具体实施方式

下面提供了本发明的详细说明，以协助本领域的普通技术人员实践本发明。本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。另外，鉴于本披露内容，对本发明的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。本领域的普通技术人员将意识到，在本文所述的这些实施例中可以做出修饰和变化而不偏离本发明的精神或范围。

定义

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文并入本文。

为了清晰起见，定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下：

如本文所使用的，“一个(a)”、“一个(an)”或“该(the)”可以意指一个或多于一个。例如，“一个细胞”可以意指单个细胞或多个细胞。

如本文所使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性，“或”解释时组合的缺少。

另外，当指可计量值(例如化合物或试剂、剂量、时间、温度等等的量)时，如本文所使用的，术语“约(about)”意图包括所指值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的变化。

如本文所使用的术语“嵌合构建体”或“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”(或类似术语)是指如下构建体或分子，该构建体或分子包含被组装进单个核酸分子中的不同来源的两个或更多个多核苷酸。术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”是指如下任何构建体或分子，该构建体或分子含有但不限于(1)多核苷酸(例如，DNA)，包括在自然界中没有被发现在一起的调节多核苷酸和编码多核苷酸(即，构建体中的至少一个多核苷酸相对于它的其他多核苷酸中的至少一个是异源的)，或(2)编码不是天然毗邻的蛋白质部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗邻的启动子部分。另外，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸可以包含衍生自不同来源的调节多核苷酸和编码多核苷酸，或包含衍生自相同来源、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行布置的调节多核苷酸和编码多核苷酸。在本发明的一些实施例中，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包含表达盒，该表达盒包含在调节多核苷酸的控制下、特别地在植物或细菌中具有功能性的调节多核苷酸的控制下的本发明的多核苷酸。

“编码序列”是转录成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA)的核酸序列。优选地，RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白质。

如本文所使用的，“密码子优化的”序列意指如下核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，该方式是为了保持由待优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，重组DNA构建体的DNA序列包括已经针对该构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、或真菌细胞)进行了密码子优化的序列。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014，通过引用并入本文。

术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。两单链分子之间的互补性可以是“部分的(partial)”，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。“互补的”多核苷酸是能够根据标准Watson-Crick互补性规则发生碱基配的那些。具体而言，嘌呤将与嘧啶进行碱基配对，以便形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。例如，序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交，甚至它们彼此并不完全互补，其条件是每种多核苷酸具有至少一个与另一种多核苷酸基本上互补的区域。

如本文所使用的，术语“基本上互补”或“部分互补的”意指两个核酸序列在其至少约50％、60％、70％、80％或90％的核苷酸处是互补的。在一些实施例中，这两个核酸序列可以至少在其85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的核苷酸处是互补的。术语“基本上互补的”和“部分互补的”也可以意指两个核酸序列可以在高严格性条件下杂交并且这类条件是本领域熟知的。

“控制”昆虫意指通过毒性作用抑制昆虫有害生物存活、生长、摄食、或繁殖的能力，或者限制昆虫相关的作物植物损害或损失，或者保护在昆虫有害生物存在的条件下生长时的作物的产量潜力。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。

术语“包含(comprises或comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、或其组的存在或添加。

如本文所使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在被解释为等同于“包含(comprising)”。

“递送”组合物或毒性蛋白意指该组合物或毒性蛋白与昆虫接触，这促进该组合物或毒性蛋白的经口摄取，产生对昆虫的毒性作用和控制。可以按照许多公认的方式，包括但不限于转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白质组合物、一种或多种可喷洒的蛋白质组合物、饵基(bait matrix)、或任何其他的领域公认的蛋白质递送系统来递送该组合物或毒性蛋白。

“控昆虫有效量”意指毒性蛋白的浓度，它通过毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食或繁殖的能力，或者限制昆虫相关的损害或作物植物损失，或者保护在昆虫有害生物存在的条件下生长时的作物的产量潜力。“控昆虫有效量”可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管它优选意指杀死昆虫。

如本文所使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导至少一种目的多核苷酸(如编码本发明的干扰RNA分子和/或Cry蛋白的多核苷酸)的表达的核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至目的多核苷酸(其可操作地连接至终止信号)的启动子。“表达盒”还典型地包含正确翻译目的多核苷酸所需的另外的多核苷酸。该表达盒还可以包含在目的多核苷酸的直接表达中不是必需的但是由于用于从一个表达载体去除该表达盒的方便限制位点而存在的其他多核苷酸。包含一个或多个目的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主是异源的，即在该表达盒中的目的多核苷酸不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化过程或育种过程引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。该表达盒中的一个或多个目的多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物(如植物)的情况下，启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。

“基因”是如下限定的区域，该区域位于基因组之内，并且除了前述的编码序列之外，它还包含其他负责该编码部分的表达控制(也就是转录和翻译)的主要调节核酸序列。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。另外的可能存在的元件是例如内含子。

当提及基因或多核苷酸或多肽使用时，术语“异源”是指基因或多核苷酸或多肽不是在其天然环境中或包含其非天然环境中存在的一部分(即，已经通过人工改变)。例如，异源基因可以包括自一个物种引入到另一个物种的多核苷酸。异源基因还可以包括对生物来说是天然的多核苷酸，该多核苷酸已经以一些方式(例如，经突变；以多个拷贝添加；连接至一种非天然启动子或增强子多核苷酸等)被改变。异源基因可以进一步包含植物基因多核苷酸，其包含植物基因的cDNA形式；这些cDNA可以以正义方向(以产生mRNA)或反义方向(以产生一种反义RNA转录本，其与mRNA转录本是互补的)被表达。在本发明的一个方面，异源基因区别于内源性植物基因在于该异源基因多核苷酸被典型地连接至包含调节元件如启动子的多核苷酸上，未发现这些多核苷酸与由该异源基因编码的蛋白质的基因或与该染色体中的植物基因多核苷酸天然相关联，或者与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在基因座中表达的基因，其中该基因未正常表达)相关联。另外，“异源”多核苷酸是指不与将多核苷酸引入其中的宿主细胞天然地相关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多拷贝。

“杀昆虫的”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫，优选地通过杀死它们来进行控制。

术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或蛋白质是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或蛋白质。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或蛋白质可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌或转基因植物中。因此，如本文所列举的对“分离的”核酸分子的要求涵盖当核酸分子包含在转基因植物基因组内时的核酸分子。

在本发明的上下文中，术语“同源性”是指在两个核酸或氨基酸序列之间就核苷酸和氨基酸同一性或相似性而言的相似性水平(序列相似性或同一性)。同源性、同源物、以及同源的也是指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。同源物包括直系同源物和旁系同源物的基因。可以通过使用本文披露的编码序列或在适当的数据库中找到的同源物(例如在NCBI或其他数据库中)，以一种或多种以下方式确定同源物。对于氨基酸序列，应使用算法比较序列(例如参见“同一性”和“基本上的同一性”部分)。对于核苷酸序列，可以用几乎相同的方式将一个DNA分子的序列与已知或推定的同源物的序列进行比较。跨越分子的任何实质区域(DNA、RNA、或蛋白质分子)上，同源物是至少20％同一性、或至少30％同一性、或至少40％同一性、或至少50％同一性、或至少60％同一性、或至少70％同一性、或至少80％同一性、或至少88％同一性、或至少90％同一性、或至少92％同一性、或至少95％同一性。

术语核苷酸或氨基酸序列的“序列相似性”或“序列同一性”意指两个或更多个序列的同一性或相似性程度，并且可以常规地通过使用已知软件或计算机程序(如Best-Fit或Gap成对比较程序(GCG威斯康星州软件包(Wisconsin Package)，遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group)，科学先驱路575号(575Science Drive)，麦迪逊，威斯康星州，53711))确定。BestFit使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics[应用数学进展]2:482-489(1981)的局部同源性算法以找到两个序列之间最佳的同一性或相似性区段。通常通过在比较窗口上比较这两个序列的部分来进行两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列比较，以鉴定并比较序列相似性的局部区域。比较窗口通常是从约20至200个连续核苷酸。Gap使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453(1970)的方法执行所有一个序列与所有另一个相似的序列的全局比对。当使用序列比对程序(如BestFit)来确定DNA序列同源性、相似性或同一性的程度时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵以优化同一性、相似性或同源性评分。类似地，当使用程序(如BestFit)来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的评分矩阵(如blosum45或blosum80)以优化同一性、相似性或同源性评分。

在两个核酸或两个氨基酸序列的上下文中，短语“基本上同一的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少约50％核苷酸或氨基酸残基同一性(如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的)的两个或更多个序列或子序列。在某些实施例中，基本上同一的序列具有至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或甚至至少约90％或95％核苷酸或氨基酸残基同一性。在某些实施例中，基本上的同一性存在于这些序列的整个长度为至少约50个残基的区域中，或在整个至少约100个残基的区域中，或这些序列在至少约150个残基中是基本上相同的。在另外的实施例中，当这些序列在编码区的整个长度上是相同的时，这些序列是基本上相同的。

用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，科学街575号(575Science Dr.)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))，或通过目测检查(总体上参见Ausubel等人,下文)。

适合于确定序列同一性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于以下文献中：Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈值(Altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。

用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson,等人Nuc.Acids Res.[核酸研究],22:4673-4680,1994)。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，以获得百分比同一性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是25％同一的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列而言这两个蛋白质是50％同一的。如果该较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100，获得百分比同一性。

当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时，这两个核苷酸序列也可以被认为是基本上同一的。在代表性实施例中，被认为基本上相同的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指多核苷酸与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会不同。通过控制该杂交和/或洗涤条件的严格度，能够鉴定与该探针(同源探测)100％互补的靶多核苷酸。可替代地，可调整严格条件以允许序列中的一些错配，使得检测到更低程度的相似性(异源探测)。典型地，严格条件将是以下这些：其中盐浓度小于约1.5M Na离子、典型地为约0.01至1.0M Na离子(或其他盐)，pH为7.0至8.3，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下使用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(w/v；十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。中等严格条件检测共享至少80％序列同一性的序列。示例性中等严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中洗涤。高严格条件检测共享至少90％序列同一性的序列。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1×SSC中洗涤。特异性典型地取决于杂交后的洗涤，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于DNA—DNA杂交物，Tm可以从Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.[分析生物化学]138:267-284，1984)的等式中进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对长度。Tm是50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度及pH下)。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以便杂交至具有所需同一性的序列。例如，如果寻找具有大约90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般来说，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在限定的离子强度以及pH下的热熔点(Tm)低约5℃。但是，极度严格条件可以在比热熔点(Tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下利用杂交和/或洗涤；中度严格条件可以在比热熔点(Tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下利用杂交和/或洗涤；低严格条件可以在比热熔点(Tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下利用杂交和/或洗涤。使用该方程、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，本领域普通技术人员应了解，杂交和/或洗涤溶液严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的广泛指导见于以下文献中：Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第2章第I部分“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”，纽约爱思唯尔集团(Elsevier,N.Y.)(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术]，第2章，Ausubel等人编著，纽约格林出版和威利交叉科学公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)(1995)。严格杂交的方法是本领域已知的，这些条件可以通过本领域已知的方法计算。这披露于Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，1989，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)以及Current Protocols inMolecular Biology[现代分子生物学实验技术]，Ausebel等人(编)，约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.)，2000中。确定序列同一性百分比的方法是本领域已知的，其实例是GCG计算机序列分析软件(威斯康星州麦迪逊的GCG公司(GCG,Inc,Madison Wis.))。

如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的(例如，由于遗传密码的简并性)。

两个核酸序列或蛋白质基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白质与由第二核酸编码的蛋白质进行免疫性交联反应。因此，蛋白质典型地是与第二蛋白质基本上相同的，例如其中这两种蛋白质仅在保守性取代上不同。

当核酸序列编码了多肽(该多肽与由参考核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列)时，这种核苷酸序列与这种参考核酸序列“同类编码”。

如本文所使用的，“dsRNA”或“RNAi”是指由单个自身互补RNA链或至少由两条互补RNA链形成的多核糖核苷酸结构。互补程度(换言之，％同一性)不需要必须是100％。而是，它必须足够允许在所采用的条件下形成双链结构。如本文所使用的，术语“完全地互补”意指dsRNA的核苷酸序列的所有碱基都与靶核苷酸序列的碱基互补或‘匹配’。术语“至少部分地互补”意指dsRNA的碱基与靶核苷酸序列的碱基之间存在小于100％的匹配。本领域的技术人员将理解，为了介导靶基因表达的下调，dsRNA仅需要与靶核苷酸序列至少部分地互补。本领域已知，相对于靶序列而具有插入、缺失以及错配的RNA序列在RNAi方面仍然可以有效。根据本发明，优选地是，dsRNA和靶基因的靶核苷酸序列共有至少80％或85％的序列同一性，优选至少90％或95％序列同一性，或更优选至少97％或98％序列同一性，并且再更优选至少99％序列同一性。可替代地，在24个部分互补的核苷酸的每个长度上，如与靶核苷酸序列相比，dsRNA可以包含1、2、或3个错配。本领域的普通技术人员将了解，dsRNA与靶核苷酸序列之间共有的互补性程度可以取决于有待下调的靶基因或者取决于基因表达有待控制的昆虫有害生物物种而改变。

应了解的是，dsRNA可以包含双链RNA的区域或由其组成，该双链RNA包含退火的互补链，其中的一条链，即有义链，包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。

靶核苷酸序列可以选自靶基因或其RNA转录物的任何合适区域或核苷酸序列。例如，靶核苷酸序列可以位于靶基因或RNA转录物的5’UTR或3’UTR内，或者基因的外显子或内含子区域内。本领域的技术人员熟知在全长靶基因背景下鉴定最合适的靶核苷酸序列的方法。例如，可以合成和测试靶向靶基因的不同区域的多种dsRNA。可替代地，用如RNAse H等酶消化RNA转录物可以被用来确定RNA上构象对基因沉默敏感的位点。靶位点也可以使用计算机模拟(in silico)方法，例如使用被设计成基于靶向全长基因内的不同位点来预测基因沉默效力的计算机算法进行鉴定。

优选地，通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)，使用默认设置确定多核糖核苷酸的％同一性，其中查询序列是至少约21至约23个核苷酸长度，并且GAP分析经至少约21个核苷酸的区域比对这两个序列。在另一个实施例中，查询序列至少150个核苷酸长度，并且GAP分析经至少150个核苷酸的区域比对这两个序列。在另外的实施例中，查询序列至少300个核苷酸长度并且GAP分析经至少300个核苷酸的区域比对这两个序列。在又另一个实施例中，查询序列对应于全长靶RNA(例如mRNA)，并且GAP分析经全长靶RNA比对这两个序列。

便利地，该dsRNA可以在重组宿主细胞中产生自单个开放阅读框，其中有义和反义序列的侧翼是不相关序列，该不相关序列使得有义和反义序列可以杂交以与该不相关序列形成该dsRNA分子，从而形成环结构。可替代地，有义链和反义链可以在不具有开放阅读框的情况下产生，以保证在转基因宿主细胞中将不制造蛋白质。这两条链还可以被分别表达为两种转录物，一种编码有义链并且一种编码反义链。

