具体实施方式

除非另有说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员内的认识理解或采用已有方法实现。

本发明以展青霉素含量超出相关标准的苹果汁作为原料，采用1027酵母菌进行发酵制备苹果酒，制备过程中酵母菌对展青霉素进行降解和吸附作用。含有展青霉素的苹果汁一般以腐烂苹果为原料榨取的果汁，或者受毒素污染的原料榨取的果汁，或者是腐烂苹果或受污染苹果与好果混合后榨取的果汁。所述的超标是相对于展青霉素含量符合食品安全要求来讲的，具体可以以是否超出企业、行业、国家或国际相关标准中规定的苹果或苹果汁中展青霉素含量的最低含量来衡量。业内目前公认的苹果汁中含有展青霉素的最低检出限为50μg/L。

依据本发明的制备方案，本领域技术人员采用常规的实验方法对工艺中的物质浓度、温度、pH值、时长等相关参数或技术手段进行优化选择，以得到本发明的制备符合品质要求和食品安全的苹果酒。

以下是发明人提供的实施例，以对本发明做进一步解释说明。

实施例1：

该实施例将表1所示菌株在YPD培养基中，28℃，180rpm条件下连续培养二代，进行苹果酒加工，各菌株设置三组，分别为：发酵之前，向苹果汁中加入展青霉毒素标品至浓度分别为0μg/mL、150μg/mL和200μg/mL，各组的具体加工工艺如下：

发酵：将二代酵母菌接种至苹果汁中，发酵48h为种子液；将种子液接种至23°Brix苹果汁中进行发酵，发酵条件：pH值为3.5、21℃、发酵14天；发酵过程中24h取样一次，分别测可溶性固形物、酒精度、毒素变化；

倒罐：利用无菌纱布和锥形瓶，将发酵结束后的发酵液过滤除去酵母菌体，21℃静置发酵，连续倒罐3天至溶液基本澄清；

催陈：超声波催陈，280W、20℃、20min通过超声波清洗机进行超声；

澄清：加入4％的壳聚糖悬浮液，混合均匀后，在21℃的恒温箱中静置24h，取上清液4000r/min离心15min，获得苹果酒。

表1不同酵母菌株来源

工艺过程中理化指标均参照GBT 15038-2006测定；高效液相色谱法(HPLC)用于检测展青霉毒素；通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)对果酒香气成分进行检测及鉴定。理化指标检测结果如表2所示。

表2苹果酒发酵结束后的其他理化指标

结果分析：酿酒过程对展青霉素含量的影响及毒素对酵母菌的影响如图1、2、3所示。如图1所示，当初始浓度为150μg/mL时，澄清阶段表现出最佳的去除能力，比例为34.56％，其次是主发酵阶段(31.20％)，倒罐(29.96％)和催陈阶段(4.28％)；当初始浓度为200μg/mL时，每个阶段对展青霉素含量的影响如下：澄清(34.19％)＞倒罐(33.84％)＞主发酵(29.29％)＞催陈(2.68％)，在两种不同浓度(150μg/mL和200μg/mL)的发酵苹果酒中，澄清阶段发挥出最好的吸附展青霉素的能力，而催陈阶段则表现出最差的效率；在150μg/mL的低浓度下，主发酵阶段的去除率高于倒罐阶段，而在高浓度(200μg/mL)时，主发酵阶段的去除率低于倒罐阶段，这可能与主发酵过程中酵母细胞的降解或吸附有关。

如图2所示，当添加的毒素浓度为150μg/mL时，三种菌株(1027，HYJ-1和1870)显示出良好展青霉素含量控制能力，毒素含量减少了38.2-49.1％；其次，通过H1、1845，YN6和WSL 21菌株的发酵，发酵苹果汁中展青霉素含量可以降低26.2-32.4％；1917和H2菌株对展青霉素含量降低率分别为20.8％和19.4％；当浓度增加到200μg/mL时，两种菌株(1027和1870)显示出较好的展青霉素含量控制能力，含量降低了(45.2-45.7％)，其他6个菌株显示了展青霉素减少率，为20.5-32.8％，而菌株(1845)是表现最差的菌株。

酒精含量的产生是一个积累过程，如图3(a和b)所示，五个酵母菌株(1027，WSL21，H1、1870、1917)具有较好的发酵性能和酒精生产能力，而其他不适合苹果酒的发酵；如图3(c和d)所示，菌株可溶性固形物含量在开始阶段迅速下降，然后这种趋势减慢并逐渐趋于平稳；其中，三种菌株(H2，YN6、1845)的发酵和糖转化能力较弱，可溶性固形物含量为18.0-20.7°Brix，酒精含量为1.2-2.1％，尽管菌株HYJ-1显示出高的糖消耗量，其苹果酒样品中的可溶性固形物含量低，但酒精含量仅为3.9％，这表明糖主要用于菌株生长，而不用于酒精转化；对于WSL 21、1917和1845的菌株，在具有200μg/mL展青霉素的苹果酒样品中，其可溶性固形物含量较低，酒精含量较高，这表明高浓度的展青霉素可能影响这些菌株的生长和代谢。

