterial field. It has the following structural formula: the compound has good inhibitory activity of metallo-beta-lactamase (NDM-1, IMP-4 and VIM-1), can restore the antibacterial activity of engineering strains producing the metallo-beta-lactamase and bacteria of clinical separation enterobacteriaceae on carbapenem antibiotics, and can maximally improve the carbapenem-resistant escherichia coli (E) (Meropenem) of carbapenemNDM-type 1 metallo beta-lactamase producing) at least 1024 times as potent. The compound 1 can be used together with meropenem to quickly kill strains producing MBL. The compound toxicity test proves that the compound has small in vitro cytotoxicity and in vivo toxicity, and the mouse in vivo test shows that the compound and meropenem can remarkably improve the survival rate of mice infected with metal beta-lactamase Klebsiella pneumoniae. It can be used as a candidate drug of a novel metallo-beta-lactamase inhibitor.)
技术领域
本发明属于药物化学
技术领域
，涉及具有潜在应用价值的新型金属β-内酰胺酶抑制剂吡啶二羧酸胺衍生物及其制备方法。背景技术
抗生素的出现为临床上治疗感染性疾病带来了福音，但是随着抗生素类药物被大量运用于临床后，抗生素对于临床感染性疾病的治疗效果下降，临床上开始出现各种耐药性菌株，越来越多的抗生素对治疗失去了最初的效力，全球耐药性情况已不容藐视。2009年，英国卡迪夫大学的Walsh课题组报道了一类新型的β-内酰胺酶—金属β-内酰胺酶，病例显示该患者在2007年12月，在印度新德里接受抗生素治疗后，其尿液的培养物分离出一种对于碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，该酶也被成为新德里β-内酰胺酶(Antimicrobialagents and chemotherapy 2009,53,5046.)。自其报道一年后已经有将近20个国家相继报道发现携带blaNDM-1，全球趋势严重(The Lancet Infectious Diseases 2010,10,597.)。
按照β-内酰胺酶结构中氨基酸序列同源性的差异，Ambler分类法将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四类，其中作用机制不同又将其分为丝氨酸类β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶。其中A、C和D类是丝氨酸类β-内酰胺酶，B类是金属β-内酰胺酶。目前已上市的β-内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等。其与头孢类抗菌药物联用可以提高抗菌药物的活性。但是其都属于丝氨酸类β-内酰胺酶抑制剂，而金属β-内酰胺酶抑制剂目前没有上市药物报道。
2014年，Gerard D.Wright等人报道了从真菌中得到的一种天然的化合物AMA，它可以快速、有效地抑制含有NDM-1型金属β-内酰胺酶的活性，与美罗培南联合用药的情况下可使产NDM-1酶菌株对美罗培南恢复敏感(Nature 2014,510,503.)。2015年，SabihaY.Essack等人报道了两种锌离子螯合剂NOTA和DOTA，此两种螯合剂可以携带金属β-内酰胺酶的菌株恢复对碳青霉烯类抗生素的敏感性(Journal of Antimicrobial Chemotherapy2015,70,1594.)。2015年，西北大学杨科武课题组报道了一系列巯基乙酸硫酯氨基酸衍生物，其对于金属β-内酰胺酶L1的IC50最小可以达到18nM，但是其体外活性实验证明其恢复美罗培南敏感性效果并不理想(Acs Medicinal Chemistry Letters 2015,6,660.)。
David M.Weekes等人利用吡啶二羧酸胺(H2dpa，化合物2)及其羧酸或膦酸衍生物与镓(III)或镧(III)形成配合物用于正电子发射断层扫描成像(PET)和治疗骨疾病(Inorganic Chemistry 2016,55,24,12544–12558)。但未见将其应用于β-内酰胺酶抑制剂的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以使产金属β-内酰胺酶菌株恢复对碳青霉烯类抗生素敏感性的吡啶二羧酸胺衍生物；另一目的在于提供其制备方法。
为实现本发明目的，技术方案如下：
具有联合抗菌活性吡啶二羧酸胺衍生物，该化合物结构式如下：
合成本发明金属β-内酰胺酶抑制剂1路线如下：
(i)NaBH4 CH3OH,rt；(ii)PBr3,CHCl3,0℃；(iii)K2CO3,CH3CN,氨基酸乙酯,60℃；(iv)6M HCl,reflux.