可以在细胞内部或外部启动RNA双链体形成。该dsRNA可以是部分或完全双链的。RNA可以在体外或在体内酶促地或化学地合成。

该dsRNA相对于初级转录产物或完全加工的RNA不需要是全长的。在本领域熟知的是，长度为约19-23bp的小dsRNA可用于触发靶基因的基因沉默。通常，可以使用较高的同一性来补偿较短的序列的使用。此外，该dsRNA还可以包含单链区域，例如该dsRNA可以是部分或完全双链的。该dsRNA的双链区域可以具有至少约19至约23个碱基对的长度，任选是约19至约50个碱基对的序列，任选是约50至约100个碱基对的序列，任选是约100至约200个碱基对的序列，任选是约200至约500个碱基对的序列，并且任选是约500至约1000个或更多个碱基对的序列，直到对于其全长是双链的分子，大小对应于全长靶RNA分子。Bolognesi等人(2012，PLOS One[公共科学图书馆·综合],7(10):e47534,通过引用并入本文)教导了在具有南方玉米根虫(SCR；黄瓜十一星叶甲食根亚种)的人工饲料生物测定中生物活性需要大于或等于约60bp的dsRNA。

Mao等人(2007,Nature Biotechnology[自然生物技术],35(11):1307-1313)教导了表达针对昆虫有害生物(棉螟蛉，棉铃虫)的靶基因(CYP6AE14)的dsRNA构建体的转基因植物。摄食转基因植物的昆虫在其中肠中具有约19-23bp大小的靶基因的小RNA，相应地减少了CYP6AE14转录物和蛋白质。这表明了小RNA在减少昆虫有害生物中靶基因的表达方面是有效的。因此，约19bp、约20bp、约21bp、约22bp、约23bp、约24bp、约25bp、约26bp、约27bp、约28bp、约29bp、或约30bp的小RNA可有效减少昆虫有害生物中靶基因的表达。

可替代地，dsRNA可以包含具有至少19个碱基对的靶dsRNA，并且靶dsRNA可以在dsRNA“运载体”或“填充物”序列内。例如，Bolognesi等人(2012)显示包含靶dsRNA的240bpdsRNA(其包含与靶序列具有100％同一性的21bp连续序列)在具有南方玉米根虫的生物测定中具有生物活性。本申请例示了在具有西方玉米根虫的生物测定中的类似方法。该靶dsRNA可以具有至少19至约25个碱基对的长度，任选是约19至约50个碱基对的序列，任选是约50至约100个碱基对的序列，任选是约100至约200个碱基对的序列，任选是约200至约500个碱基对的序列，以及任选是约500至约1000或更多个碱基对的序列。与运载体dsRNA序列组合，靶序列的dsRNA和运载体dsRNA可具有至少约50至约100个碱基对的总长度，任选地约100至约200个碱基对的序列，任选地约200至约500个的序列，和任选地约500至约1000个或更多个碱基对的序列。

该dsRNA可以包含已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接物，其是合成的、天然存在的及非天然存在的。此类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯以及2-O-甲基核糖核苷酸。

如本文所使用的，术语“特异性减少靶RNA的水平和/或由该RNA编码的靶蛋白的产生”及其变体是指该dsRNA的一条链的一部分的序列与该靶RNA足够同一，这样使得在细胞中存在的该dsRNA减少稳态水平和/或所述RNA的产生。在许多情况下，该靶RNA将是mRNA，并且在产生该mRNA的细胞中存在该dsRNA将导致所述蛋白的产生的减少。优选地，当与野生型细胞相比时，这一积累或产生被减少至少10％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，仍甚至更优选至少95％并且最优选100％。

抑制的后果可以通过检测该细胞或生物体的外表特性或通过生化技术加以确认，这些生化技术是例如但不限于，Northern杂交、逆转录、用微阵列监测基因表达、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)以及其他免疫测定。

本发明的干扰RNA可以包含一种dsRNA或多种dsRNA，其中每种dsRNA包含与在靶基因中的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成，并且在被昆虫有害生物摄入后起到下调所述靶基因的表达的作用。通过引用并入本文的WO 2006/046148中描述了这种类型的多联体RNA构建体。在本发明的上下文中，术语‘多个’意指至少两个，至少三个，至少四个等并且直到至少10、15、20个或至少30个。在一个实施例中，该干扰RNA包含单个dsRNA的多个拷贝，即结合至特定靶基因内的特定靶核苷酸序列的dsRNA的重复。在另一个实施例中，干扰RNA内的dsRNA包含与不同的靶核苷酸序列互补的不同核苷酸序列或由其组成。应该清楚的是，与结合于不同靶核苷酸序列的dsRNA组合的相同dsRNA的多个拷贝的组合是在本发明的范围内。

这些dsRNA可以安排为干扰RNA的一个连续区域或者可以通过接头序列的存在加以隔开。接头序列可以包含不与任何靶核苷酸序列或靶基因互补的短的随机核苷酸序列。在一个实施例中，该接头是条件性自切割RNA序列，优选是pH敏感性接头或疏水敏感性接头。在一个实施例中，该接头包含与内含子序列等效的核苷酸序列。本发明的接头序列的长度可以在从约1个碱基对到约10000个碱基对的范围内，其条件是该接头不会削弱干扰RNA下调靶基因的表达的能力。

除了这样的一种或多种dsRNA和任何接头序列，本发明的干扰RNA可以包含至少一种另外的多核苷酸序列。在本发明的不同实施例中，该另外的序列选自(i)能够保护干扰RNA免于RNA加工的序列，(ii)影响干扰RNA的稳定性的序列，(iii)允许蛋白质结合以例如促进干扰RNA被昆虫有害生物物种的细胞摄入的序列，(iv)促进大规模产生干扰RNA的序列，(v)作为结合于受体或结合于昆虫有害生物细胞表面上的分子以促进摄入的适体的序列，或(v)催化昆虫有害生物细胞中干扰RNA的加工并由此增强干扰RNA的效力的序列。用于增强RNA分子的稳定性的结构在本领域中是众所周知的并且进一步描述在WO 2006/046148中，该案通过引用并入本文。

该干扰RNA可以包含DNA碱基、非天然碱基或者糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰，例如以增强储存期间的稳定性或增强对核酸酶降解的抗性。此外，该干扰RNA可以由本领域的普通技术人员通过手动或自动反应化学地或酶促地产生。可替代地，该干扰RNA可以由编码其的多核苷酸转录。因此，本文提供了编码本发明的干扰RNA中的任一个的分离的多核苷酸。

微小RNA(miRNA)是不编码蛋白质的RNA，通常在约18至约25个核苷酸长度之间(植物中常见地是约20-24个核苷酸长度)。这些miRNA指导靶转录物的反式切割，负向调节参与各种调节及发育途径的基因的表达(Bartel,Cell[细胞],116:281-297(2004)；Zhang等人Dev.Biol.[发育生物学]289:3-16(2006))。照此，已经显示miRNA参与植物生长和发育的不同方面以及参与信号转导和蛋白质降解。此外，内源性小mRNA(包括miRNA)也可以参与生物胁迫反应，例如病原体攻击。自第一个miRNA在植物中发现以来(Reinhart等人，Genes Dev[基因与发育]).16:1616-1626(2002)，Park等人，Curr.Biol[当代生物学].12:1484-1495(2002))，已经鉴定了数百种miRNA。另外，已经示出许多植物miRNA是跨非常趋异性分类单元而高度保守的。(Floyd等人Nature[自然]428:485-486(2004)；Zhang等人Plant J.[植物杂志]46:243-259(2006))。许多微RNA基因(MIR基因)已经被鉴定并且是在数据库(“miRBase”，通过万维网可获得)中公开可获得的。美国专利公开2005/0120415和2005/144669A1中也描述了miRNA，该专利的全部内容通过引用并入本文。

编码miRNA的基因产生长度70bp至300bp的初级miRNA(称作“pri-miRNA”)，其可以形成不完美的茎环结构。单个初级miRNA可以含有从1个至若干个miRNA前体。在动物中，初级miRNA在细胞核中由RNA酶III Drosha及其辅因子DGCR8/Pasha加工成约65nt的更短发夹RNA(前miRNA)。这种前miRNA随后输出至细胞质，在那里，它由另一种RNA酶III—切丁酶(Dicer)进一步加工，释放出大小约22nt的miRNA/miRNA*双链体。与动物相反，在植物中，初级miRNA加工为成熟miRNA完全在细胞核内利用单一RNA酶III—DCL1(切丁酶样1)进行。(Zhu Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]105:9851-9852(2008))。关于microRNA生物发生和功能的许多综述，例如，参见Bartel Cell[细胞]116:281-297(2004),Murchison等人Curr.Opin.Cell Biol.[细胞生物学新见]16:223-229(2004),Dugas等人Curr.Opin.Plant Biol.[植物生物学新见]7:512-520(2004)和Kim Nature Rev.Mol.CellBiol.[自然分子细胞生物学综述]6:376-385(2005)。

如本文所使用的，术语“植物微小RNA前体分子”描述一种(约70nt-300nt)小非编码性RNA序列，它由植物酶加工以产生约19-24个核苷酸的产物，称作成熟微小RNA序列。这些成熟序列通过与信使RNA(mRNA)的互补性而具有调节作用。术语“人工植物微小RNA前体分子”描述在加工之前的非编码miRNA前体序列，其中经由以下方式使用该前体序列作为递送siRNA分子的主链序列，将这种miRNA前体分子的内源性天然miRNA/miRNA*双链体置换为一种非天然异源性miRNA的双链体(amiRNA/amiRNA*；例如siRNA/siRNA*)，后一种双链体然后与该siRNA序列一起加工为成熟miRNA序列。

在本发明的背景下，用于描述本发明的dsRNA的术语“有毒的”意指本发明的这些dsRNA分子以及此类dsRNA分子的组合作为对昆虫具有负面作用的口服有效昆虫控制试剂而起作用。当本发明的一种组合物被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以使该组合物可供该昆虫使用的来源为食。这样一种组合物可以是一种表达本发明的dsRNA的转基因植物。

如本文所使用的，“鞘翅目昆虫”是指鞘翅目的任何成员，包括鞘翅目植物有害生物。根据本发明的鞘翅目有害生物昆虫的非限制性实例包括根萤叶甲属中的玉米根虫物种，如巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫；NCR)、西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫；SCR)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫；MCR)和南美根萤叶甲(D.speciose)；瘦跗叶甲属物种，如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)；叶甲虫属物种(Chrysomela spp.)，如黑杨叶甲(C.scripta)(黑杨叶甲虫(cottonwood leafbeetle)；CLB)；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹(H.hampei)(咖啡豆钻孔虫(coffee berry borer))；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais)(玉蜀黍象(maize weevil))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis)(烟草跳(tobacco flea beetle))和黄瓜跳甲(E.cucumeris)(马铃薯跳甲(potato fleabeetle))：条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如萝卜菜跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲(crucifer flea beetle))和西方黑跳甲(P.pusilla)(西方黑色跳甲(westernblack flea beetle))；花象属物种(Anthonomus spp.)，如胡椒花象(A.Eugenii)(胡椒茎象甲(pepper weevil)；PW)；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius)(铁线虫(wireworms))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如普通梳爪叩头甲(M.communis)(铁线虫)；荚象甲属物种(Ceutorhychus spp.)，如白菜籽龟象(C.assimilis)(甘蓝心皮象鼻虫(cabbage seedpod weevil))；Aeolus属物种(Aeolusspp.)，如A.mellillus(铁线虫)；Aeolus属物种，如A.mancus(小麦铁线虫(wheatwireworm))；砂铁线属物种(Horistonotus spp.)，如砂铁线虫(H.uhlerii)(沙子铁线虫(sand wireworm))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis)(玉蜀黍谷象(maize billbug))、梯牧草谷象(S.zeae)(梯牧草谷象虫(timothy billbug))、牧草长喙象(S.parvulus)(早熟禾谷象(bluegrass billbug))和南方玉米长喙象(S.callosus)(南方玉米谷象(southern corn billbug))；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米铜色跳甲(C.pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beetle))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)，如日本弧丽金龟(P.japonica)(日本金龟子(Japanese beetle))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如菜豆莹叶甲(C.trifurcate)(豆叶甲(bean leaf beetle))；豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata)(斑蝥(blister beetles))；以及前述的任何组合。

如本文所使用的，“半翅目昆虫”是指半翅目的任何成员，包括半翅目植物有害生物。根据本发明的半翅目有害生物昆虫的非限制性实例包括英雄美洲蝽(棕色蝽象)、稻绿蝽(绿色蝽象)和盖德拟壁蝽(红色带蝽象)。

术语“农用化学活性成分”是指化学和/或生物学组合物，如本文所述的那些，它们在杀害、预防或者控制所不希望的有害生物的生长方面有效，如植物、昆虫、小鼠、微生物、藻类、真菌、细菌以及类似物(如杀生物活性成分)。本发明的干扰RNA分子是农用化学活性成分。

“农业上可接受的运载体”包括有益于活性成分(如本发明的干扰RNA分子)施用的佐剂、混合剂、增强剂等。合适的运载体不应对有价值的作物具有植物毒性，特别是在作物存在下施用组合物时所用的浓度，并且不应与本文的活性成分的化合物(即本发明的干扰RNA或其他组合物成分)发生化学反应。此类混合物可以设计用于直接施用于作物，或者可以是浓缩物或配制品，其通常在施用前用另外的运载体和佐剂进行稀释。它们可包括惰性或活性组分，并且可以是固体，如例如尘剂、颗粒剂、水可分散性颗粒剂、或可湿性粉剂，或液体，如例如可乳化性浓缩物、溶液、乳液或悬浮液。合适的农业运载体可包括液体运载体，例如水、甲苯、二甲苯、石脑油、作物油、丙酮、甲基乙基酮、环己酮、三氯乙烯、全氯乙烯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、乙酸丁酯、丙二醇单甲醚和二乙二醇单甲醚、甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、甘油以及类似物。水通常是用以稀释浓缩物的选用运载体。合适的固体运载体可包括滑石、叶腊石粘土、硅石、凹凸棒石粘土、砂藻土(kieselguhr)、白垩、硅藻土(diatomaxeous earth)、石灰、碳酸钙、膨润土、漂白土、棉子壳、小麦粉、大豆粉、浮石、木粉、核桃壳粉、木质素等。

对于本发明，农业上可接受的运载体还可以包括携带昆虫控制试剂(即本发明的干扰RNA分子)的非致病性减毒微生物菌株。在这种情况下，携带干扰RNA的微生物也可称为昆虫控制试剂。可将微生物工程化以表达靶基因的核苷酸序列以产生干扰RNA分子，该干扰RNA分子包含与典型地在昆虫细胞内发现的RNA序列同源或互补的RNA序列。昆虫暴露于微生物导致微生物的摄入和由干扰RNA分子或其片段或衍生物直接或间接介导的靶基因表达的下调。

在另一个实施例中，干扰RNA分子可以被包封在合成基体(如聚合物)中，并施用于宿主(如植物)的表面。昆虫摄入宿主细胞允许将昆虫控制试剂递送至昆虫并导致宿主中靶基因的下调。

本发明的组合物，例如包含本发明的干扰RNA分子和农业上可接受的运载体的组合物，可用于常规农业方法中。例如，本发明的组合物可以与水和/或肥料混合，并且可以通过任何手段在出苗前和/或出苗后施用至所希望的场所，如飞机喷雾桶、灌溉设备、直接注射喷雾设备、背负式喷雾桶、家畜浸渍槽、在地面喷雾中使用的农场设备(例如，喷管式喷雾器、手动喷雾器)等。所希望的场所可以是土壤、植物等。