结合图示结果所示，可知1027菌种的展青霉素去除能力和发酵性能综合水平高于其他菌种；同时在酿酒的整个过程中，各个阶段对展青霉素的含量的均有影响，其中澄清阶段的作用最明显。

实施例2：

该实施例中种子培养液(血细胞计数板保证菌悬液浓度1×10⁸CFU/mL)结束后分成两组进行处理：

(1)1027活细胞组，即正常培养的酵母细胞；

(2)1027死细胞组：将1027酵母菌悬液置于100℃沸水中加热30min以杀死菌体获得死细胞；

对上述两组进行相同处理：分别在含20mL YPD培养基的三角瓶中，加入0.2mL浓度为1×10⁸CFU的活酵母细胞或热杀死酵母细胞，在同样条件下加入等量的无菌水作为空白对照，最后在培养液中加入4mg展青霉素标准品，调节其初始浓度为200μg/mL、28℃、180rpm摇床培养24h，从6h起每隔3h取一次样；HPLC检测样品中展青霉素含量(检测条件参照：MacDonald S,Long M,Gilbert J,Felgueiras I.Liquid chromatographic method fordetermination of patulin in clear and cloudy apple juices and apple puree:collaborative study.J AOAC Int.2000Nov-Dec；83(6):1387-94.PMID:11128142.)

如图4所示(a，b)，分别显示了处理时间对展青霉素含量的影响以及它们在过程中的总变化，通过活细胞发酵获得最高的去除率(50.2％)，并在约38h开始下降，进一步延长发酵时间发现，展青霉素的含量减少率下降；另一方面，灭活的酵母细胞只能除去苹果汁中17.3％的展青霉素；结果表明，展青霉素含量的下降是生物降解和吸附两种作用共同决定的。

实施例3：

该实施例分为三组方案：

(1)正常细胞胞内组(E-ext)和胞外组(I-ext)，在制备种子液时，不进行毒素诱导，28℃，180rpm摇床培养24h后，7000×g离心5min，分离上清液和菌体，同时用无菌生理盐水洗涤离心3次，以确保获得较为干净的细胞菌体和全部的上清液，此时获得的上清液为胞外组(I-ext)；将获得的细胞用液氮将其研磨粉碎，用乙酸乙酯提取破碎后的酵母细胞碎片，振摇5min，静置3min，重复提取3次，此时获得的混合液为正常细胞胞内组(E-ext)。

(2)展青霉素诱导胞内组(I-P-ext)：在制备种子液时，同时向其中加入毒素标品，使其浓度达到200μg/mL，其余所有的操作与正常细胞胞内组(E-ext)完全相同。

三组均为10mL，分别准备完全以后，在同样条件下加入等量的无菌水作为空白对照；再加入一定量的展青霉素标品，调节其初始浓度为200μg/mL，28℃，180rpm摇床培养24h，从6h起每隔3h取一次样，7000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤后，-20℃冰箱保存，采用HPLC测定其中展青霉素的含量。

如图5(a)所示，在36h时，三组的展青霉素去除率均达到最大，细胞内代谢产物毒素组(I-ext)和毒素诱导组(I-P-ext)分别可以降解约6.3％和11.4％的展青霉素，而细胞外提取物的降解率仅为5.2％；当时间过长时，毒素的降解率开始下降，这说明过长的时间可能导致胞内外提取物活性降低；

如图5(b)所示，I-ext和I-P-ext可分别降解约55％和86％的胰蛋白酶，而胞外提取物(E-ext)在60h降解约38％，酿酒酵母1027胞内和胞外提取物对展青霉素的降解存在显著差异。结果提示，在酵母细胞发酵过程中，可能通过胞内和胞外酶的结合来进行展青霉素的降解，胞内酶比胞外酶起更重要的作用。

结果表明：酵母菌株1027主要通过活细胞胞内酶作用生物降解展青霉毒素，并且在经过毒素诱导以后，酵母菌胞内酶的作用效果更加明显，这表明，低浓度的展青霉素浓度可以作为抗原促进酿酒酵母1027相关基因的表达上调。