具体合成方法如下：
(1)取吡啶-2,6-二羧酸二甲酯溶于甲醇溶液中，搅拌下，将硼氢化钠分次缓慢添加溶液中，搅拌反应。反应完成后，经萃取干燥，得到固体b。
(2)将PBr3滴加到b的氯仿溶液中，滴完后，室温搅拌反应。反应结束后，将pH调节至碱性，经萃取，洗涤，干燥，得到固体c，其无需进一步纯化即可使用。
(3)将碳酸钾和2-胺基乙酸乙酯盐酸盐添加至c的乙腈溶液中搅拌反应。反应结束后，经过滤，纯化，得到化合物d。
(4)向化合物d中加入盐酸，回流反应，反应完成后，减压蒸干溶剂得到粗产物。经提纯、过滤获得白色固体1。
本发明优点：该化合物具有较好的金属β-内酰胺酶(NDM-1、IMP-4和VIM-1)抑制活性，并且可以恢复产金属β-内酰胺酶的工程菌株和临床分离肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的抗菌活性，其最高可以提高美罗培南对碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌(产NDM-1型金属β-内酰胺酶)的药效至少1024倍。化合物1与美罗培南联用可以快速杀灭产MBL的菌株。化合物毒性实验证明该化合物具有很小的体外细胞毒性及体内毒性，小鼠体内实验表明该化合物与美罗培南联合治疗可以显著提高感染产金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌小鼠的存活率。其可以作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂的候选药物。且合成方法简单可行，收率高，达46％以上。
附图说明
图1为联用棋盘实验，美罗培南联用化合物对产MBL工程菌的标准棋盘实验结果如图1所示，此外，化合物1对ATCC25922、ATCC29213和产MBL工程菌的MIC高达128μg/mL，没有表现出抑菌作用。由结果可观察到，化合物1联用美罗培南对产NDM、VIM或IMP的工程菌的协同效果与阳性化合物EDTA相当，FIC指数在0.0703-0.1875之间，与美罗培南联用具有协同效果。
图2为化合物1与美罗培南联用在体外杀菌动力学结果对比图，结果显示：同时添加16μg/ml的化合物1与8倍MIC的美罗培南在8h内可以使产NDM-1(KP18-19-2)、IMP-4(EC13-26)和VIM-1(PA18-161)的临床分离株的细菌数量减少至少1万倍或到最低检测值(10CFU/mL)。24h后，产NDM-1、IMP-4和VIM-1的临床分离株的细菌数量均降低至最低检测值或102CFU/mL，这些结果表明化合物1与美罗培南联用可以快速地杀灭产MBL的菌株。
图3为化合物1体外红细胞溶血性的实验结果，由图可知，化合物1在1024μg/mL时红细胞溶血率小于5％，对红细胞没有明显的损伤，由此可以证明其对于哺乳动物的红细胞损伤很小。
图4为化合物1在体外对于GES细胞毒性的活死细胞荧光实验结果，图中，A–B阴性对照(不加药组)，C–D化合物1(32μg/mL)，E–F阳性对照组0.05％Triton X-100。图中比例尺为200μm。由图可以显著的观察到，化合物1于32μg/mL作用于GES细胞后与PBS对照组结果相同，对于细胞维持正常形态的生长几乎没有影响。
图5为小鼠生存率实验，在腹腔注射致死剂量的KP18-29之后，采用美罗培南和化合物1的单一与联用组合对感染后的小鼠进行治疗，化合物使用的剂量在安全范围内。结果显示：经化合物1与美罗培南(4mg/kg)单一治疗的小鼠在24h内全部死亡，MEM(4mg/kg)与化合物1(10mg/kg)联合使用可以使小鼠存活率达到100％。因此，美罗培南与化合物1的联合具有良好的治疗效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
合成化合物表征使用的仪器：NMR谱使用瑞典Bruker DPX-400型超导核磁共振仪测定，TMS为内标；高分辨质谱使用Waters-Micromass公司Q-Tof质谱仪测定。
实施例1化合物1的制备：
取吡啶-2,6-二羧酸二甲酯(10.00g，51.2mmol)溶于甲醇(250mL)溶液中，在0℃搅拌下，将硼氢化钠(7.75g，204.95mmol)分3次缓慢添加到溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌7h。反应完成后，加入饱和碳酸氢钠溶液(50mL)，并用二氯甲烷(200mL×3)萃取。有机相用饱和氯化钠水溶液干燥，无水硫酸镁干燥，减压蒸干溶剂，得到白色固体b(7.01g)，无需纯化即可使用。产率：82％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99(t,J＝7.7Hz,1H),7.96–7.88(m,1H),7.74–7.69(m,1H),5.57(t,J＝5.9Hz,1H),4.62(d,J＝5.8Hz,2H),3.87(s,3H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.3,162.5,146.4,138.0,123.8,123.0,64.0,52.3,52.3.
