二苯醚类除草剂硝基还原酶基因dnrA及其硝基还原酶和应用
阅读说明：本技术 二苯醚类除草剂硝基还原酶基因dnrA及其硝基还原酶和应用 (Diphenyl ether herbicide nitroreductase gene dnrA, nitroreductase thereof and application ) 是由 黄星 鲁璐瑶 商娜 陈奇峰 朱建春 何健 于 2021-04-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种硝基还原酶基因dnrA及其硝基还原酶和应用,该基因dnrA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,该基因dnrA编码的硝基还原酶DnrA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明克隆到一种硝基还原酶基因dnrA,该基因为一种二苯醚类除草剂硝基还原酶基因,全长为780bp,编码259个氨基酸；本发明硝基还原酶基因dnrA编码的硝基还原酶DnrA能够将二苯醚类除草剂中的硝基还原成氨基降解和转化二苯醚类除草剂,该硝基还原酶DnrA以及含有硝基还原酶基因dnrA的基因工程菌可用于污染农田和环境水体中二苯醚类除草剂残留的去除及药物合成的生物转化,具有非常重要的理论和应用价值。(The invention discloses a nitroreductase gene dnrA, nitroreductase thereof and application thereof, wherein the nucleotide sequence of the gene dnrA is SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence of nitroreductase DnrA coded by the gene dnrA is SEQ ID NO. 2. The invention clones a nitroreductase gene dnrA which is a diphenyl ether herbicide nitroreductase gene with the total length of 780bp and encodes 259 amino acids; the nitroreductase DnrA coded by the nitroreductase gene dnrA can reduce the nitro in the diphenyl ether herbicide into amino for degrading and converting the diphenyl ether herbicide, and the nitroreductase DnrA and the genetic engineering bacteria containing the nitroreductase gene dnrA can be used for removing the residue of the diphenyl ether herbicide in polluted farmlands and environmental water and bioconversion of drug synthesis, and have very important theoretical and application values.)
技术领域
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及硝基还原酶基因dnrA及其编码硝基还原酶和应用，具体涉及二苯醚类除草剂的硝基还原酶基因dnrA及其硝基还原酶和应用。
背景技术
近年来，随着农村劳动力不断向第二、三产业转移，农业生产集约化程度的不断提高，农田化学除草技术日益为广大农民所接受，农田杂草化除面积显著增加。二苯醚类除草剂是农业生产中广泛使用的一类除草剂，主要品种有乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、甲羧除草醚。二苯醚类除草剂是一类选择性除草剂，对于杂草防治效果极好，由于被大豆等作物吸收后能迅速降解，所以对大豆、油菜等油料作物安全。近年来，随着大豆、油菜等油料作物种植面积的扩大，恶性杂草问题也日趋严重，二苯醚类除草剂的使用量及使用面积均显著增加二苯醚类除草剂对生物体有一定的危害。在田间施用之后，乳氟禾草灵可能会以喷雾、灰尘漂移，雨水冲刷等多种方式在环境中转移，造成其在水体、土壤和作物中的大量残留。研究表明，乳氟禾草灵对一些非靶标生物具有很高的毒性，如对大型蚤、斜生栅藻和浮萍的半致死剂量分别为4.308mg/L(48h)、0.784μg/L(96h)和100μg/L(7d)。乙羧氟草醚会引起生物体的内分泌系统紊乱，同时伴有较强的致突变性，对皮肤和眼睛有一定的刺激性。因此，二苯醚类除草剂残留在土壤中的迁移、转化和降解等环境行为逐渐引起了人们的关注。
微生物降解是降解土壤中二苯醚类除草剂的主要方式，以其廉价、无二次污染等优点为多数学者所提倡。而现阶段多数研究集中在筛选出可以降解某一种该类化合物的菌株及其降解特性上，且研究的降解菌株大多只能降解某一种二苯醚类除草剂，能降解多个二苯醚类除草剂的菌株研究很少，且对降解这一类化合物分子机制的研究基本没有。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种硝基还原酶基因dnrA，该基因为一种二苯醚类除草剂硝基还原酶基因，该基因编码的硝基还原酶DnrA能在够在还原力NADPH存在条件下将二苯醚类除草剂结构式中的硝基还原成氨基降解和转化二苯醚类除草剂。