实施例4：

该实施例在装有20mL苹果汁培养基的三角瓶中，加入200μL浓度为1×10⁸cells/mL的未经毒素诱导的酿酒酵母1027菌株的种子培养基，在同样条件下加入等量的无菌水作为空白对照；再加入一定量的展青霉素标准品，调节其初始浓度为200μg/mL培养7d后，取样待测。

如图6所示。为推断降解产物的可能结构，使用了LC-MS对其进行检测，在正离子模式下，展青霉素([M H]⁺，m/z 155.03)，在质谱中主要特征碎片为m/z 137.11(丢失一分子H₂O)，111.06(丢失一分子CO₂)，m/z 127.06和99.07(连续丢失一分子CO)。降解产物的主要特征片段为：在正离子模式下本身为m/z 157.0，其他主要特征碎片为m/z 139.09(丢失一分子H₂O)，113.07(丢失一分子CO₂)，还有一个碎片特征和展青霉素一样为127.06，结合相关参考文献，推测该物质为E-ascladiol。

结果表明：1027酵母菌菌株主要是通过降解作用去除展青霉素，与文献相比(Tannous,J.,Snini,S.P.,Khoury,R.E.,Canlet,C.,Pinton,P.,Lippi,Y.,Alassane-Kpembi,I.,Gauthier,T.,Khoury,A.E.,&Atoui,A.(2017).Patulin transformationproducts and last intermediates in its biosynthetic pathway,E-and Z-ascladiol,are not toxic to human cells.Archives of Toxicology,91(6),2455-2467)，没有新物质产生。

实施例5：

该实施例选用五周龄昆明小鼠80只，饲喂杆状标准日粮，自由饮水，室温维持在23℃左右，相对湿度在40％-60％之间，饲养环境保持12h光照，进行一周适应性饲养后，将小鼠分成8组，每组公母数量相当，分组情况如表2。

小鼠饲养的每天都会提供正常饮用水，未灌胃时称量小鼠初始体重，小鼠按分组情况持续灌胃(2.56mg/kg bw)四周，每隔24h给一次药，灌胃期间每日观察小鼠的外观、体态、生长及活动情况，记录中毒表现及死亡情况。实验结束时，称量体重，眼球取血，收集血清，肝脏，肾脏，肠道等进行各项指标的检测。此次安全性评价中所用的菌株为酿酒酵母1027菌株，且未经毒素诱导。

表3小鼠分组情况

发酵干预组和展青霉素中毒组的区别是：展青霉素中毒组没有加入酵母菌发酵，只是稀释以后的苹果汁；发酵干预组是加入了酵母菌。

如表4所示，随着喂养时间的增加总体上体重增加，喂药前(D1)、喂药一周(D8)体重基本上属于正常增加，但是在第14到21天之间发现，和对照组相比，低浓度毒素组(150μg/mL)的小鼠体重开始下降，从36.47g下降到35.23g；高浓度毒素组(200μg/mL)的体重也出现下降，从38.05g到35.3g，下降趋势更为显著；而酵母菌干预组在此期间，体重下降趋势缓慢，从39.99g到38.73g(150μg/mL酵母菌干预组)，37.51g到35.52g(200μg/mL酵母菌干预组)。这表明毒素还是影响了小鼠的体重，并且酵母菌发酵干预后影响作用减小，这说明降解产物的毒性小于毒素。如表5、6所示，从表中可以看出，不同剂量毒素组中，将小鼠大体解剖后观察小鼠各器官有无病变，并将脾脏、肾脏、肝脏及心脏称重，计算其脏体比值。

对比各组小鼠肝脏和肾脏生化指标发现，仅由毒素组会有以下结果：肝脏中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)均会显著上升；而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)会下降；肾脏中的尿素氮(BUN)会显著上升；经过酵母菌的生物降解后，各项指标均发生显著改变，但属于正常范围。

上述所有的生化指标均是采用南京建成生物工程研究所测试盒检测，其中各生化指标的公式如下：

组织GSH-PX酶活力＝(非酶管OD值-酶管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(20umol/l)×稀释倍数(5)/反应时间/(取样量×样本蛋白含量)

MDA含量(nmol/mgprot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10nmol/ml)/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)

SOD活力(U/ml)＝(对照OD值-测定OD值)/对照OD值/50％×反应液总体积/取样量×样本测试前的稀释倍数

尿素氮(BUN)(mg/dl)＝尿素(mmol/L)×2.8

LDH的检测依照乳酸底物法，ALT的检测依照丙氨酸底物法，AST的检测依照天门冬氨酸底物法；均通过购买武汉塞维尔生物科技有限公司试剂盒检测。综合上述结果说明，酵母菌降解毒素后，产物毒性显著下降。