在0℃下，将PBr3(11.08g，40.92mmol)滴加到b(5.70g，34.10mmol)的氯仿(60mL)溶液中，滴完后，室温搅拌4h。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠将pH调节至8，用二氯甲烷(200mL×4)萃取。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水MgSO4干燥，减压蒸干溶剂，得到浅黄色固体c(7.61g)，其无需进一步纯化即可使用。产率：97％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08(t,J＝9.2Hz,1H),7.88(t,J＝7.8Hz,1H),7.70(d,J＝7.7Hz,1H),4.65(s,2H),4.02(s,3H)。
将碳酸钾(0.72g，5.21mmol)和2-胺基乙酸乙酯盐酸盐(1.30mmol)添加至c(0.60g，2.60mmol)的乙腈(6mL)溶液中。将反应混合物在60℃下搅拌12h。反应结束后，通过过滤除去碳酸钾，减压蒸干滤液。通过柱色谱法(A：二氯甲烷，B：甲醇，100％A至30％B梯度洗脱)纯化，得到化合物d。产率：39％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.0(d,J＝7.3Hz,2H),7.9(d,J＝7.3Hz,2H),7.8(t,J＝7.7Hz,2H),4.2(q,J＝7.1Hz,3H),4.1(s,4H),4.0(s,6H),3.6(q,J＝7.1Hz,1H),1.4(d,J＝7.1Hz,3H),1.3(t,J＝7.1Hz,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.5,165.8,160.8,147.3,137.4,125.8,123.6,60.7,58.7,57.1,52.9,14.3,14.0.
向化合物d(500μmol)中加入6M盐酸(8mL)。将反应混合物100℃回流4h，反应完成后，减压蒸干溶剂得到粗产物。将粗产物溶解在乙醇溶剂中，加入大量丙酮直至没有固体沉淀析出，并且通过过滤获得白色固体1。产率：53％。mp:231–232℃.1H NMR(600MHz,D2O)δ7.9–7.8(m,4H),7.6(d,J＝7.7Hz,2H),4.6(q,J＝15.0Hz,4H),4.4(q,J＝7.2Hz,1H),1.7(d,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,D2O)δ173.1,165.9,151.2,145.8,141.2,128.1,125.0,63.2,56.0,11.6.HRMS(ESI+):calcd for C17H18N3O6(M+H)+:360.1190,found 360.1198.
应用例1化合物1对NDM-1、IMP-1和VIM-2酶IC50测试：
操作步骤：筛选反应在96孔细胞培养板中进行，终体积为200μL。
于96孔细胞培养板中各加入稀释后的NDM-1、IMP-1和VIM-2酶100μL/孔(第一列加196μL)，在第一列加入待测化合物溶液4μL/孔，每组待测药物平行做3个复孔。使用DMSO作为阴性对照组，每组2个平行。使用八道孔移液枪梯度稀释100μL至最后一排，将多余的100μL弃去，在37℃条件下孵育5-10min。
提前设置好酶标仪程序，测定其在相应96孔细胞培养板中300nm处的吸光值；每隔60s测定一次，连续测定30个循环。
孵育5min之后，每孔各加入对应的底物美罗培南、亚胺培南和头孢硝噻吩100μL，使化合物终浓度由100μg/mL到1.5625μg/mL，缓慢吹打均匀以防气泡的产生，启动酶标仪程序反应。使用Graphpad Prism 8软件分析各化合物对MBLs的IC50。
计算公式如下：
IR(％)＝(1-VS/VN)×100％
VS代表待测样品孔的酶反应速率
VN代表阴性对照孔的平均酶反应速率。
表1化合物1对MBLs的IC50测定结果
a IC50值为至少3个独立实验的平均值±标准差。