本发明的组合物可以在以下时间施用至处于任何生理状态下的种子或植物繁殖体：在种子收获和播种之间的任何时间；或在播种期间或播种后；和/或发芽后。优选种子或植物繁殖体处于足够耐用的状态，使得在处理过程期间不会造成损害或造成最小的损害，包括物理损害或生物损害。配制品可以使用常规的包衣技术以及机器(如流化床技术、滚筒研磨方法、静态转动(rotostatic)种子处理器和转鼓包衣器)施用至种子或植物繁殖体上。

在本发明的背景下，后缀“mer”前的数字指示亚基的特定数目。当应用于RNA或DNA时，这指定了分子中碱基的数目。例如，具有序列ACUGGUCGCGUUGCAUGCU的mRNA的19个核苷酸子序列是“19-mer”。

“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(诸如像植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。

“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

如本文所使用的，“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

玉米根虫“转录组”是玉米根虫细胞中的所有或几乎所有的核糖核酸(RNA)转录物的集合。

“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。特别地，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物的基因组中。

“转化的/转基因的/重组的”是指异源核酸分子已经引入其中的宿主生物例如细菌或植物。核酸分子可以稳定整合到宿主基因组中，或者，核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含该异源的核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。

本文的核苷酸通过其碱基由以下标准缩写进行指示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。氨基酸也由以下标准缩写表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。

本发明基于意想不到的结果，即设计成靶向本文所述有害生物昆虫必需基因可转录的mRNA的双链RNA(dsRNA)或小干扰RNA(siRNA)对有害生物昆虫具有毒性并且可以用于控制植物的有害生物昆虫侵染并赋予转基因植物对有害生物昆虫侵染，特别是鞘翅目和/或半翅目有害生物昆虫侵染侵害的耐受性。因此，在一个实施例中，本发明提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，其包含有义链和反义链，其中所述反义链的核苷酸序列与可从本文所述的有害生物昆虫基因转录的mRNA多核苷酸的一部分互补，其中所述dsRNA分子对有害生物昆虫，特别是鞘翅目和/或半翅目有害生物昆虫具有毒性。

本发明涉及由以下序列编码的RNA，该序列包含：SEQ ID NO:1-1814中的任一个、SEQ IDNO:1-1814中的任一个的至少19个核苷酸的片段、SEQ ID NO:1-1814中的任一个的至少19个核苷酸的片段中任何的互补序列或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列，其中所述RNA在转录后地沉默植物有害生物中的必需基因。

本领域已知，与靶序列不完全互补的dsRNA分子(例如，与靶基因仅具有95％同一性)对控制鞘翅目有害生物是有效的(参见，例如，Narva等人,美国专利号9,012,722)。本发明提供了包含至少一种dsRNA的干扰RNA分子，其中该dsRNA是包含退火的至少部分互补的链的双链RNA的区域。该dsRNA的一条链包含具有至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的序列，其与昆虫有害生物靶基因内的靶核苷酸序列是至少部分互补的。该干扰RNA分子(i)与SEQ ID NO:3629-7256的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性；(ii)包含SEQ IDNO:3629-7256的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)包含编码由SEQ ID NO:3629-7256编码的氨基酸序列的核苷酸序列的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交，该组由以下组成：SEQ ID NO:3629-7256，及其互补序列，其中该干扰RNA分子对鞘翅目和/或半翅目植物有害生物具有杀昆虫活性。在一些实施例中，干扰RNA分子包含与SEQ ID NO:3629-7256中的任一个或其互补序列具有至少85％同一性(例如，至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的核苷酸片段。

在一些实施例中，该干扰RNA分子包含至少两种dsRNA，其中每种dsRNA包含如下核苷酸序列，该序列与该靶基因内的靶核苷酸序列是至少部分互补的。在一些实施例中，靶基因包含SEQ ID NO:1-1814中的任一个。在一些实施例中，每种dsRNA包含不同的核苷酸序列，该核苷酸序列与该靶基因内的不同靶核苷酸序列是互补的。在其他实施例中，每种dsRNA包含不同的核苷酸序列，该核苷酸序列与两个不同的靶基因内的靶核苷酸序列是互补的。

在一些实施例中，该干扰RNA分子包含如下dsRNA，该dsRNA可以包含从至少18至约25个连续核苷酸(例如18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)到至少约300个连续核苷酸，基本由其组成或由其组成。可以在3’末端、5’末端或3’和5’末端二者处添加另外的核苷酸，以促进dsRNA分子的操作但是不实质地影响该dsRNA分子在RNA干扰(RNAi)中的基本特征或功能。

在一些实施例中，该干扰RNA分子包含如下dsRNA，该dsRNA包含与SEQ ID NO:3629-7256的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个连续核苷酸，或其互补序列互补的反义链。在其他实施例中，dsRNA的部分包含以下、基本由以下组成或由以下组成：SEQID NO:3629-7256的至少从19、20或21个连续核苷酸到至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个连续核苷酸或其互补序列。在一些实施例中，dsRNA的部分包含与SEQ ID NO:3629-7256中的任一个或其互补序列具有至少85％同一性(例如，至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性)的核苷酸片段。

在其他实施例中，本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA，该dsRNA包含以下，基本上以下其组成或由以下组成：由N至N+20个核苷酸组成的SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的任何21-mer子序列，或其任何互补序列。例如，本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA，该dsRNA包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:5443的任何21-mer子序列，或其任何互补序列，其中N是SEQ ID NO:5443的核苷酸1至核苷酸201。换言之，被靶向的mRNA的该部分包含2020个SEQ ID NO:5443的21个连续核苷酸(即21-mer)的子序列中的任一个，或其任何互补序列。

在仍其他实施例中，本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA，该dsRNA包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:3629-7256，或其互补序列。

在其他实施例中，干扰RNA分子包含本发明的dsRNA的反义链，该反义链包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:3629-7256的核苷酸序列中的任一个的反义链。本发明的dsRNA的反义链的核苷酸序列在3’或5’末端可以缺失一个核苷酸或在3’末端、5’末端或两者处可以添加多达6个核苷酸(以任何组合)，以实现反义链基本由任何19-mer、任何20-mer、或任何21-mer核苷酸序列组成，因为将理解的是，缺失1个核苷酸或添加多达6个核苷酸不实质地影响本发明的双链RNA分子的基本特征或功能。这类另外的核苷酸可以是沿靶序列延伸反义链互补性的核苷酸和/或这类核苷酸可以是促进RNA分子或编码该RNA分子的核酸分子的操作的核苷酸，如本领域的普通技术人员将已知。例如，在3’末端可以存在TT突出端，使用该突出端来稳定siRNA双链体并且不影响该siRNA的特异性。

在本发明的一些实施例中，该干扰RNA分子的双链RNA的反义链可以与该靶RNA多核苷酸完全互补，或该反义链可以与靶RNA多核苷酸基本上互补或部分互补。该干扰RNA分子的dsRNA可以包含如下dsRNA，该dsRNA是包含基本上互补的退火链的双链RNA的区域，或是包含完全互补的退火链的双链RNA的区域。基本上或部分互补意指反义链和靶RNA多核苷酸可以按约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸配对错配。可以将这类错配引入反义链序列中，例如，靠近3’末端，以便增强双链RNA分子由切丁酶加工，以便在插入本发明的嵌合核酸分子或人工微小RNA前体分子内的siRNA分子中重复错配样式等，如本领域的普通技术人员将已知。这类修饰将在双链体的一个末端削弱碱基配对作用并且产生链非对称性，因此增大反义链(而非有义链)受到加工和沉默预期基因的几率(Geng和Ding“Double-mismatchedsiRNAs enhance selective gene silencing of a mutant ALS-causing Allele1[双错配siRNA增强造成突变ALS的等位基因1的选择性基因沉默]”Acta Pharmacol.Sin.[中国药理学报]29:211-216(2008)；Schwarz等人“Asymmetry in the assembly of the RNAienzyme complex[RNAi酶复合体的组合体中的非对称性]”Cell[细胞]115:199-208(2003))。

在本发明的一些实施例中，该干扰RNA包含一种含有短发夹RNA(shRNA)分子的dsRNA。shRNA在细胞中的表达典型地通过将质粒或重组载体递送例如进入转基因植物(如转基因玉米)中而完成。

本发明涵盖一种包含本发明的干扰RNA的核酸构建体。本发明进一步涵盖如下核酸分子，该核酸分子编码本发明的至少一种干扰分子。本发明进一步涵盖如下核酸构建体，该核酸构建体包含本发明的至少一种干扰分子，或包含编码本发明的至少一种干扰分子的核酸分子。本发明进一步涵盖如下核酸构建体，其中该核酸构建体是表达载体。本发明进一步涵盖如下重组载体，该重组载体包含可操作地连接至编码本发明的干扰RNA分子的核苷酸序列的调节序列。调节序列可以意指一种启动子、增强子、转录因子结合位点、隔离子、沉默子、或参与基因表达的任何其他DNA元件。

本发明进一步涵盖如下嵌合核酸分子，该嵌合核酸分子包含具有dsRNA的反义链的干扰RNA分子，该dsRNA可操作地连接至植物微小RNA前体分子。在一些实施例中，该嵌合核酸分子包括反义链，该反义链具有SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的21-mer子序列的任一个的核苷酸序列或其互补序列，该反义链可操作地连接至植物微小RNA前体分子。在一些实施例中，该植物微小RNA前体分子是一种玉蜀黍微小RNA前体。

在一些实施例中，本发明涵盖一种人工植物微小RNA前体分子，该前体分子包含本发明的干扰RNA分子的dsRNA的一条反义链。在其他实施例中，该人工植物微小RNA前体分子包含具有SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的反义链的19-mer、20-mer或21-mer子序列中的任一个的核苷酸序列的反义链。使用人工植物微小RNA将感兴趣的核苷酸序列(例如人工miRNA；siRNA/siRNA*)递送进植物中在本领域是已知的(参见例如，Schwab等人2006ThePlant Cell[植物细胞]18:1121-1133)。在本发明中，这些人工微小RNA是其中插入植物微小RNA前体主链和昆虫siRNA序列的嵌合或杂交分子。如本领域的普通技术人员将理解，典型地希望维持错配，这些错配正常情况下在植物微小RNA前体序列中存在于被置换入该植物微小RNA前体主链中的任何核苷酸序列中。在仍其他实施例中，该人工植物微小RNA前体包含玉米微小RNA前体分子的部分。任何玉米微小RNA(miRNA)前体都适于本发明的这些组合物和方法。非限制性实例包括miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166、miR167、miR168、miR169、miR171、miR172、miR319、miR390、miR393、miR394、miR395、miR396、miR397、miR398、miR399、miR408、miR482、miR528、miR529、miR827、miR1432以及现在已知或后来被鉴定出的任何其他植物miRNA前体。

在一些实施例中，本发明涵盖干扰RNA分子、核酸构建体、核酸分子、或重组载体，其包含本发明的干扰RNA分子的dsRNA的至少一条链，或包含本发明的嵌合核酸分子，或包含本发明的人工植物微小RNA。在一些实施例中，该核酸构建体包含本发明的核酸分子。在其他实施例中，该核酸构建体是一种重组表达载体。

作为本发明靶的植物有害生物昆虫包括以下中的那些昆虫：鞘翅目(甲虫)、鳞翅目(蛾、蝴蝶)、双翅目(蝇)、原尾目、弹尾目(跳虫)、双尾目、石蛹目(跳蛀虫)、缨翅目(蛀虫、蠹虫)、蜉蝣目(蜉蝣)、蜻蜓目(蜻蜓、豆娘)、直翅目(草蜢、蟋蟀、蝈蝈)、竹节虫目(竹节虫)、蛩蠊目(岩石爬虫)、螳目、革翅目(地蜈蚣)、襀翅目(石蝇)、纺足目(纺足虫)、缺翅目、等翅目(白蚁)、螳螂目(螳螂)、蜚蠊目(蟑螂)、半翅目(蝽虫、蝉、叶蝉、蚜虫、蚧)、缨翅目(牧草虫)、啮虫目(书虱和树虱)、虱毛目(虱；包括但不限于钝角亚目、丝角亚目和虱亚目)、脉翅目(草蜻蛉、蝶角蛉、螳蛉、蚁蛉)、膜翅目(蜜蜂、蚁、黄蜂)、毛翅目(毛翅蝇)、蚤目(跳蚤)、长翅目(蝎蛉)、捻翅目(捻翅寄生虫)，并且优选鞘翅目和/或半翅目。

更优选地，本发明的靶昆虫有害生物选自由以下组成的组：鞘翅目昆虫有害生物米象(So；稻象)、玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Du；南方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(Db；北方玉米根虫)、辣根菜跳甲(Pa；辣根跳甲)、芫菁淡足跳甲(Pn；芜菁跳甲)、萝卜菜跳甲(Pu；十字花科植物跳甲)、黄曲条跳甲(Ps；条纹跳甲)、芜菁黑跳甲(Pt；跳甲)、油菜兰跳甲(Pc；甘蓝茎跳甲)、油菜露尾甲(Ma；花粉甲虫)、白菜籽龟象(Ca；甘蓝心皮象鼻虫)、马铃薯甲虫(Ld；科罗拉多马铃薯甲虫)、和/或半翅目昆虫有害生物选自由以下组成的组：稻绿蝽(Nv；绿色椿象)、英雄美洲蝽(Eh；棕色椿象)、和盖德拟壁蝽(Pg；红带椿象)。