本发明还提供该硝基还原酶基因dnrA编码的硝基还原酶及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种硝基还原酶基因dnrA，所述基因dnrA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
本发明所述的硝基还原酶基因dnrA编码的硝基还原酶DnrA，所述硝基还原酶DnrA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
一种含有本发明所述的硝基还原酶基因dnrA的重组表达载体pET32a-dnrA。
其中，所述重组表达载体pET32a-dnrA由硝基还原酶基因dnrA插入载体pET-32a(+)的NcoI和XhoI位点之间所得。
一种含有本发明所述的硝基还原酶基因dnrA的基因工程菌。
其中，所述的基因工程菌是将权利要求3所述的重组载体pET32a-dnrA导入E.coliRosseta(DE3)获得。
本发明所述的硝基还原酶基因dnrA在降解和转化二苯醚类除草剂中的应用。
本发明所述的硝基还原酶DnrA在降解和转化二苯醚类除草剂中的应用。
进一步地，所述硝基还原酶DnrA在降解和转化土壤、水体中二苯醚类除草剂的应用。
作为优选，所述二苯醚类除草剂为乳氟禾草灵、乙羧氟草醚或者甲羧除草醚。
此外，所述硝基还原酶基因dnrA或者重组表达载体pET32a-dnrA还可以应用在构建降解二苯醚类除草剂的转基因作物中。
本发明所述的基因工程菌高效表达二苯醚类除草剂硝基还原酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的二苯醚类除草剂的降解。
本发明硝基还原酶基因dnrA是在一株二苯醚类除草剂降解菌种中克隆得到，所用降解二苯醚类除草剂的菌株为枯草芽孢杆菌Za，为申请人自行分离筛选得到，菌株保藏编号CCTCC NO:M 2014050，保藏日期2014年3月6日。本发明克隆该基因采取的方法为全基因组测序比对筛选目的基因，提供比对筛选出的原始序列，设计引物，通过PCR扩增基因，胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段。
本发明硝基还原酶基因dnrA编码的硝基还原酶DnrA能够将多种二苯醚类除草剂中的硝基还原成氨基，该硝基还原酶DnrA以及含有硝基还原酶基因dnrA的基因工程菌可用于污染农田和环境水体中二苯醚类除草剂残留的去除及药物合成的生物转化本发明获得的二苯醚类除草剂降解基因和工程菌在治理环境中的二苯醚类除草剂残留的技术研发中具有以下作用和功能，(一)用于农药厂废水和环境水体中二苯醚类除草剂的降解与去除，(二)用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此该降解基因在消除该类农药残留危害的研究中具有非常重要的理论和应用价值。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明从一种二苯醚类除草剂降解菌株Za中成功克隆到一种硝基还原酶基因dnrA，该基因为一种二苯醚类除草剂硝基还原酶基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为780bp，编码259个氨基酸，基因dnrA是首个公开的能降解二苯醚类除草剂的硝基还原酶基因。
2、本发明通过PCR技术扩增末端含NcoI和XhoI位点的完整的二苯醚类除草剂硝基还原酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-32a(+)的NcoI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌E.coli Rosseta(DE3)，进行IPTG诱导后可以高效表达。
3、本发明硝基还原酶基因dnrA编码的硝基还原酶DnrA能够在还原力NADPH存在条件下将二苯醚类除草剂结构式中的硝基还原成氨基，该硝基还原酶DnrA具有非常重要的理论和应用价值。
4、本发明对二苯醚类除草剂硝基还原酶基因基因表达的产物(即硝基还原酶)，做了酶活性测定，能高效的降解二苯醚类除草剂，对50mg/L的二苯醚类除草剂在30min内能降解约85％。
5、通过本发明的基因构建的工程菌株能高效表达二苯醚类除草剂硝基还原酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的二苯醚类除草剂的降解或转化。
附图说明
图1为硝基还原酶基因dnrA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2为pET32a-dnrA质粒PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
图3为硝基还原酶基因dnrA在E.coli Rosseta(DE3)中表达策略图；
图4为重组菌株E.coli Rosseta(DE3)/pET32a-dnrA全菌表达鉴定SDS-PAGE蛋白电泳图；
图5为DnrA蛋白Ni-IDA纯化蛋白电泳图谱；
图6为硝基还原酶DnrA降解乙羧氟草醚HPLC图；
A：a为乙羧氟草醚原药峰；B：b为乙羧氟草醚降解产物峰；
图7为硝基还原酶DnrA降解乳氟禾草灵HPLC图；
A：a为乳氟禾草灵原药峰；B：b为乳氟禾草灵降解产物峰；
图8为硝基还原酶DnrA催化降解乙羧氟草醚产物的HPLC/MS/MS图谱；
A：乙羧氟草醚的酶降解产物总离子流图谱；B：降解产物的一级质谱图；C：降解产物的二级质谱图；