结果如表1所示，化合物1相对于阳性化合物EDTA和曲马胺(aspergillomarasmineA，AMA)对临床相关的NDM-1，VIM-2和IMP-1表现出更广谱且更强的抑制作用。而且，化合物1对三种类型的MBLs没有表现出选择性偏倚的抑制作用，IC50值均稳定在1.5–4.4μM。因此化合物1在分子水平对三种临床相关的MBLs均表现出稳定且相似的抑制活性。
应用例2本发明化合物1与美罗培南联合对携带不同MBLs工程菌的活性测试：
实验方法：标准棋盘法
(1)抗菌药物贮存液制备：制备抗菌药物贮备液的浓度为5120μg/mL，溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20℃以下环境，保存期不超过6个月。
(2)待测菌的制备：在平板上分别挑取若干待测工程菌株的单克隆，分别置于1mL的LB液体培养基中，37℃，225rpm在恒温振荡器中培养3-4h，此时菌液浓度大约是1×108CFU/mL，将其稀释1000倍后得到浓度约1×105CFU/mL的菌液；
(3)将美罗培南稀释好之后加入96孔板的第一纵排，每孔加入100μL，每个化合物设置两个平行，第2-10纵排分别加入50μL肉汤，然后用八孔道移液器吸取50μL梯度稀释至第十孔，将最后多余的50μL弃去，在第11排加入200μL菌液作为阳性对照，最后一排加入200μL的LB肉汤作为阴性对照；
(4)将待测化合物浓度稀释至4倍终浓度后，再依次梯度稀释，并将每一个浓度添加96孔细胞培养板的一排，此排的每个孔都加入待测化合物50μL；之后在第1排到第10排加入100μL稀释好的菌液；将96孔细胞培养板放置于37℃恒温培养箱中16-18h，第二天观察生长状况，读取MIC的结果，标准菌株大肠杆菌ATCC25922为质控菌株。
结果判定：根据CLSI标准，96孔细胞培养板浑浊孔的前一列对应的美罗培南浓度为联用的MIC，以计算化合物的抑制浓度分数(Fractional inhibitory concentration，FIC指数)，评价化合物的协同作用，FIC指数使用以下公式得出：
当FIC指数值为≤0.5时，代表化合物有协同作用，FIC指数越低表示化合物与抗生素的协同作用越强。实验结果见附图1，化合物1与美罗培南联用对产NDM-1的工程菌的FIC指数低至0.0703，对产IMP-4的工程菌的FIC指数为0.1875，对产VIM-1的工程菌的FIC指数低至0.0939，表明化合物对产MBL的工程菌株在细胞水平有良好的抑制效果。
应用例3本发明化合物1与美罗培南联合对临床分离耐药菌的活性测试：
实验方法微量肉汤稀释法：
(1)抗菌药物贮存液制备：制备抗菌药物贮备液的浓度为5120μg/mL，溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20℃以下环境，保存期不超过6个月。
(2)待测菌的制备：用接种环挑取过夜培养的MH(A)培养皿上的单菌落于MH(B)培养基中，校准为0.5麦氏比浊标准，约含菌数1×108CFU/mL，然后稀释1000倍，即得到约含菌数1.0×105CFU/mL的菌液。
(3)分别将抗菌药物(美罗培南MEM)贮备液母液(5120μg/mL)稀释160倍，得到浓度为32μg/mL的抗菌药物溶液。取无菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌药物，第二至十孔分别加入100μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀，再吸取100μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μL弃去。此时各孔药物浓度依次为：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200μL MH(B)培养基(阴性对照)。
(4)然后将稀释好的菌液分装于EP管中，计算需要固定待测化合物的浓度(64μg/mL或32μg/mL)，将其加入菌液中，使待测化合物的终浓度为64或32μg/mL。自稀释好美罗培南的96孔板的第1孔至第10孔分别加入菌液和待测化合物的混合溶液。将加完药的96孔板放置37℃培养箱进行培养，16-18h观察菌液生长情况，根据美国临床与实验室标准协会(CLSI)的判定标准，肉眼观测完全不长菌的那一孔为抗菌药物的MIC。同时用标准株做质控。
表2 MEM和化合物1组合对产MBLs临床分离株的MIC