在一些实施例中，昆虫有害生物是象甲属物种，优选米象，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-116中的任一个或SEQID NO:1-116中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1-116中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1-116中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或可在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制象甲属物种中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:3629-3744中的任一个，SEQ ID NO:3629-3744中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:3629-3744具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:3629-3744中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，昆虫有害生物是根萤叶甲属物种，优选是选自下组的根萤叶甲属物种，该组由以下组成：西方玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Du；南方玉米根虫)和巴氏根萤叶甲(Db；北方玉米根虫)。在一些实施例中，有害生物是西方玉米根萤叶甲(Dv)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:117-228中的任一个或SEQ ID NO:117-228中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:117-228中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ IDNO:117-228中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或可在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Dv有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:3745-3856中的任一个，SEQ ID NO:3745-3856中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:3745-3856中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:3745-3856中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是黄瓜十一星叶甲食根亚种(Du)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:229-340中的任一个或SEQ ID NO:229-340中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:229-340中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:229-340中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或可在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Du有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:3857-3968中的任一个，SEQ ID NO:3857-3968中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:3857-3968中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:3857-3968中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是巴氏根萤叶甲(Db)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:341-451中的任一个或SEQ ID NO:341-451中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:341-451中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:341-451中的任一个的任何至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或可在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Db有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:3969-4079中的任一个，SEQ ID NO:3969-4079中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:3969-4079中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:3969-4079中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，昆虫有害生物是跳甲有害生物物种，优选是选自下组的跳甲有害生物物种，该组由以下组成：辣根菜跳甲(Pa；辣根跳甲)、芫菁淡足跳甲(Pn；芜菁跳甲)、萝卜菜跳甲(Pu；十字花科植物跳甲)、黄曲条跳甲(Ps；条纹跳甲)、芜菁黑跳甲(Pt；跳甲)和油菜兰跳甲(Pc；甘蓝茎跳甲)。在一些实施例中，有害生物是辣根菜跳甲(Pa)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:452-564中的任一个或SEQ ID NO:452-564中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:452-564中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:452-564中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Pa有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4080-4192中的任一个，SEQID NO:4080-4192的互补序列，与SEQ ID NO:4080-4192中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:4080-4192中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是芫菁淡足跳甲(Pn)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:565-679中的任一个或SEQ ID NO:565-679中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:565-679中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:565-679中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Pn有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4193-4307中的任一个，SEQ ID NO:4193-4307的互补序列，与SEQ ID NO:4193-4307中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ IDNO:4193-4307中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是萝卜菜跳甲(Pu)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:680-789中的任一个或SEQ ID NO:680-789中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:680-789中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:680-789中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Pu有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4308-4417中的任一个，SEQ ID NO:4308-4417的互补序列，与SEQ ID NO:4308-4417中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ IDNO:4308-4417中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是黄曲条跳甲(Ps)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:790-905中的任一个或SEQ ID NO:790-905中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:790-905中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:790-905中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Ps有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4418-4533中的任一个，SEQ ID No:4418-4533的互补序列，与SEQ ID NO:4418-4533中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ IDNO:4418-4533中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是芜菁黑跳甲(Pt)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:906-1020中的任一个或SEQ ID NO:906-1020中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:906-1020中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:906-1020中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Pt有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4534-4648中的任一个，SEQ ID NO:4534-4648的互补序列，与SEQ ID NO:4534-4648中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:4534-4648中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是油菜兰跳甲(Pc)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1021-1133中的任一个或SEQ ID NO:1021-1133中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1021-1133中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1021-1133中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Pc有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4649-4761中的任一个，SEQ ID NO:4649-4761的互补序列，与SEQ ID NO:4649-4761中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:4649-4761中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是油菜露尾甲(Ma)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1134-1248中的任一个或SEQ ID NO:1134-1248中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1134-1248中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1134-1248中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Ma有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4762-4876中的任一个，SEQ ID NO:4762-4876中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:4762-4876中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:4762-4876中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，有害生物是白菜籽龟象(Ca)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1249-1360中的任一个或SEQ ID NO:1249-1360中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1249-1360中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1249-1360中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Ca有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4877-4988中的任一个，SEQ ID NO:4877-4988中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:4877-4988中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:4877-4988中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，昆虫有害生物是半翅目昆虫有害生物，优选是选自下组的半翅目昆虫有害生物，该组由以下组成：稻绿蝽(Nv)、英雄美洲蝽(Eh)和盖德拟壁蝽(Pg)。在一些实施例中，昆虫有害生物是稻绿蝽(Nv)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1361-1473中的任一个或SEQ ID NO:1361-1473中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1361-1473中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1361-1473中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Nv有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:4989-5101中的任一个，SEQ ID NO:4989-5101中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:4989-5101中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:4989-5101中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，昆虫有害生物是英雄美洲蝽(Eh)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1474-1586中的任一个或SEQ IDNO:1474-1586中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1474-1586中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1474-1586中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Eh有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:5102-5214中的任一个，SEQ ID NO:5102-5214中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:5102-5214中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:5102-5214中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，昆虫有害生物是盖德拟壁蝽(Pg)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1587-1699中的任一个或SEQ IDNO:1587-1699中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1587-1699中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1587-1699中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Pg有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:5215-5327中的任一个，SEQ ID NO:5215-5327中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:5215-5327中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:5215-5327中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，昆虫有害生物是马铃薯甲虫(Ld)，并且本发明的dsRNA靶向的基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1700-1814中的任一个或SEQ IDNO:1700-1814中的任一个的互补序列，SEQ ID NO:1700-1814中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段，SEQ ID NO:1700-1814中的任一个的任何至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个或更多个核苷酸的片段的互补序列，或在严格条件下与任何上述序列杂交的序列；其中所述RNA有效抑制Ld有害生物中靶序列的表达。优选地，该序列是或包含SEQ ID NO:5328-5442中的任一个，SEQ ID NO:5328-5442中的任一个的互补序列，与SEQ ID NO:5328-5442中的任一个具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列，或与SEQ ID NO:5328-5442中的任一个的互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的任何序列。

在一些实施例中，本发明涵盖包含一种或多种或者两种或更多种本发明的干扰RNA分子的组合物。在一些实施例中，干扰RNA分子存在于同一核酸构建体上、不同的核酸构建体上或其任何组合上。例如，本发明的一种干扰RNA分子可以存在于核酸构建体上，并且本发明的第二干扰RNA分子可以存在于同一核酸构建体上或单独的第二核酸构建体上。本发明的第二干扰RNA分子可以针对相同的靶基因或不同的靶基因。

在一些实施例中，本发明涵盖包含如下干扰RNA分子的组合物，该干扰RNA分子包含至少一种dsRNA，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域。该dsRNA的一条链包含具有至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的序列，其与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分互补，该靶基因包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-1814。在一些实施例中，该干扰RNA分子(i)与SEQ ID NO:3629-7256中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性；(ii)包含SEQ ID NO:3629-7256中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)包含编码由SEQ ID NO:3629-7256中的任一个编码的氨基酸序列的核苷酸序列的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自由SEQ ID NO:3629-7256中的任一个组成的组的多核苷酸及其互补序列杂交。

在一些实施例中，本发明涵盖包含一种干扰RNA分子的组合物，该干扰RNA分子包含两种或更多种dsRNA，其中这两种或更多种dsRNA各自包含不同的反义链。在一些实施例中，本发明涵盖包含至少两种或更多种干扰RNA分子的组合物，其中这两种或更多种干扰RNA分子各自包含含有不同的反义链的dsRNA。这两种或更多种干扰RNA可以在相同的核酸构建体上、在不同的核酸构建体上、或其任何组合上存在。在其他实施例中，组合物包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的至少19个连续核苷酸的片段的核苷酸序列组成，并且在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的至少19个连续核苷酸的片段的第二核苷酸序列组成；并且在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的反义链的至少19个连续核苷酸的片段的第三核苷酸序列组成，并且在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的反义链的至少19个连续核苷酸的片段的第四核苷酸序列组成，并且在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256的反义链的至少19个连续核苷酸的片段的第五核苷酸序列组成，并且在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的反义链的至少19个连续核苷酸的片段的第六核苷酸序列组成，并且在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA分子，该RNA分子包含反义链，该反义链基本上由包含SEQ ID NO:5443-7256中的任一个的反义链的至少19个连续核苷酸的片段的第七核苷酸序列组成。在其他实施例中，该组合物可以包含两种或更多种核酸分子，其中这两种或更多种核酸分子各自编码不同的干扰RNA分子。在其他实施例中，该组合物可以包含两种或更多种核酸构建体，其中这两种或更多种核酸构建体各自包含编码不同干扰RNA的核酸分子。

在其他实施例中，该组合物包含本发明的两种或更多种核酸构建体、两种或更多种核酸分子、两种或更多种嵌合核酸分子、两种或更多种人工植物微小RNA前体，其中这两种或更多种核酸构建体、两种或更多种核酸分子、两种或更多种嵌合核酸分子、或两种或更多种人工植物微小RNA前体各自包含一条不同的反义链。

在一些实施例中，本发明包括用于抑制本文所述的昆虫有害生物基因表达的杀昆虫组合物，其包含至少一种本发明的干扰RNA和/或编码其的DNA和/或本发明的表达构建体和/或表达本发明的RNA分子细胞(活性的或灭活的)和农业上可接受的运载体。例如，本发明的组合物可以与水和/或肥料混合，并且可以通过任何手段在出苗前和/或出苗后施用至所希望的场所，如飞机喷雾桶、灌溉设备、直接注射喷雾设备、背负式喷雾桶、家畜浸渍槽、在地面喷雾中使用的农场设备(例如，喷管式喷雾器、手动喷雾器)等。所希望的场所可以是土壤、植物等。

在一些实施例中，可接受的农用运载体是可用于将包含该干扰RNA分子的杀昆虫组合物局部施用至植物或种子的配制品。在一些实施例中，所述配制品可以是适合于施用于植物、种子或直接施用于靶有害生物昆虫的任何形式。在一方面，配制品可以是呈固体形式(粉末、球粒或诱饵)、液体形式或凝胶形式。在一些实施例中，这些干扰RNA分子稳定对抗降解，由于其双链性质和DNA酶/RNA酶抑制剂的引入。例如，可以通过包括胸苷或尿苷核苷酸3’突出端来稳定dsRNA或siRNA。包含在本发明的组合物中的dsRNA或siRNA能大量地以工业规模化学地合成。可获得的方法将是通过化学合成或通过使用生物剂。

在其他实施例中，该配制品包含一种转染促进剂。在其他实施例中，该转染促进剂是一种含脂质化合物。在进一步的实施例中，含脂质的化合物选自由以下组成的组：Lipofectamine、Cellfectin、DMRIE-C、DOTAP和Lipofectin。在另一个实施例中，该含脂质化合物是Tris阳离子脂质。

在一些实施例中，该配制品进一步包含一种核酸冷凝剂。该核酸冷凝剂可以是本领域已知的任何此类化合物。核酸冷凝剂的实例包括但不限于，亚精胺(N-[3-氨基丙基]-1,4-丁二胺)、鱼精蛋白硫酸盐、聚赖氨酸以及其他带正电的肽。在一些实施例中，该核酸冷凝剂是亚精胺或鱼精蛋白硫酸盐。

在仍另外的实施例中，该配制品进一步包含缓冲的蔗糖或磷酸盐缓冲生理盐水。

本发明的组合物可以在以下时间施用至处于任何生理状态下的种子或植物繁殖体：在种子收获和播种之间的任何时间；或在播种期间或播种后；和/或发芽后。优选种子或植物繁殖体处于足够耐用的状态，使得在处理过程期间不会造成损害或造成最小的损害，包括物理损害或生物损害。配制品可以使用常规的包衣技术以及机器(如流化床技术、滚筒研磨方法、静态转动(rotostatic)种子处理器和转鼓包衣器)施用至种子或植物繁殖体上。

为了如本发明的方法所要求，将一种活性成分施用于昆虫和/或有用植物的作物，所述活性成分能以纯的形式或更典型地配制成组合物来使用，该组合物除了所述活性成分以外，还包括合适的惰性稀释剂或运载体以及可任选地表面活性剂(SFA)。SFA是能够通过降低界面张力修改界面(例如液/固、液/气或液/液界面)特性并且由此引起其他特性(例如分散、乳化以及湿润)变化的化学品。SFA包括非离子性、阳离子性和/或阴离子性表面活性剂，以及表面活性剂的混合物。因此在根据上文中提到的本发明的任何方面的其他实施例中，该活性成分将会呈组合物形式，该组合物另外包含一种农业上可接受的运载体或稀释剂。

这些组合物可以选自多种配制品类型，包括可尘化粉剂(DP)、可溶性粉剂(SP)、水溶性颗粒剂(SG)、水可分散性颗粒剂(WG)、可湿性粉剂(WP)、颗粒剂(GR)(慢或快释的)、可溶性浓缩物(SL)、油易混合的液体(OL)、超低体积液体(UL)、可乳化性浓缩物(EC)、可分散性浓缩物(DC)、乳液(水包油(EW)和油包水(EO)两者)、微乳液(ME)、悬浮浓缩物(SC)、气溶胶、雾/烟配制品、胶囊悬浮液(CS)以及种子处理配制品。在任何情况下选择的制剂类型将取决于预期的特定目的以及活性成分的物理，化学和生物学特性。

可粉尘化粉剂(DP)可通过将活性成分与一种或多种固体稀释剂(例如，天然粘土、高岭土、叶蜡石、膨润土、氧化铝、蒙脱石、硅藻土(kieselguhr)、白垩土、硅藻土(diatomaceous earths)、磷酸钙、碳酸钙和碳酸镁、硫、石灰、面粉、滑石以及其他有机和无机的固体运载体)混合，并将该混合物机械地研磨成细粉末来制备。

可通过将活性成分与一种或多种水溶性无机盐(例如碳酸氢钠，碳酸钠或硫酸镁)或一种或多种水溶性有机固体(例如多糖)混合来制备可溶性粉剂(SP)。任选地，一种或多种润湿剂，一种或多种分散剂或所述试剂的混合物以改善水的分散性/溶解性。然后将所述混合物研磨成细粉末。也可以将类似的组合物颗粒化以形成水溶性颗粒剂(SG)。

可湿性粉剂(WP)可以通过将活性成分与一种或多种固体稀释剂或运载体、一种或多种湿润剂以及优选地，一种或多种分散剂，以及可任选地，一种或多种悬浮剂进行混合来制备以促进在液体中的分散。然后将所述混合物研磨成细粉末。也可以将类似的组合物颗粒化以形成水可分散性颗粒剂(WG)。

颗粒剂(GR)可通过将活性成分与一种或多种粉状固体稀释剂或运载体的混合物颗粒化来形成，或者通过将活性成分(或其在一种合适试剂中的溶液)吸收进多孔颗粒材料(如浮石、凹凸棒石粘土、漂白土、硅藻土(kieselguhr)、硅藻土(diatomaceous earths)或玉米穗轴粉)，或者通过将活性成分(或其在合适试剂中的溶液)吸附到硬芯材料(如沙、硅酸盐、矿物碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐)上并且必要时进行干燥来由预成型的空白颗粒形成。通常用于帮助吸收或吸附的试剂包括溶剂(如脂肪族和芳香族石油溶剂、醇、醚、酮以及酯)和粘着剂(如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、糊精、糖以及植物油)。一种或多种其他添加剂还可以被包含在颗粒剂(例如乳化剂、湿润剂或分散剂)中。

可通过将活性成分溶解在水或有机溶剂(例如酮，醇或乙二醇醚)中来制备可分散性浓缩物(DC)。这些溶液可以包含表面活性剂(例如以改进水稀释或防止喷雾罐中的结晶)。可乳化性浓缩物(EC)或水包油乳液(EW)可以通过将活性成分溶解于一种有机溶剂(可任选地含有一种或多种润湿剂、一种或多种乳化剂或所述试剂的混合物)中进行制备。用于EC的合适的有机溶剂包括芳香族烃(例如烷基苯或烷基萘，通过SOLVESSO 100、SOLVESSO15060以及SOLVESSO 200来举例说明；SOLVESSO是一个注册商标)、酮(例如环己酮或甲基环己酮)和醇(例如苄醇、呋喃甲醇或丁醇)、N-烷基吡咯烷酮(例如N-甲基吡咯烷酮或N-辛基吡咯烷酮)、脂肪酸的二甲酰胺(例如C8-C10脂肪酸二甲酰胺)以及氯化烃。EC产品可以在添加到水中时自发地乳化，从而产生具有足够稳定性的乳液，以允许通过适当设备进行喷洒施用。EW的制备涉及获得作为液体(如果其在室温下不是液体，其可以在典型地低于70℃的合理温度下被熔化)或溶液(通过将其溶于合适的溶剂)形式的活性成分，并且然后在高剪切下将所得液体或溶液乳化进包含一种或多种SFA的水中，以产生乳液。在EW中使用的合适的溶剂包括植物油、氯化烃(如氯苯)、芳香族溶剂(如烷基苯或烷基萘)以及在水中具有低溶解度的其他适当的有机溶剂。

微乳液(ME)可以通过将水与一种或多种溶剂和一种或多种SFA的共混物混合进行制备，以自发地产生热力学稳定的各向同性的液体配制品。活性成分起初存在于水或溶剂/SPA共混物之中。适用于ME的溶剂包括以上所述用于EC或EW中的那些。ME可以是水包油体系或油包水体系(可以通过传导率测试来测定存在哪种体系)并且可以适合于在同一配制品中混合水溶性与油溶性杀虫剂。ME适合于稀释到水中，同时保持为微乳液或者形成常规的水包油乳液。

悬浮浓缩物(SC)可以包含活性成分的细分散的不溶固体颗粒的水性或非水性悬浮液。SC可以通过在合适的介质(可任选地具有一种或多种分散剂)中球磨或珠磨该固体活性成分进行制备，以产生该化合物的细粒悬浮液。在所述组合物中可以包含一种或多种湿润剂，并且可以包含悬浮剂以降低颗粒的沉降速率。可替代地，可以将活性成分干磨并添加至含有上文所述的试剂的水中，以产生所希望的最终产品。

气溶胶配制品包含活性成分以及合适的推进剂(例如，正丁烷)。也可将活性成分溶于或分散于合适的介质(例如水或水易混合的液体，如正丙醇)中以提供用于非加压的手致动喷雾泵的组合物。活性成分可以在干燥状态下与烟火混合物混合以形成一种适用于在封闭空间内产生含有该化合物的烟雾的组合物。

胶囊悬浮液(CS)可类似于EW配制品的制备进行制备，但是具有另外的聚合反应阶段，以便获得油滴的水性分散液，其中每个油滴被一种聚合物壳囊封并且含有活性成分以及可任选地用于该活性成分的一种运载体或稀释剂。所述聚合物壳可以通过界面缩聚反应或通过凝聚程序产生。这些组合物可以提供活性成分的化合物的受控的释放。活性成分还可以在生物可降解的聚合物基质中配制以提供该化合物的缓慢、受控释放。

组合物可以包括一种或多种添加剂以改进该组合物的生物学性能(例如通过改进在表面上的湿润性、保留或分布；在处理过的表面上的防雨性；或活性成分的摄入或迁移性)。这类添加剂包括表面活性剂、基于油的喷雾添加剂，例如某些矿物油、天然植物油(如大豆以及油菜籽油)和/或改性的植物油(例如酯化的植物油)，以及这些与其他生物增强辅助剂(可帮助或改变活性成分的作用的成分)的共混物。当本文所述的活性成分用于保护有用植物的作物的方法中、提高/维持产率的方法中和/或增加/维持有用植物的作物的授粉的方法中时，优选地，所述活性成分(或含有这种活性成分的组合物)在花蕾期施用至有用植物的作物。特别是对于有用植物的作物，其中所述植物具有黄色的花朵(例如油菜，芥菜等)，优选的施用是在绿色到黄色的芽期进行。

在一些实施例中，该可接受的农用运载体是表达本发明的干扰RNA的转基因生物体。在一些实施例中，该转基因生物体可以是一种表达本发明的干扰RNA的转基因植物，当被靶鞘翅目和/或半翅目植物有害生物摄食时导致该靶鞘翅目和/或半翅目植物有害生物停止摄食、生长、或繁殖，或导致该靶鞘翅目和/或半翅目植物有害生物的死亡。在一些实施例中，植物有害生物选自由以下组成的组：米象(So；稻象)、玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Du；南方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(Db；北方玉米根虫)、辣根菜跳甲(Pa；辣根跳甲)、芫菁淡足跳甲(Pn；芜菁跳甲)、萝卜菜跳甲(Pu；十字花科植物跳甲)、黄曲条跳甲(Ps；条纹跳甲)、芜菁黑跳甲(Pt；跳甲)、油菜兰跳甲(Pc；甘蓝茎跳甲)、油菜露尾甲(Ma；花粉甲虫)、白菜籽龟象(Ca；甘蓝心皮象鼻虫)、马铃薯甲虫(Ld；科罗拉多马铃薯甲虫)、和/或半翅目昆虫有害生物选自由以下组成的组：稻绿蝽(Nv；绿色椿象)、英雄美洲蝽(Eh；棕色椿象)、和盖德拟壁蝽(Pg；红带椿象)。

在其他实施例中，该转基因植物是一种转基因玉米植物并且该靶有害生物是一种根萤叶甲属昆虫有害生物。仍在其他实施方式中，根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：西方玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)、十一星根萤叶甲(Du；南方玉米根虫)和巴氏根萤叶甲(Db；北方玉米根虫)。

在其他实施例中，转基因生物选自但不限于由以下组成的组：表达本发明干扰RNA分子的酵母、真菌、藻类、细菌、病毒或节肢动物。在一些实施例中，该转基因生物体是一种病毒，例如一种当侵染昆虫宿主时表达本发明的干扰RNA分子的昆虫杆状病毒。这样的一种杆状病毒比野生型未转化杆状病毒针对靶昆虫可能更具剧毒。在其他实施例中，该转基因生物体是一种施用至靶有害生物出现或已知已经出现的环境的转基因细菌。在一些实施例中，使用了能够在植物组织内生活并复制的非致病的共生细菌(所谓的内生菌)，或能够定居在叶际或根际的非致病的共生细菌(所谓的附生菌)。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属、产碱杆菌属、固氮螺菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷氏菌属、链霉菌属以及黄单胞菌属。共生真菌(如木霉属和胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的干扰RNA分子的可能宿主。

在一些实施例中，本发明涵盖转基因植物或其部分，其包含本发明的干扰RNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物，其中当与对照植物(例如，不包含干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人造植物微小RNA前体分子和/或本发明的组合物的植物)相比时，该转基因植物对鞘翅目昆虫、半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫具有增强的抗性。在其他实施例中，该转基因植物或其部分是转基因玉米植物或其部分。本发明进一步涵盖本发明的转基因植物的转基因种子，其中该转基因种子包含本发明的干扰RNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物。在一些实施例中，该转基因种子是转基因玉米种子。

表达本发明的干扰RNA的转基因植物对被靶昆虫有害生物袭击具有耐受性或抗性。当该昆虫开始摄食这样一种转基因植物时，它也摄取所表达的dsRNA或siRNA。这可以妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。编码本发明的dsRNA或siRNA的核酸序列被插入到一种表达盒中，然后该表达盒被优选稳定地整合到该植物的基因组中。引入到植物基因组中的表达盒的这些核酸序列对于该植物而言是异源的，并且是天然存在的。跟据本发明所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于：玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒(pepper)、芹菜、小南瓜(squash)、大南瓜(pumpkin)、大麻、西葫芦、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李子(plum)、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属，以及木本植物，如针叶树以及落叶树。在另外的实施例中，该转基因植物是一种转基因玉米植物。

在转基因植物中该干扰RNA分子的表达是由包含在植物中发挥作用的启动子的调节序列所驱动的。启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于昆虫目标种类而变化。因此，考虑了本发明的干扰RNA在叶、柄(stalk)或茎(stem)、穗、花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、根和/或幼苗中的表达。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型昆虫有害生物的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中表达。不过，对于所选的启动子的起源没有限制；只要它们可有效驱动dsRNA或siRNA在所希望细胞中表达就足够了。

适用于本发明的启动子包括但不限于组成性地驱动核苷酸序列的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性方式驱动表达的那些启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。

在一些实施例中，可以使用组织特异性/组织优选的启动子。组织特异性或组织优选的表达模式包括但不限于绿色组织特异性或优选的、根特异性或优选的、茎特异性或优选的、以及花特异性或优选的。此外，可以使用在质体中发挥作用的启动子。在本发明的一些实施例中，可以使用诱导型启动子。在另外的方面中，本发明的核苷酸序列可以与启动子可操作地相关联，该启动子是创伤诱导型或由有害生物或病原体侵染(例如，昆虫或线虫植物有害生物)进行的诱导型。

在本发明的一些实施例中，使用“最小启动子”或“基本启动子”。最小启动子能够募集并结合RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白，以允许转录起始和延伸。在一些实施例中，最小启动子被构建成仅包含来自转录因子的结合和目的核苷酸序列的转录所必需的选定启动子的核苷酸/核苷酸序列的启动子，这一目的核苷酸序列可操作地与包括但不限于TATA盒序列的最小启动子相关联。在其他实施例中，最小启动子缺少募集并结合转录因子的cis序列，这些转录因子调节(例如，增强、阻抑、赋予组织特异性，赋予诱导性或阻抑性)转录。最小启动子通常被放置在待表达的核苷酸序列的上游(即，5’)。因此，可以选择来自与本发明一起可用的任何启动子的核苷酸/核苷酸序列用作最小启动子。

在一些实施例中，本发明的重组核酸分子可以是一种“表达盒”。如本文所使用的，“表达盒”意指包含目的核苷酸序列(例如，本发明的核苷酸序列)的重组核酸分子，其中该核苷酸序列至少与控制序列(例如，启动子)可操作地关联。因此，本发明的一些实施例提供了被设计成表达编码本发明的dsRNA或siRNA的核苷酸序列的表达盒。以这种方式，例如，可操作地与本发明的一个或多个核苷酸序列相关联的一个或多个植物启动子可以提供于表达盒中，用于玉米植物、植物部分和/或植物细胞中的表达。

包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。表达盒还可以是一种包含驱动其天然基因的天然启动子，然而已经以适用于异源表达的重组形式而获得的。表达盒的这种用途使它如此在其被引入的细胞中不是天然存在的。

表达盒还可以任选地包括在植物中发挥作用的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出目的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的核苷酸序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以是源自另一种来源(即，对于启动子、目的核苷酸序列、植物宿主、或其任何组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。

本发明的表达盒还可以包括用于选择性标记的核苷酸序列，所述选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分和/或植物细胞。如本文所使用的，“选择性标记”意指如下核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时向表达该标记的植物、植物部分和/或植物细胞赋予不同的表型，并且因此允许此类转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样的核苷酸序列可以编码选择性或筛选性标记，这取决于该标记是否赋予可以通过化学手段而被选择的性状，如通过使用选择剂(例如，抗生素、除草剂等)，或者取决于该标记是否仅是人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，如通过筛选(例如，R基因座性状)。当然，适合的选择性标记的许多实例在本领域是已知的并且可以用于本文所述的表达盒中。

选择性标记的实例包括但不局限于，编码neo或nptII的核苷酸序列，其赋予对卡那霉素、G418等的抗性(Potrykus等人,(1985)Mol.Gen.Genet[分子与普通遗传学]199:183-188)；编码bar的核苷酸序列，其赋予对草丁膦的抗性；编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)的核苷酸序列，其赋予对草甘膦的抗性(Hinchee等人,(1988),Biotech.[生物技术]6:915-922)；编码腈水解酶(如来自臭鼻克雷白氏杆菌的bxn)的核苷酸序列，其赋予对溴草腈的抗性(Stalker等人,(1988),Science[科学]242:419-423)；编码改变的乙酰乳酸合酶(ALS)的核苷酸序列，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学物的抗性(欧洲专利申请号154204)；编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(Thillet等人,(1988),J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:12500-12508)；编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序列，其赋予对茅草枯的抗性；编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，其赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378与5,994,629)；编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列，其赋予对5-甲基色氨酸的抗性；和/或编码hph的核苷酸序列，其赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。

本发明的表达盒还可以包括对其他所希望的性状进行编码的多核苷酸。此类所希望的性状可以是赋予昆虫抗性或赋予线虫抗性的其他多核苷酸，或其他农业上所希望的性状。此类多核苷酸可以与核苷酸序列的任何组合叠加，以产生出具有所希望的表型的植物、植物部分或植物细胞。叠加的组合可以通过任何方法来产生，包括但不限于，通过任何常规的方法学的杂交育种植物或通过遗传转化。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加，则编码其他所希望的性状的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，单个转基因可以包含多个表达盒，以致于多个表达盒被引入在单个基因组位置处的转化细胞的基因组中。可替代地，包含一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶。另外的核苷酸序列可以在共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的本发明的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、和/或其他组合物同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以合并在分开的盒(反式)中或可以合并在相同的盒(顺式)上。这些核苷酸序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。进一步认识到的是，核苷酸序列可以在所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见，例如，国际专利申请公开号WO 99/25821；WO 99/25854；WO 99/25840；WO 99/25855和WO 99/25853。

因此，表达盒可以包括用于农艺性状的一种或多种多肽的编码序列，这些农艺性状的主要受益者是种子公司、种植者或谷粒加工者。目的多肽可以是由目的多核苷酸序列编码的任何多肽。适合用于在植物中生产的目的多肽的非限制性实例包括产生农艺学重要性状的那些多肽，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和/或真菌抗性。参见，例如美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；和6,337,431。

适合于植物转化的载体描述于在本说明书的其他地方。对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适合的，而对于直接基因转移，任何载体都是适合的，并且仅含有目的构建体的线性DNA也许是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(Schocher等人,Biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转化这两者，转化通常(但不是必需的)用选择性标记进行，这种选择性标记可以提供针对抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或除草剂(basta)的抗性。本发明的植物转化载体还可以包含其他选择性标记基因，例如，在美国专利5,767,378和5,994,629中所披露的，包含提供转基因植物阳性选择的基因(如磷酸甘露糖异构酶(pmi))(通过引用将其并入本文)或提供对除草剂草铵膦(草丁膦)耐受性的草铵膦乙酰转移酶(pat)。然而，选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。

在其他实施例中，本发明的核酸序列被直接转化进入质体基因组中。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在McBride等人,(1994),Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及例如使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)，将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA区连同目的基因一起引入合适的靶组织中。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰原质体(plastome)的特定区域。最初，将叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变(赋予对壮观霉素和/或链霉素抗性)用作用于转化的选择性标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,和Maliga,P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87,8526-8530；Staub,J.M.,和Maliga,P.(1992)Plant Cell[植物细胞]4,39-45)。这以大约每100次靶叶轰击大约1个的频率产生稳定的同质转化株。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(Staub,J.M.和Maliga,P.(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12,601-606)。大幅度提高转化效率是通过用显性的选择性标记(对大观霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷转移酶进行编码的细菌aadA基因)置换隐性的rRNA或r蛋白抗生素抗性基因而获得的(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90,913-917)。先前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)Nucl.Acids Res.[核酸研究]19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被包括在本发明的范围之内。典型地，转化之后需要大约15-20个细胞分裂循环以便达到同质状态。质体表达(其中基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个优选的实施例中，将本发明的核酸序列插入至质体靶向的载体中并且转化至所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了对于包含本发明的核酸序列的质体基因组同型的植物，并且这些植物优选地能够高度表达该核酸序列。

包含本发明的干扰RNA的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如描述于美国专利号5,849,320和5,876,739(通过引用并入本文)中。在本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子有效对抗同一靶昆虫(例如鞘翅目有害生物、半翅目有害生物或根萤叶甲属靶有害生物)的情况下，该组合(i)在一种用于进一步增强本发明的组合物对抗该靶昆虫的活性的方法中以及(ii)在一种用于通过提供对抗该靶昆虫的又另一种作用机制而防止对本发明的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，本发明提供了一种增强对鞘翅目昆虫群体、半翅目昆虫群体或根萤叶甲属昆虫群体控制的方法，该方法包括提供一种本发明的转基因植物或种子并且向该植物或该种子施用本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。此类杀昆虫剂和/或杀昆虫种子包衣的实例包括但不限于，氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。在另一个实施例中，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣选自下组，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合。包含此类杀昆虫剂和杀昆虫种子包衣的商业产品包括但不限于以下：(克百威)、(灭多虫、灭多威、纳乃得)、(胺甲萘)、(联苯菊酯)、(七氟菊酯)、(氯氰菊酯)、(氯氰菊酯)、DELTA(溴氰菊酯)、(λ-氯氟氰菊酯)、(氯菊酯)、(氯菊酯)、(联苯菊酯)、(联苯菊酯)、(七氟菊酯))、(λ氯氟氰菊酯)、(毒死蜱)、(氯氧磷)、(灭克磷)、(甲拌磷)、(甲拌磷、氟氰戊菊酯(flucythinate))、(甲拌磷)、(特丁磷)、(乐果)、异氯磷、(氟虫腈))、(噻虫嗪)、(吡虫啉)、(吡虫啉)、(噻虫胺)和(氟氯氰菊酯、嘧丙磷)。