a 42株分离自临床的产MBLs细菌。KP表示肺炎克雷伯菌，ECL表示阴沟肠杆菌，EC表示大肠杆菌，KO表示产酸克雷伯菌，CF表示弗氏柠檬酸杆菌，EH表示霍氏肠杆菌，PA表示铜绿假单胞菌。
b化合物1及EDTA的剂量为16μg/mL。
c菌株ATCC25922不含碳青霉烯酶，作为阴性对照。
由表2可知，目标化合物1的添加浓度为16μg/mL时，联用美罗培南对临床产MBLs的菌株表现出良好的协同效果，且化合物1的协同效果强于阳性化合物EDTA；针对产NDM(NDM-1，NDM-3和NDM-5)的临床菌株，MEM+1(MIC90＝0.25μg/mL)抑制效果强于MEM+EDTA(MIC90＝2μg/mL)组合；针对IMP的临床菌株(IMP-4)，MEM+1(MIC90＝1μg/mL)抑制效果也强于MEM+EDTA(MIC90＝2μg/mL)组合。
应用例4化合物1体外杀菌动力学测试
(1)实验材料：MHB培养基(Muiller-Hinton Broth)，MHA培养基(Muiller-Hinton琼脂)，1.5mL无菌EP管，96孔板，PBS缓冲液。
(2)培养基的配置：用超纯水溶解一定量的MHA和MHB粉末，121℃高温灭菌20min后，取出备用。MHA培养基待其冷却至40℃左右将其倒入一次性无菌培养皿，待至室温凝结成固体培养基。
(3)步骤：取两支10mLEP管分别加入3mL的MHB培养基，用接种环分别挑取培养皿中的单克隆菌株(NDM-4菌株14-55和IMP菌株Ec-101)，于恒温摇床中，37℃250rpm过夜生长。第二天，将两支管中的菌液分别都按1:10000倍进行稀释，分别稀释14管，每管3mL的菌液，分为两批，分别于37℃250rpm生长2h和5h。待到达生长时间，取出菌液，加入设定浓度的抗菌药物，此时，分别从每个样品管里面取出100μL的样品液，于低温离心机内10000g离心，弃掉上清，用1×PBS稀释。取无菌96孔板，每孔180μL加入1×PBS。从上述用1×PBS稀释好的菌液中取出20μL加入第一孔，然后向后倍比稀释。从稀释好的孔中取出10μL的样品液滴到MHA固体培养基上，做好标记，此为0h时的菌落计数。往后依照上述方法，依次对1h、2h、3h……24h等进行菌落计数，绘制曲线。结果见附图2。
应用例5化合物1体外红细胞溶血性实验
(1)实验材料：10mLEP管，96孔板，新鲜脱脂羊血。
(2)PBS缓冲液：500mL规格，氯化钠4g，氯化钾100mg，二水合磷酸二氢钠1.49g，无水磷酸二氢钾100mg，去离子水定容至490mL，调节PH7.2-7.4之间，灭菌，用10mL灭过菌的超纯水溶解900mg葡萄糖后加入溶液中。
(3)5％红细胞悬浮液的制备：新鲜的脱纤维羊血冷冻于冰箱里，配置好的PBS缓冲液放置于37℃水浴锅中，即用即配制：
取两支10mLEP管置于试管架，将37℃1×PBS取出水浴锅和冷藏的新鲜羊血一起喷酒精，放入超净台。用移液枪分别吸取5700μL的1×PBS加入两支EP管中，再分别吸取300微升羊血，缓慢加入到PBS溶液中，盖盖子，上下缓慢颠倒混匀，放入离心机1500转离心10min，取出EP管，小心吸取上清，移除上清。再重新分别加入5～7mLPBS溶液，上下缓慢颠倒混匀，放入离心1500转离10min。如此反复操作，直至离心后上清液不再浑浊。最后一次离心过后，撇去上清液，红细胞沉积物留置待用。
取几支10mLEP管，放置试管架上，于每支EP管中加入5700μL的1×PBS(37℃)，然后依次加入300μL的红细胞沉积物。上下缓慢颠倒混匀，如此，便配置好5％的红细胞悬液。
(4)样品溶液的配置：用少量的DMSO溶解(DMSO终浓度不能大于0.5％)，并且用相同体积的DMSO做阴性对照。溶解后的DMSO用PBS稀释(例如，第一孔浓度为1000μg/mL，那么第一孔加入的50μL中药物的含量就是2mg，配置成2mg/50μL的溶液)，此时这支EP管内的药物为初始药物。然后平行取九支1.5mLEP管置于试管架中，分别加入200μL的PBS(编号2号、3号、4号……10号)。所有药物都如此平行操作。最后，由初始药物EP管中吸取200μL的药品溶液加入2号EP管中，反复吹洗后吸取200μL到3号EP管中，反复吹洗……重复操作，直到10号EP管。如此稀释好药物。
(5)铺板：取96孔板，写好实验编号，药品代码，日期。将移液枪调至150μL，将配置好的5％红细胞悬液上下轻缓颠倒混匀，依次吸取铺入96孔板中(6×10)。然后将配置好的药物对应加入96孔板中，一个药物三个复孔。加完后放置37℃恒温箱内孵育1h。