本发明的组合物还可以与其他生物控制试剂组合，以增强鞘翅目昆虫、半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫群体的控制。因此，通过提供如下转基因植物，本发明提供了增强对鞘翅目昆虫群体、半翅目昆虫群体或根萤叶甲属昆虫群体的控制的方法，该转基因植物产生本发明的干扰RNA并且进一步包含编码第二杀昆虫剂的多核苷酸。该第二杀昆虫剂可以源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫蛋白。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白可以是许多杀昆虫蛋白中的任何一种，包括但不限于Cry1蛋白、Cry3蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry11蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry34蛋白连同Cry35蛋白、二元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、二元杀昆虫蛋白PS149B1、VIP、TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、修饰的Cry3A蛋白、或杂合蛋白或由任何前述杀昆虫蛋白制成的嵌合体。在其他实施例中，该苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白选自下组，该组由以下组成：Cry3Bb1、Cry34Ab1连同Cry35Ab1、mCry3A以及eCry3.1Ab。

在其他实施例中，该转基因植物可以产生本发明的干扰RNA和源自苏云金芽孢杆菌以外来源的第二杀昆虫剂。该第二杀昆虫剂可以是选自下组的试剂，该组包含：马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、几丁质酶、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属(如嗜线虫致病杆菌或伯氏致病杆菌)杀昆虫蛋白、光杆菌属(如发光杆菌或非共生光杆菌)杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、梭菌属(如双酶梭菌)杀昆虫蛋白、和木质素。在其他实施例中，该第二试剂可以是至少一种源自来自发光杆菌、致病杆菌、沙雷氏菌或耶尔森氏菌的杀昆虫毒素复合物(Tc)的杀昆虫蛋白。在其他实施例中，该杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌(如光杆菌属)的ADP-核糖基转移酶。在其他实施例中，该杀昆虫蛋白可以是VIP蛋白，如来自蜡样芽孢杆菌的VIP1或VIP2。在仍其他实施例中，杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌(如来自侧孢短芽孢杆菌的ISP1A和ISP2A或来自球形芽孢杆菌的BinA和BinB)的二元毒素。在仍其他实施例中，杀昆虫蛋白可以被工程化或可以是前述杀昆虫蛋白中的任一个的杂交体或嵌合体。

在另一个实施例中，该转基因植物和转基因种子是一种玉米植物或玉米种子。在另一个实施例中，该转基因玉米植物通过一种包含本发明的dsRNA的第一转基因玉米植物与一种包含选自下组的转基因事件的转基因玉米植物杂交而提供，该组由以下各项组成：MIR604、事件5307、DAS51922-7、MON863以及MON88017。

即使在该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣能有效对抗一种不同的昆虫的情况下，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将一种具有对抗鳞翅目昆虫活性的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣加入本发明的转基因植物或种子(具有对抗鞘翅目昆虫的活性)中，所处理的植物或包衣的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目有害生物两者。

在另外的实施例中，本发明涵盖来自本发明的转基因植物、种子或其部分的生物样品，其中该样品包含作为本发明的dsRNA或编码本发明的dsRNA的至少一条链的核酸。在其他实施例中，本发明涵盖一种衍生自本发明的转基因植物、种子或其部分的商品产品。在一些实施例中，该商品产品选自下组，该组由以下组成：整个或经处理的种子、豆类、谷物、籽粒、壳、粉、粗碾去壳谷类、面粉、糖、糖、淀粉、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、蜡、油、提取物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料、青贮饲料、纤维、纸或其他从植物生产的食物或产品。在其他实施例中，该生物样品或商品产品对昆虫具有毒性。在其他实施例中，该转基因植物是一种转基因玉米植物。

本发明进一步涵盖一种控制鞘翅目和/或半翅目有害生物昆虫的方法，该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与一种作为本发明的干扰RNA分子或能够产生本发明的干扰RNA分子的核酸分子接触，该干扰RNA分子用于抑制靶基因在该昆虫中的表达，从而控制该鞘翅目和/或半翅目昆虫。在一些实施例中，靶基因包含编码序列，该编码序列(i)与SEQ ID NO:1-1814中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性；(ii)包含SEQ ID NO:1-1814中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)包含编码由SEQ ID NO:1-1814中的任一个编码的氨基酸序列的核苷酸序列的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列。在一些实施例中，靶基因编码序列包含SEQ ID NO:1-1814中的任一个或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交，该组由以下组成：SEQ ID NO:1-1814，及其互补序列。在其他实施例中，本发明的干扰RNA分子与可从本文所述的有害生物昆虫靶基因转录的mRNA多核苷酸的一部分互补。

在控制鞘翅目和/或半翅目昆虫有害生物的方法的一些实施例中，本发明的干扰RNA分子包含至少一种dsRNA，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA区域，其中的一条链包含至少19个连续核苷酸的序列，该序列(i)与SEQ ID NO:3629-7256中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性；或(ii)包含SEQ ID NO:3629-7256中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)包含编码由SEQ ID NO:3629-7256中的任一个编码的氨基酸序列的核苷酸序列的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自由SEQ ID NO:3629-7256中的任一个组成的组的多核苷酸及其互补序列杂交。

在控制鞘翅目和/或半翅目有害生物昆虫的方法的一些实施例中，有害生物昆虫选自由以下组成的组：米象(So；稻象)、玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Du；南方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(Db；北方玉米根虫)、辣根菜跳甲(Pa；辣根跳甲)、芫菁淡足跳甲(Pn；芜菁跳甲)、萝卜菜跳甲(Pu；十字花科植物跳甲)、黄曲条跳甲(Ps；条纹跳甲)、芜菁黑跳甲(Pt；跳甲)、油菜兰跳甲(Pc；甘蓝茎跳甲)、油菜露尾甲(Ma；花粉甲虫)、白菜籽龟象(Ca；甘蓝心皮象鼻虫)、马铃薯甲虫(Ld；科罗拉多马铃薯甲虫)、和/或半翅目昆虫有害生物选自由以下组成的组：稻绿蝽(Nv；绿色椿象)、英雄美洲蝽(Eh；棕色椿象)、和盖德拟壁蝽(Pg；红带椿象)。

在控制鞘翅目和/或半翅目有害生物昆虫的方法的其他实施例中，该接触包括(a)种植转基因种子，该转基因种子能够产生表达该核酸分子的转基因植物，其中该昆虫摄食该转基因植物或其部分；或(b)将包含该核酸分子的组合物施用至种子或植物或其部分，其中该昆虫摄食该种子、该植物或其部分。在一些实施例中，该转基因种子和该转基因植物是玉米种子或玉米植物。在其他实施例中，该种子或植物是玉米种子或玉米植物。

本发明还涵盖一种控制根萤叶甲属昆虫的方法，该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为本发明的干扰RNA分子或能够产生本发明的干扰RNA分子的核酸分子接触，该干扰RNA分子用于抑制靶基因在根萤叶甲属昆虫中的表达，并且还使该根萤叶甲属昆虫至少与用于控制根萤叶甲属的第二杀昆虫剂接触，其中所述第二杀昆虫剂包含苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白，从而控制该根萤叶甲属昆虫。本发明还涵盖一种控制植物上的根萤叶甲属昆虫有害生物的方法，该方法包括向所述植物局部施用包含本发明的干扰RNA和至少用于控制根萤叶甲属的第二杀昆虫剂的杀有害生物剂组合物，其中所述第二杀昆虫剂不包含苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白，并且在所述根萤叶甲属昆虫的饲料中提供所述植物。本发明还涵盖一种方法，其中该第二杀昆虫剂包含马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。该第二杀昆虫剂可以是蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白。

本发明还涵盖一种减少转基因植物上的成虫鞘翅目昆虫群体或成虫根萤叶甲属昆虫群体的方法，该转基因植物表达Cry蛋白、杂种Cry蛋白、或修饰的Cry蛋白，该方法包括在该转基因植物中表达一种作为本发明的干扰RNA分子或能够产生本发明的干扰RNA分子的核酸分子，从而减少该成虫鞘翅目昆虫群体或成虫根萤叶甲属昆虫群体，该干扰RNA分子能够抑制如本文所述的靶基因在成虫昆虫中的表达。

在一些实施例中，本发明涵盖一种降低可从本文所述的靶基因转录的靶mRNA在鞘翅目昆虫、半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫中的水平的方法，该方法包括使该昆虫与包含本发明的干扰RNA分子的组合物接触，其中该干扰RNA分子降低该靶mRNA在昆虫的细胞中的水平。在一些实施例中，该方法的干扰RNA包含至少一种dsRNA，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域，其中的一条链包含至少19个连续核苷酸的序列，该序列(i)与SEQID NO:3629-7256中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性；(ii)包含SEQ ID NO:3629-7256中的任一个的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列；(iii)包含编码由SEQ ID NO:3629-7256中的任一个编码的氨基酸序列的核苷酸序列的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的片段，或其互补序列，或者(iv)可以在严格条件下与选自由SEQ ID NO:3629-7256中的任一个组成的组的多核苷酸及其互补序列杂交，其中该干扰RNA分子对该靶鞘翅目昆虫、该靶半翅目昆虫或该靶根萤叶甲属昆虫具有杀昆虫活性。在另一个实施例中，通过靶昆虫摄食该组合物来实现接触。在其他实施例中，由该靶mRNA编码的蛋白质的产生减少。在其他实施例中，该靶蛋白包含与SEQ ID NO:10885-12698中的任一个具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的氨基酸。在其他实施例中，该靶蛋白包含SEQ ID NO:10885-12698中的任一个。在其他实施例中，该干扰RNA通过表达该干扰RNA的转基因生物体与鞘翅目和/或半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫接触。在其他实施例中，该转基因生物体是转基因植物、转基因微生物、转基因细菌或转基因内寄生菌。在其他实施例中，通过将可接受的农用运载体中的干扰RNA局部地施用至昆虫摄食的植物或植物部分来使该干扰RNA与鞘翅目和/或半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫接触。在一些实施例中，减少可从本文所述的靶基因转录的靶mRNA的水平的干扰RNA对该鞘翅目和/或半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫而言是致死的。在一些实施例中，该根萤叶甲属昆虫选自下组，该组由以下组成：巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)，西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)，黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)，黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫)，黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫)，斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲)，南美叶甲(菊花甲虫)以及墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。

在一些实施例中，本发明涵盖一种赋予植物或其部分对鞘翅目和/或半翅目昆虫耐受性或根萤叶甲属昆虫耐受性的方法，该方法包括向该植物或其部分中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物，其中本发明的dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物对于该昆虫是有毒的，从而赋予该植物或其部分对该鞘翅目昆虫和/或半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫的耐受性。在其他实施例中，通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中，通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。

在其他实施例中，本发明涵盖一种减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害的方法，该方法包括向该植物的细胞中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物，其中本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物对于根萤叶甲属昆虫是有毒的，从而减少对该植物的根损害。在其他实施例中，通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中，通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。

仍在其他实施例中，本发明包括一种产生对鞘翅目昆虫和/或半翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞的方法，该方法包括向植物细胞中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而产生与对照植物细胞(例如，不包含干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人造植物微小RNA前体分子和/或本发明的组合物的植物细胞)相比，对该昆虫具有毒性的转基因植物细胞。在一些实施例中，本发明涵盖多个由这一方法产生的转基因植物细胞。在其他实施例中，使该多个转基因植物细胞在包括天然日光的条件下生长。在其他实施例中，通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中，通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。

在一些实施例中，本发明包括一种产生对鞘翅目和/或半翅目或根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物的方法，该方法包括向植物中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物，从而产生与对照植物(例如，不包含干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人造植物微小RNA前体分子和/或本发明的组合物的植物)相比，对鞘翅目或根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物。在其他实施例中，通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中，通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。

在一些实施例中，本发明涵盖一种为玉米种植者提供控制玉米作物中的鞘翅目和/或半翅目昆虫有害生物群体或根萤叶甲属昆虫有害生物群体的手段的方法，该方法包括(a)向该种植者销售或为其提供包含一种本发明的干扰RNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物的转基因玉米种子；并且(b)向该种植者做广告宣传该转基因玉米种子产生控制鞘翅目或根萤叶甲属有害生物群体的转基因玉米植物。

在一些实施例中，本发明涵盖一种鉴定靶基因的方法，该方法用作RNAi策略用于在鞘翅目和/或半翅目植物有害生物中产生RNAi用于控制植物有害生物，所述方法包括以下步骤：a)产生具有选自下组的序列的引物对，该组包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:7257-10884或其互补序列；b)扩增来自该植物有害生物的核酸样品的直系同源靶；c)鉴定直系同源靶基因的序列；d)产生干扰RNA分子，其中该RNA包含至少一种dsRNA，其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域，其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列，该序列与鞘翅目靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的，由此获得该干扰RNA分子；以及e)确定该干扰RNA分子是否对该植物有害生物具有杀昆虫活性。如果该干扰RNA对鞘翅目和/或半翅目有害生物具有杀昆虫活性，则已鉴定出用于控制植物有害生物的靶基因。在一些实施例中，该植物有害生物是鞘翅目和/或半翅目植物有害生物。

实例

通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是出于说明性目的而提供的，并且并不旨在进行限制，除非另外指明。

实例1.鉴定米象中潜在的RNAi致死基因。

本实施例描述了谷粒有害生物昆虫(米象(水稻象鼻虫))中RNAi诱导的致死性的RNA测序、dsRNA合成以及所有蛋白质编码基因的测试。

1.1.米象的RNA测序和转录组生成。

总RNA提取自几个米象成虫，其通过COI条形码进行了物种确证。基本上根据制造商的说明，通过在Illuma HiSeq X(依诺米那公司(Illumina,Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州)上进行双端测序，生成了全身成虫米象转录组。使用一组三个转录组组装器(Trinity，Velvet/OASES和SOAPdenovo-Trans)将得到的原始读段(即核酸序列的短片段)从头组装，以最大化转录组的多样性和完整性。使用信度基因线(Evidential Gene pipeline)(印第安纳大学基因组信息实验室(Genome Informatics Lab,Indiana University))减少了组装中的冗余，该线包括对所得转录本进行编码序列预测的步骤。通过该分析，鉴定出13,509个编码序列，其中9,650个(71％)被作图到果蝇直系同源物，并且11,286个(84％)具有至少一种形式的功能注释。

1.2.米象的所有蛋白质编码基因的dsRNA合成

在96孔文库合成平台上产生13,509个基因靶的dsRNA。使用引物设计工具Primer3(Untergasser,A.,等人Nucleic Acids Research[核酸研究]40(15):115)自动设计所有dsRNA样品，以根据每个蛋白质编码基因的编码序列合成约500-800bp的dsRNA片段。如果编码序列的大小不允许500bp片段，则设计较小的片段。每个96孔板还包含三个阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对米象的泛素蛋白的dsRNA)。

1.3.初步筛选dsRNA样品对米象的活性

在实验室生物测定中，测试上述dsRNA分子对米象的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简短地，将合成的dsRNA分子的96孔板在面粉悬浮液中稀释。将悬浮液分成7个重复的96孔板，并在设定为60℃的烘箱中干燥过夜。每个孔中添加一个昆虫，每个处理中有7个成虫。将板保持在约25℃和16/8的光照:黑暗光周期中。在侵染后的不同天记录死亡率，在第14或15天用阿博特(Abbott)自然死亡率校正计算出最终存活百分比(参见例如，Abbott,W.S.J.Am.Mosquito Control Assoc.[美国蚊虫控制协会杂志]3(2):302-303)。将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作阴性对照，并且将被设计成靶向米象的泛素蛋白的dsRNA用作阳性对照。表1中所示的结果证明，当被dsRNA靶向时，米象中的116个基因(SEQ ID NO:1-116)对米象具有杀昆虫作用。

对于表1-7，将命名靶基因以及靶ID。表1-7中的“SEQ ID NO:”指示所测试的dsRNA的有义链的RNA序列。“存活％”是对于每种昆虫生物测定法，用阿博特校正计算的最终存活百分比。

表1.dsRNA对水稻象鼻虫的活性

1.4.米象中候选RNAi靶的确认测定

将在初步筛选中具有最高死亡率的dsRNA分子重新排列在96孔板中，并在如上所述的同一米象实验室生物测定法中进行测试(具有十二个重复)。确认测定的结果也可以在表1中找到。

先前已经提出，基于昆虫中基因的本质，可以预测给定昆虫物种的某些基因赋予RNAi介导的杀昆虫效果。然而，对靶基因的经验评估表明不能预测杀昆虫效果(参见，例如，Baum等人,2007,Nature Biotechnology[自然生物技术]25:1322-1326；还参见美国专利公开号2015/0322456)。另外，已经表明已经显示出是一种昆虫有害生物的RNAi介导的昆虫控制的有用靶的基因可能是不同属和/或科的第二昆虫有害生物的RNAi介导的昆虫控制的有用靶。然而，对不同科的不同昆虫有害生物中靶基因的经验评估表明，一种昆虫有害生物中具有很高杀昆虫活性的既定靶可能不会在第二昆虫有害生物中产生明显的死亡率或生长抑制作用(Knorr等人,2018,Scientific Reports[科学报道]8:2061,DOI:10.1038/s41598-018-20416-y)。因此，只能凭经验确定dsRNA分子对昆虫有害生物靶基因的杀昆虫活性。

实例2.鉴定玉米根虫中潜在的RNAi致死基因。

本实例描述了针对西方玉米根虫(西方玉米根萤叶甲(Dv))，南方玉米根虫(十一星根萤叶甲(Du))和北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲(Db))中的靶基因(其是表1中描述的米象靶基因的直系同源物)的dsRNA分子测试。

2.1.玉米根虫的RNA测序和转录组生成。

玉米根虫转录组以与实例1中对米象所述相似的方式产生。使用BLAST，可以在不同的根虫物种的转录组中鉴定出大多数来自米象阳性的直系同源基因；Dv(SEQ ID NO:117-228)、Du(SEQ ID NO:229-340)和Db(SEQ ID NO:341-451)。

2.2.从玉米根虫的候选靶基因合成dsRNA。

使用相同的96孔文库合成平台来产生dsRNA样品，以针对玉米根虫进行测试。以相同的方式产生阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对物种特异性泛素蛋白的dsRNA)。

2.3.dsRNA样品针对玉米根虫的测试。

使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之，将修改自Marrone等人1985(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48孔板的每个孔中并允许凝固。将dsRNA分子稀释至适当浓度，这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面，最终覆盖浓度为每孔0.1μg dsRNA。向每个孔中添加一个或两个玉米根虫幼虫，以具有24至48个重复幼虫/测试dsRNA。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。处理后7天记录死亡率。表2所示结果表明，与112个靶基因(其与表1中所述的最初116个象甲属靶基因直系同源)具有互补性的112个dsRNA分子对西方玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)高度有毒。

表2.Dv dsRNA初步筛选结果

在类似的测定中，在巴氏根萤叶甲中测试了直系同源基因。将dsRNA分子稀释至适当浓度，这样使得将20μl的溶液添加至48孔板中的饲料的表面，最终覆盖浓度为每孔1μgdsRNA。向每个孔中添加一个玉米根虫幼虫，每种dsRNA测试约48个重复幼虫。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在处理后的不同天记录死亡率。表3所示结果表明，与靶基因(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对巴氏根萤叶甲(Db；北方玉米根虫)高度有毒。

表3.Db dsRNA初步筛选结果

2.4.以剂量应答曲线，dsRNA样品针对WCR的测试。

这一实例描述了测试本发明的dsRNA对西方玉米根萤叶甲(Dv；西方玉米根虫)的生物活性。

从0.1μg dsRNA/孔开始，以10倍稀释系列在实验室生物测定中测试上述dsRNA分子对WCR的毒性。如上所述，使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。将合成的dsRNA分子稀释至适当浓度，这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面，最终覆盖浓度为每孔0.1μg、0.01μg、0.001μg和0.0001μg。向每个孔中添加一个或两个WCR幼虫，以具有24至48个重复幼虫/dsRNA测试浓度。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后第1、2、3、4、6和7天记录死亡率。将被设计成靶向GFP的dsRNA用作阴性对照，并且将被设计成靶向WCR的泛素基因的dsRNA用作阳性对照。

结果证实，被设计成靶向可从Dv基因转录的mRNA的dsRNA分子对Dv具有高毒性。参见表4。在针对GFP dsRNA的对照死亡率校正后，通过曲线拟合分析计算了估计的LT₅₀(达到有害生物昆虫群体50％死亡率的时间)和LC₅₀(达到测试昆虫群体50％死亡率所需的dsRNA浓度)。第7天的死亡率％基于0.1μg dsRNA/孔。LT50基于使用0.1μg dsRNA并以天数进行测量。LC50以μg dsRNA/孔进行测量。

表4.dsRNA针对Dv的DRC结果

实例3.含有靶dsRNA的RNAi分子在玉米植物中的表达

该实例描述了将表达干扰RNA分子的构建体引入植物细胞。

载体构建

设计用于产生发夹RNA(hpRNA)的表达载体由包含启动子、有义链、充当环序列的内含子、反义链和终止子的盒组成。构建了包含表达盒的二元载体，该表达盒包含设计用于产生靶向上述靶基因的核苷酸片段的hpRNA的DNA序列。二元载体还在左边界和右边界之间包含第二盒，该第二盒被设计为表达磷酸甘露糖异构酶(PMI)(其赋予植物细胞代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629，其通过引用并入本文))作为植物转化过程中的选择性标记。载体还包含用于在细菌中选择的选择性标记。

农杆菌介导的转化

使用本领域的普通技术人员已知的标准分子生物学技术将含有发夹盒的每个生成的质粒转化进根癌农杆菌中。将以上描述的载体转化进玉蜀黍中。基本上如在Negrotto等人,2000(Plant Cell Reports[植物细胞通讯]19:798-803)中所说明进行未成熟玉蜀黍胚的农杆菌转化。对于这个实例，所有的培养基组分基本上如在以上Negrotto等人所说明。然而，本领域内已知的各种培养基组分可以被代替。转化、选择、和再生之后，测试植物的pmi基因和发夹dsRNA干扰RNA分子的存在。将来自PCR测定的阳性植物转移至温室中，并针对至少玉米根萤叶甲(Dv，西方玉米根虫)的抗性进行了测试。

转基因玉蜀黍Dv杀昆虫测定

使包含上述转基因二元载体的转基因玉蜀黍植物的F1子代萌发并使其生长。使用PMI ELISA试纸条检测(strip test，Romer Labs PMI(#7000052))鉴定转基因阳性的植物和无效的非转基因的分离的姊妹植物。每个植物在基部用10只新生的西方玉米根虫进行侵染。侵染之后7天，评估根虫的存活率和大小。另外，检测来自每个植物的玉米根的摄食损害。对于包含二元载体的转基因的转基因玉蜀黍植物的每个F1子代，将该实验重复至少八次。

生物测定的结果包括在侵染后7天回收的Dv幼虫的数量。回收的根虫按大小(Dv大小)分级，分为中等(m)、中等/大(mb)、大(b)或非常大(vb)。还分析了玉米植物根部的摄食损害。“轻微的”根损害指示根部看起来强壮而健康。“明显的”根损害指示与对照相比，根部情况稍微差一些。“显著的”根损害指示较小的根受损或缺失。“严重的”根损害指示只有最大的根仍然与植物附接。

预期结果将证实与非转基因的阴性对照姊妹植物相比，表达靶向Dv基因的dsRNA的转基因玉米植物具有更少的根损害。因此如与非转基因对照植物相比，预期包含本发明的干扰RNA分子的转基因植物对昆虫有害生物具有增强的抗性。

转基因玉蜀黍CRW根测定

使表达来自上述二元载体的转基因的转基因玉蜀黍生长，并去除来自植物的支根或冠根。将根块置于2％琼脂板上并用80至100个L1 Dv幼虫侵染。在黑暗中于26℃孵育24至48小时后，将L1幼虫转移至48孔Dv饲料板中并在黑暗中于26℃孵育并每天对Dv幼虫的死亡率进行评分，直到侵染后7天。该实验在三种不同的转基因玉蜀黍事件和非转基因对照玉蜀黍植物上进行。计算死亡率百分比。

预期该测试的结果将证实表达靶向一种或多种Dv基因的dsRNA的转基因玉米植物对Dv昆虫有害生物具有杀昆虫作用。预期这将进一步显示如与非转基因对照植物相比，包含本发明的干扰RNA分子的转基因植物对昆虫有害生物具有增强的抗性。

实例4.用第二杀昆虫剂生物测定的干扰RNA分子。

这个实例说明了与第二杀昆虫剂组合的本发明的干扰RNA分子的毒性。

针对上面鉴定的一种或多种Dv靶基因产生双链RNA分子。另外，制备第二杀昆虫剂，例如mCry3A或eCry3.1Ab。在如上所述的实验室生物测定中，组合测试RNA和第二杀昆虫剂对抗Dv幼虫的毒性。

实例5.通过细菌表达产生靶向dsRNA分子。

该实例描述了使用细菌表达系统产生针对所鉴定的昆虫靶工程化的dsRNA分子。

将发夹盒针对如上所述的选择的昆虫靶基因进行工程化。发夹盒包含T7启动子，该T7启动子与靶的反义序列可操作地连接，该反义序列在3’末端进一步连接至能够形成环结构的核酸序列，该核酸序列在3’末端进一步连接至靶的相应的有义序列，该有义序列在3’末端可操作地连接至T7终止子序列。通过适当的限制位点，例如BamHI和NotI，将发夹盒引入细菌表达载体，例如pGCP295。然后使用标准方法通过电穿孔将载体引入大肠杆菌菌株，例如HT115(DE3)GA01，并使用卡那霉素选择来选择转化体。

按照标准方法和常规优化方法，使含有靶向dsRNA表达载体质粒的细菌在确定的培养基中生长至特定的光密度，并通过添加IPTG诱导特定时间段。诱导后，通过离心收集细菌，并收集产生的dsRNA分子。

实例6.细菌产生的dsRNA分子对Dv幼虫的活性。

该实例描述了测试当喷雾施用时本发明的鉴定的靶dsRNA的亚集针对Dv的生物学活性。如上所述，dsRNA分子是细菌产生的，用于作为喷雾施用进行测试。还产生了阴性对照GFP dsRNA分子。

使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之，将修改自Marrone等人1985(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48孔板的每个孔中并允许凝固。将细菌产生的dsRNA分子稀释至适当浓度，这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面。向每个孔中添加一个或两个Dv幼虫，以具有24至48个重复幼虫/测试dsRNA。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。处理后7天记录死亡率。

预期本发明的喷雾施用的RNAi分子对Dv具有活性。

实例7.鉴定跳甲中潜在的RNAi致死基因。

本实例描述了对针对跳甲、辣根菜跳甲(Pa)芫菁淡足跳甲(Pn)、萝卜菜跳甲(Pu)、黄曲条跳甲(Ps)、芜菁黑跳甲(Pt)和/或油菜兰跳甲(Pc)中的靶基因(其是表1中所述的米象靶基因的直系同源物)的dsRNA分子的测试。

7.1.跳甲昆虫的RNA测序和转录组生成。

跳甲转录组以与对米象所述相似的方式产生。使用BLAST，在跳甲转录组中鉴定了表1中描述的米象靶的大多数直系同源基因，包括Pa(SEQ ID NO:452-564)、Pn(SEQ ID NO:565-679)、Pu(SEQ ID NO:680-789)、Ps(SEQ ID NO:790-905)、Pt(SEQ ID NO:906-1020)和Pc(SEQ ID NO:1021-1133)。

7.2.跳甲中的候选靶基因的dsRNA合成。

使用相同的96孔文库合成平台来产生dsRNA样品，以针对跳甲进行测试。以相同的方式产生阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对物种特异性泛素蛋白的dsRNA)。

7.3.dsRNA样品针对跳甲的测试。

在实验室生物测定中，测试上述dsRNA分子对不同跳甲的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简而言之，将合成的dsRNA分子在蔗糖溶液中稀释至合适的浓度。将含有dsRNA的溶液分配到96孔板的三个孔中，最终剂量为每孔5％蔗糖中的1μg/μldsRNA。然后将板密封，并通过密封在每个孔上形成六个针孔。将每孔八只成虫添加到6孔板中，该板通过使用胶带固定在倒转的样品板上，使昆虫以小滴为食。在第3天，将dsRNA溶液替换为15％蔗糖溶液，以使昆虫保持直到测定结束。将每个测定保持在约25℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后的不同天记录死亡率，并在第10至17天用阿博特矫正计算最终存活百分比。将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作阴性对照。将针对特定泛素蛋白设计的dsRNA用作阳性对照。

结果证实，与一个或多个跳甲物种(Pa、Pn、Pu、Ps、Pt和Pc)中的靶基因(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对该一个或多个跳甲物种具有毒性。参见表5A和5B。

表5A.dsRNA对Pa跳甲的活性

表5B.dsRNA对Pu跳甲的活性

实例8.鉴定花粉甲虫油菜露尾甲中的RNAi致死基因。

本实例描述了针对油菜露尾甲(Ma，花粉甲虫)中的一个或多个靶基因(SEQ IDNO:1134-1248)的dsRNA分子的测试，这些靶基因是表1中所述的米象靶基因的直系同源物。

8.1.花粉甲虫中的候选靶基因的dsRNA合成。

使用与上述相同的96孔文库合成平台来产生dsRNA样品，以针对Ma花粉甲虫进行测试。dsRNA分子的模板是根据Ma靶的公开转录组信息产生的。以相同的方式产生阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对物种特异性泛素蛋白的dsRNA)。

8.2.dsRNA分子针对花粉甲虫的测试。

在实验室生物测定中，测试上述dsRNA分子对Ma花粉甲虫的毒性。使用与上文关于跳甲所述类似的方法，使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简而言之，将合成的dsRNA分子在蔗糖溶液中稀释至合适的浓度。将含有dsRNA的溶液分配到96孔板的三个孔中，最终剂量为每孔5％蔗糖中的1μg/μl dsRNA。然后将板密封，并通过密封在每个孔上形成六个针孔。将每孔八只成虫添加到6孔板中，该板通过使用胶带固定在倒转的样品板上，使昆虫以小滴为食。在第3天，将dsRNA溶液替换为15％蔗糖溶液，以使昆虫保持直到测定结束。将每个测定保持在约25℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后的不同天记录死亡率，并在第8或10天用阿博特矫正计算最终存活百分比。将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作阴性对照。将针对特定泛素蛋白设计的dsRNA用作阳性对照。