(6)后处理：将96孔板从恒温箱内取出，置于-4℃离心机内离心(3500rpm，5min)。离心完毕，每块板对应都取一块新的96孔板。标注和离心后的板子对照。然后对应地吸取100μL上清液(孔孔对应)。吸取完毕后，与酶标仪中测取OD值，分析数据，得到HC50。实验结果见附图3。
应用例5体外活死细胞双染测试化合物1细胞毒性
(1)实验材料：DMEM培养基，细胞计数板，96孔板，CCK-8，钙黄绿素-AM，碘化丙啶(PI)，PBS缓冲液，荧光显微镜。
(2)培养基的配置：取无菌分装瓶，FBS和DMEM培养基1:10的体积比例配置，于4℃冰箱内储存待用。
(3)荧光染料的配置：将分装好的钙黄绿素-AM和碘化丙啶(PI)用PBS稀释，即用即稀释。
(4)铺板：将培养中状态良好的GES细胞自培养箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培养基，用2mLPBS洗细胞一次，除去残留的培养基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培养皿中，于37℃培养箱，体积百分比0.5％CO2中孵育1-2min。取出消化后的培养皿，加入1mL培养基终止消化。将终止消化后的细胞混悬液转移至10mL EP管中，800rpm3min离心。取出EP管，缓缓倒掉上清，加入2—4mL培养基，反复吹打50次。从中取10μL细胞混悬液打入细胞计数板中，于20×显微镜下计数。计算好需要细胞的数目，配置为30000个/孔的细胞混悬液。每孔1mL依次加入12孔板中，于恒温培养箱中孵育24h。
(5)加药与染色：将待测药物在4mLEP管中梯度稀释好后，取出已贴壁生长的12孔板，弃掉上清，将稀释好的待测药物每孔700μL加入板中，操作完成后将12孔板放入恒温培养箱中。24h后，取出，分别收集每个孔的上清，做好标记，3500rpm5min离心上清，弃掉上清收集死细胞，接着用PBS洗一次，弃掉PBS。将12孔板用PBS每孔各洗一次。用配置好的染料每孔700μL先吹打收集该孔的死细胞，然后将其混合液加入到12孔板的孔中。操作完成后，于恒温培养箱孵育15min。接着，尼康荧光显微镜下拍照。实验结果见附图4。
应用例7小鼠生存率实验
小鼠存活率实验考察化合物在体内逆转碳青霉烯抗生素耐药性的实验方案，所使用的动物是5-7周龄体重15-17g的SPF级BALB/c雌性小鼠。
根据测定产NDM-1酶菌株18-29的致死剂量的预实验，确定选用亚致死剂量脓毒症模型所用的菌量为1×107CFU/只，采用腹腔注射的方式，半小时后腹腔给药治疗，由于腹腔给药生物利用度仅次于静脉注射，操作方便，所以采用腹腔注射的方式给药。
美罗培南设为4mg/kg，化合物1设为10mg/kg，根据化合物1所设置的浓度对小鼠进行分组。
根据测定产NDM-1酶菌株18-29的致死剂量的预实验，确定选用存活率实验所用的菌量为5×107CFU/只，采用腹腔注射的方式，半小时后腹腔给药治疗。
每组6只小鼠，美罗培南浓度为4mg/kg，化合物1浓度为10mg/kg，对小鼠进行分组。采用单用组与联用组对小鼠进行治疗，每天观察小鼠的生存状况，给与正常的饲料与饮水，连续观察7天，计算每组小鼠的存活率并绘制生存曲线，观察治疗趋势。结果见附图5。
由上述体外生物活性评价实验可知，化合物1对MBLs酶(NDM-1、VIM-2和IMP-1)具有良好的抑制活性IC50＝1-5μM。体外抗菌实验结果证明：化合物1可以恢复美罗培南对产金属β-内酰胺酶的工程菌株和临床分离菌株的抗菌活性，其最高可以将碳青霉烯类耐药的大肠埃希菌(产NDM-1型金属β-内酰胺酶)对美罗培南的MIC值降低至少1024倍。体外毒性实验证实，化合物1即使在浓度为1024μg/mL时对于红细胞没有毒性，而对于GES细胞的毒性显示，对于体外细胞毒性也在其治疗量MIC范围之内。杀菌动力学的结果表明：化合物1与美罗培南联用可以快速地杀灭产MBL的菌株。小鼠体内实验表明化合物1与美罗培南联用还可以显著提高感染产β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌小鼠的存活率。一系列的生物活性评价可以初步认定，化合物1可以作为新型金属β-内酰胺酶抑制剂在抗菌领域应用。