结果证实，与Ma花粉甲虫中的靶基因(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对该Ma花粉甲虫具有毒性。

表6.dsRNA对花粉甲虫的活性

实例9.鉴定龟象属物种中潜在的RNAi致死基因

本实例描述了针对白菜籽龟象(Ca，甘蓝心皮象鼻虫)中的靶基因的dsRNA分子的测试，这些靶基因是表1中所述的米象靶基因的直系同源物。

9.1.龟象属物种的RNA测序和转录组生成

龟象属转录组以与对米象所述相似的方式产生。使用BLAST，在龟象属转录组中鉴定了表1中描述的米象靶的大多数直系同源基因，在本文中以SEQ ID NO:1249-1360表示。

9.2.白菜籽龟象中的候选靶基因的dsRNA合成。

使用与上述相同的96孔文库合成平台来产生dsRNA样品，以针对白菜籽龟象进行测试。以相同的方式产生阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对物种特异性泛素蛋白的dsRNA)。

9.3.dsRNA样品针对白菜籽龟象的测试。

在实验室生物测定中，测试上述dsRNA分子对白菜籽龟象(Ca，甘蓝心皮象鼻虫)的毒性。使用与上文关于跳甲所述类似的方法，使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简而言之，将合成的dsRNA分子在蔗糖溶液中稀释至合适的浓度。将含有dsRNA的溶液分配到96孔板的三个孔中，最终剂量为每孔5％蔗糖中的1μg/μl dsRNA。然后将板密封，并通过密封在每个孔上形成六个针孔。将每孔八只成虫添加到6孔板中，该板通过使用胶带固定在倒转的样品板上，使昆虫以小滴为食。在第3天，将dsRNA溶液替换为15％蔗糖溶液，以使昆虫保持直到测定结束。将每个测定保持在约25℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后的不同天记录死亡率，并在第8或10天用阿博特矫正计算最终存活百分比。将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作阴性对照。将针对特定泛素蛋白设计的dsRNA用作阳性对照。

预期与Ca甲虫中的一个或多个靶基因(例如，包含SEQ ID NO:4877-4988中的任一个)(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对Ca甲虫具有毒性。

实例10.在喷雾施用测定中dsRNA分子针对卡诺拉油菜有害生物的活性。

该实例描述了测试当喷雾施用时本发明的鉴定的靶dsRNA的亚集针对油菜的昆虫有害生物的生物学活性。如上所述，dsRNA分子是细菌产生的，用于作为对植物喷雾施用进行测试。还产生了阴性对照GFP dsRNA分子。

用细菌产生的溶解在蔗糖溶液中的dsRNA(每3个植物200μg)对三株2-3周龄的油菜植物(甘蓝型油菜)进行喷雾。喷雾后，将15只昆虫放到植物上，并将受侵染的植物保持在用网封闭的容器中。初次喷洒后三天，用喷雾相同细菌裂解液蔗糖溶液的第二植物代替该植物。初次喷洒后六天，将昆虫转移到仅含有蔗糖溶液(15％蔗糖)的培养皿中。

实例11.含有靶dsRNA的RNAi分子在卡诺拉植物中的表达

该实例描述了将表达干扰RNA分子的构建体引入卡诺拉油菜植物细胞。

11.1.载体构建

设计用于产生发夹RNA(hpRNA)的表达载体由包含启动子、有义链、充当环序列的内含子、反义链和终止子的盒组成。hpRNA靶向如上所述的内源基因靶的至少21个核苷酸。hpRNA表达盒被克隆到二元载体中。二元载体还包含在左和右T-DNA边界之间的第二表达盒，其被设计为表达用于植物转化后的转基因细胞、组织和/或植物的选择的选择性标记。二元载体还包含用于针对二元载体细菌的存在进行选择的选择性标记。

11.2.农杆菌介导的甘蓝型油菜转化

使用本领域的普通技术人员已知的标准分子生物学技术将含有发夹盒的每个生成的质粒转化进根癌农杆菌中。将以上描述的载体转化进卡诺拉油菜中。

稳定转化的甘蓝型油菜栽培种“Westar”事件是使用经过改编的已公开花器浸蘸法方案获得的(Wang等人，2003年)。将成熟开花植物在真空中用根癌农杆菌悬浮液浸润两次。使用的菌株是C58C1RifR，其带有pGV3101 Ti质粒和包含两个植物表达盒的二元载体，其中一个是用于昆虫靶衍生的dsRNA(其作为发夹插入)，和基于nptII的植物选择性标记。

两次浸润后(隔周进行)，使植物成熟并结实种子。为了确定转化事件，将种子在300mg/l硫酸卡那霉素溶液中浸泡2天，然后播种到土壤中(Li等人，2010)。播种后一周，由于其健康的绿色膨胀子叶相比于较小的收缩的变白的未转化的幼苗，鉴定出推定的阳性幼苗。

针对nptII序列的存在，通过正/负PCR检查推定事件的转基因状态。阳性事件长到开花，此时总状花序被去除，用于昆虫生物测定。

对于昆虫摄食生物测定，在发芽时从植物中去除总状花序，然后将切开的末端立即穿过装有水的20ml玻璃小瓶的塑料盖。每个总状花序都被10-15个野生捕捉的油菜露尾甲成虫侵染，并且直到侵染后第14天对死亡率进行评分。在第7天，将总状花序换成新鲜的。

在实验室生物测定中，测试了上述事件对跳甲和/或龟象属物种的毒性。为了进行昆虫摄食生物测定，将三只2-3周龄的油菜植物(甘蓝型油菜)用10-12只昆虫侵染，并保存在用网封闭的容器中。设置后六天，将昆虫转移到野生型植物中。每两到三天记录死亡的成虫数量。

实例12.鉴定大豆椿象中潜在的RNAi致死基因。

本实例描述了对针对一种或多种大豆椿象物种，稻绿蝽(Nv)、英雄美洲蝽(Eh)和/或盖德拟壁蝽(Pg)中的靶基因(其是表1中所述的米象靶基因的直系同源物)的dsRNA分子的测试。

12.1.大豆椿象的RNA测序和转录组生成。

大豆椿象的转录组以与对米象所述相似的方式产生。使用BLAST，在三个不同的大豆椿象的转录组中鉴定了表1中描述的米象靶的大多数直系同源基因；Nv(SEQ ID NO:1361-1473)、Eh(SEQ ID NO:1474-1586)和Pg(SEQ ID NO:1587-1699)。

12.2.大豆椿象中的候选靶基因的dsRNA合成。

使用相同的96孔文库合成平台来产生dsRNA样品，以针对Nv大豆椿象进行测试。以相同的方式产生阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对物种特异性泛素蛋白的dsRNA)。Eh和Pg椿象使用相同的平台。

12.3.dsRNA样品针对大豆椿象的测试

在96孔尼龙网状滤板中进行对Nv椿象若虫的体外测定。96孔滤板的每个孔中都有第二龄期若虫，其暴露在含有15％蔗糖和1μg/μl dsRNA混合物的封口膜小袋中。将板储存在26℃、65％RH、16:8小时光照:黑暗的饲养室中的塑料盒中。暴露于dsRNA后3至10天记录存活。测试了针对上述不同靶的dsRNA分子。非靶GFP的dsRNA用作阴性对照。测定中还包括已知具有致死性的阳性对照dsRNA靶。对Eh和Pg椿象执行了相同的测试。

表7显示了以下结果：与大豆椿象Nv中的一个或多个靶基因(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对Nv椿象具有毒性。预期与大豆椿象Eh和/或Pg中的一个或多个靶基因(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对Eh椿象和/或Pg椿象具有毒性。

表7.dsRNA对南方绿椿象的活性

实例13.dsRNA分子在喷雾施用测定中的活性

该实例描述了测试当喷雾施用时本发明的鉴定的靶dsRNA的亚集针对椿象的生物学活性。上文描述了细菌裂解物的产生。

用含有细菌裂解物的约15％蔗糖溶液喷雾三个3周大的大豆植物(杰克大豆(Glycine max(L.)Jack))，所述细菌裂解物表达非靶向GFP dsRNA和来自上述表达载体的靶dsRNA分子。然后将25只第二龄期椿象若虫放在每个经喷雾的植物上。将植物置于涂有fluon PTFE的盒子中，以防止椿象逃逸，并储存在饲养室中(26℃，65％RH，16:8小时光照:黑暗)。每天拍摄照片以记录植物健康状况。暴露于经喷雾的植物后3至14天，记录了若虫的存活率。使用英雄美洲蝽、南方绿椿象或盖德拟壁蝽若虫进行这些实验。非靶GFP的dsRNA被用作阴性对照，针对已知的致死基因设计的dsRNA被用作阳性对照。记录第14天若虫的死亡率百分比。

实例14.含有靶dsRNA的RNAi分子在大豆植物中的表达

该实例描述了将表达干扰RNA分子的构建体引入大豆细胞。

14.1.载体构建

构建二元载体，其包含至少一个设计用于产生本发明的发夹RNA(hpRNA)的表达盒。表达盒包含可操作地连接至靶核酸序列的有义链的启动子、用作环序列的内含子、相应的反义链、和终止子。该二元载体还可以包含在左和右T-DNA边界之间的第二盒，其被设计为表达用于选择转化的植物细胞的选择性标记。该二元载体还可以包含用于选择转化的细菌(例如，包含该二元载体的转化的根癌农杆菌细菌细胞)的选择性标记。

14.2.大豆转化

可以将大豆植物材料适当地转化并且通过本领域的普通技术人员熟知的多种方法再生育性植物。可以通过以下各项得到育性的形态学正常的转基因大豆植物：1)从例如未成熟的子叶、下胚轴或其他合适的组织产生体细胞胚性组织；2)通过粒子轰击或农杆菌感染进行转化；以及3)再生植物。在一个实例中，如在美国专利号5,024,944中所描述的，从大豆的不成熟胚中切除子叶组织，任选地将胚轴移出，并且在包含激素的培养基中进行培养从而形成体细胞胚性植物材料。使用例如直接DNA方法、DNA包被的微弹轰击或用农杆菌感染来将该材料转化，在一种适合的选择培养基上进行培养并且任选地还在选择剂的连续存在下再生成育性转基因大豆植物。选择剂可以是抗生素(例如卡那霉素、潮霉素)，或除草剂(例如HPPD抑制剂、草胺膦或草甘膦)，或者可替代地，选择可以基于可视化标记基因(例如GUS)的表达。用于转化的靶组织包括分生组织、体细胞克隆胚性组织和花或花形成组织。大豆转化的其他实例包括物理DNA递送方法，例如粒子轰击(参见例如，Finer&McMullen,InVitro Cell Dev.Biol.[体外细胞发育生物学],1991,27P:175-182；McCabe等人.,Bio/technology[生物/技术],1998,6:923-926)、触须(Khalafalla等人.,African J.ofBiotechnology[非洲生物技术杂志],2006,5:1594-1599)、气溶胶豆类注射(美国专利号7,001,754)，或通过农杆菌介导的递送方法(Hinchee等人.,Bio/Technology[生物/技术],1988,6:915-922；美国专利号7,002,058；美国专利申请公开号20040034889和20080229447；Paz等人.,Plant Cell Report[植物细胞通讯],2006,25:206-213)。

可以使用任何可用的转化方法，用包含能够产生干扰RNA分子的表达盒的上述二元载体来产生转基因大豆植物。任选地，干扰RNA分子表达盒可以与其他序列一起存在于T-DNA中，这些其他序列提供选择/鉴定转化的组织的另外的手段，包括例如提供对卡那霉素、潮霉素、草胺膦、氟丙嘧草酯、或草甘膦具有抗性的已知基因。例如，包含PAT或EPSPS选择性标记基因的不同二元载体是本领域已知的(参见，例如，美国专利申请公开号20080229447)。可替代地，选择性标记序列可以存在于分开的多核苷酸上或使用例如一种共转化或共选择的方法。可评分的标记基因，例如GUS也可以用于鉴定转化的组织。

将T0植物从组织培养中取出到温室中，在温室中在2”方形花盆中以5-10g/gal土壤将其移植到与1％颗粒(奥林匹克园艺产品公司(OlympicHorticultural Products,Co.),梅因兰(Mainland),宾夕法尼亚州)混合的水饱和土壤中(REDI-插秧混合料(Plug and Seedling Mix),阳光种植园艺公司(Sun GroHorticulture),贝尔维尤(Bellevue),华盛顿州,或发发得萌发混合料(FafardGerminating Mix))。这些植物被湿度圆顶覆盖，并置于具有以下环境条件的Conviron室中(彭比纳(Pembina)，北达科他州)：白天24℃；夜间20℃；光照16-23小时-黑暗1-8小时的光周期；80％相对湿度。

植物在土壤中建立并出现新的生长后(约1-2周)，对植物进行采样并使用对于干扰RNA表达盒(包括例如对于启动子(例如prCMP))合适的探针通过分析来测试所需转基因的存在。将阳性植物移植到装有Fafard#3土壤的4”方形花盆中。以推荐的比率将Sierra 17-6-12缓释肥料掺入土壤中。然后将这些植物重新安置在标准温室中以与适应环境约1周。环境条件是：白天27℃；夜间21℃；14小时光照期(有补充光)；环境湿度。适应后，对这些植物取样并且详细测试插入的转基因的存在和拷贝数量。然后可以通过摄食测定来测定转基因大豆植物对椿象物种的抗性，和/或可以使其生长至成熟以产生T1种子。T1植物可以生长，并且也可以通过摄食测定来测定其对椿象物种的抗性。

实例15.鉴定马铃薯甲虫中潜在的RNAi致死基因

该实例描述了针对马铃薯甲虫(Ld；科罗拉多马铃薯甲虫)中靶基因的dsRNA分子的测试，这些靶基因是表1中所述的米象靶基因的直系同源物。

15.1.CPB中的候选靶基因的dsRNA合成。

使用相同的96孔文库合成平台来产生dsRNA样品，以针对Ld进行测试。dsRNA分子的模板是根据Ld靶基因(SEQ ID NO:1700-1814)的公开转录组信息产生的。以相同的方式产生阴性对照(针对绿色荧光蛋白-GFP的dsRNA)和阳性对照(针对物种特异性泛素蛋白的dsRNA)。

15.2.dsRNA样品针对Ld的测试。

在实验室生物测定中，测试上述dsRNA分子对Ld幼虫的毒性。使用RNA处理的人工饲料法在48孔板中进行生物测定。简而言之，将熔融的人工饲料倒入每个孔中并使其固化。将dsRNA分子稀释至适当的浓度。将20μl dsRNA溶液添加到饲料表面，最终覆盖浓度为1μg。在每个孔中放一只L2幼虫并且每个处理测试24只幼虫。将板在约25℃下以16小时:8小时光照:黑暗光周期储存。在侵染后第3、4、5、6、7和10天记录死亡率。将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作阴性对照。将针对特定泛素蛋白设计的dsRNA用作阳性对照。

预期结果将证实与马铃薯甲虫(Ld；科罗拉多马铃薯甲虫)中的一个或多个靶基因(例如，包含SEQ ID NO:5328-5442中的任一个)(其与表1中所述的象甲属靶基因直系同源)具有互补性的dsRNA对科罗拉多马铃薯甲虫具有毒性。

应当理解的是，本文所述的实例和实施例仅是出于说明性的目的，并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。

在本说明书中提到的所有公开物和专利申请显示了本发明所属领域中的技术人员的技术水平。所有这些公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被明确地并单独地指示通过引用而被并入。