图9为硝基还原酶DnrA催化降解乳氟禾草灵产物的HPLC/MS/MS图谱；
A：乳氟禾草灵的酶降解产物总离子流图谱；B：降解产物的一级质谱图；C：降解产物的二级质谱图；
图10为硝基还原酶DnrA降解二苯醚类除草剂的途径。
具体实施方式
以下结合附图和实施例作进一步说明。
实施例中使用的微生物来源如下：
NcoI、XhoI购自宝生物工程(南京)有限公司；
大肠杆菌感受态DH5α购自宝生物工程(南京)有限公司；
大肠杆菌高表达载体pET-32a(+)购自Novegen公司；
表达宿主菌E.coli Rosseta(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。
实施例1
菌株Za的培养以及二苯醚类除草剂硝基还原酶基因dnrA的克隆
菌株Za，经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏时间为2014年3月6日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014050。
1、细菌基因组总DNA的提取
LB培养基配方(1L)为：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，pH 7.2～7.5。
将菌株Za(CCTCC NO:M 2014050)在LB培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的Za的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH 8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
2、基因组草图测序及结果分析
细菌基因组测序要求样品OD值在1.8～2.0之间，浓度越高越好，将准备好的足量的菌株Za基因组总DNA，于干冰保温下寄送至深圳恒创生物科技公司测序。样品检测采用：1、琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染；2、NanoDrop检测DNA的纯度(OD260/280比值)；3.Qubit对DNA浓度进行精确定量。其中OD值在1.8～2.0之间，含量在1.5μg以上的DNA样品被用来建库。
3、基因组草图测序结果分析
根据细菌全基因组草图测定结果，结合已经报道的硝基还原酶基因，运用生物学软件OMIGA3.0与Za全基因组序列进行本地比对，在基因组预测分析结果中，找到硝基还原酶的orf，在NCBI上比较分析orf，从而筛选出目的基因dnrA。
实施例2
基因dnrA序列验证
将获得的硝基还原酶的基因dnrA定向克隆到pET-32a(+)上，并将重组载体转化进入E.coli Rosseta(DE3)表达宿主中诱导表达破碎，并纯化获得纯酶，以二苯醚类除草剂为底物，验证序列是否有功能。
1、序列的PCR扩增
设计引物扩增目的基因：
正向引物SEQ ID NO.3：catgccatggatgataaaaagtgataagga；
反向引物SEQ ID NO.4：ccgctcgagttagtttttattaaagccct。
从菌株Za总DNA基因组中扩增出二苯醚类除草剂硝基还原酶基因片段。
PCR扩增体系(50μL)：
PCR扩增程序：
98℃变性3min；98℃变性10s；58℃退火10s；72℃延伸15s；72℃再延伸10min，冷却至室温。
硝基还原酶基因dnrA的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
2、PCR产物回收
步骤1中PCR扩增片段通过胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段，以下体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h后，切胶回收获得目的基因片段。载体pET-32a(+)采用NcoI/XhoI双酶切线性化后通过胶回收获得载体片段。
酶切反应体系(50μL)如下：
载体的酶切体系(50μL)：
将上述回收纯化好的目的DNA片段和载体片段，进行酶连，按下述反应体系4℃过夜后得到重组表达载体pET32a-dnrA，采用42℃热激法进行转化，感受态菌株为E.coli DH5α，转化取10μL酶连产物转化200μL感受态细胞，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23，涂布于含50mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养箱，倒置过夜培养。挑选上述过夜培养的单菌落在含50mg/L氨苄青霉素的3mL LB试管中培养到对数期，提取质粒，含有pET32a-dnrA重组表达载体的阳性克隆子质粒PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，证明重组载体构建成功。
酶连体系(20μL)：
挑选上述过夜培养的单菌落在3mL LB试管中培养至对数期，提取质粒后送公司测序。
3、基因核苷酸序列测定
将步骤2获得的阳性克隆子委托上海英骏生物技术有限公司进行测序，测得二苯醚类除草剂硝基还原酶基因dnrA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长为780bp；根据二苯醚类除草剂硝基还原酶基因dnrA核苷酸序列所推断的259个氨基酸(去掉终止密码子)序列为SEQ ID NO.2。
SEQ ID NO.1:
atgataaaaagtgataaggaggtttttgtgatgaataacacaatcgaaaccattttgaatcatcggtcaatccggtcttttactgatcagcttttgacagctgaagaaattgatacattagtgaaaagtgcgcaggctgcgtctacatccagctatgtgcaggcatattcgattatcggggtttctgatcctgagaaaaaacgtgagctgtccgtgcttgctgggaatcagccttacgttgagaagaacggacacttttttgtattttgtgcggatttgtaccgccatcaaaaactggctgaggaaaaaggtgaacatatttctgagctgctcgagaatacagaaatgtttatggttagcttgattgatgcggcgctggcagcgcaaaatatgagcattgccgctgaatccatggggcttggcatttgctatatcggtggcattcggaatgaactggacaaggtgacagaggtgctgcaaacgcctgatcatgtgctcccgcttttcggactggcagtaggccatcctgcgaacctttctggcaaaaaaccaagattgccaaagcaggccgtttatcatgagaatacgtataatgtgaacacagacgatttccgtcatactatgaatacgtatgacaaaaccatttctgattactatagagaaagaacaaacgggcagcgggaagaaacgtggtccgatcaaatactgaactttatgaagcaaaagccgcgtacgtatttaaatgactacgtgaaagaaaagggctttaataaaaactaa
SEQ ID NO.2:
MetIleLysSerAspLysGluValPheValMetAsnAsnThrIleGluThrIleLeuAsnHisArgSerIleArgSerPheThrAspGlnLeuLeuThrAlaGluGluIleAspThrLeuValLysSerAlaGlnAlaAlaSerThrSerSerTyrValGlnAlaTyrSerIleIleGlyValSerAspProGluLysLysArgGluLeuSerValLeuAlaGlyAsnGlnProTyrValGluLysAsnGlyHisPhePheValPheCysAlaAspLeuTyrArgHisGlnLysLeuAlaGluGluLysGlyGluHisIleSerGluLeuLeuGluAsnThrGluMetPheMetValSerLeuIleAspAlaAlaLeuAlaAlaGlnAsnMetSerIleAlaAlaGluSerMetGlyLeuGlyIleCysTyrIleGlyGlyIleArgAsnGluLeuAspLysValThrGluValLeuGlnThrProAspHisValLeuProLeuPheGlyLeuAlaValGlyHisProAlaAsnLeuSerGlyLysLysProArgLeuProLysGlnAlaValTyrHisGluAsnThrTyrAsnValAsnThrAspAspPheArgHisThrMetAsnThrTyrAspLysThrIleSerAspTyrTyrArgGluArgThrAsnGlyGlnArgGluGluThrTrpSerAspGlnIleLeuAsnPheMetLysGlnLysProArgThrTyrLeuAsnAspTyrValLysGluLysGlyPheAsnLysAsn
实施例3
硝基还原酶基因dnrA在E.coli Rosseta(DE3)(pET-32a(+))中的高效表达
挑取实施例2中的阳性克隆子，提取重组质粒pET32a-dnrA转化到表达宿主菌E.coli Rosseta(DE3)(转化方法参考实施例2)中，获得重组的基因工程菌株，涂布于含有50mg/L氨苄青霉素的平板，倒置于37℃培养箱过夜培养，挑取阳性转化子(即过夜培养出的单菌落E.coli Rosseta(DE3)/pET32a-dnrA)。硝基还原酶基因dnrA在E.coli Rosseta(DE3)中的表达过程如图3所示。
挑取阳性转化子接种至新鲜的LB液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素)37℃培养约4小时，OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导2小时后，将100mL菌液离心洗菌，收集菌体，用15mL(50mM,pH 7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，将菌体继续超声破碎(AutoScience,UH-650BμL Trasonic processor,30％intensity)5min，离心，处理后的菌体蛋白样品进行13％SDS-PAGE电泳，电泳图如图4所示，表明E.coli Rosseta(DE3)/pET32a-dnrA菌株可以大量表达并产生DnrA蛋白。
DnrA蛋白纯化具体步骤：挑取阳性转化子接种至新鲜的2L LB液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素)，37℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG，15℃诱导12小时，收集细胞，并用35mL冰浴的Buffer A(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，1％Triton-100，pH 7.4)重悬，超声破碎细胞，离心取上清过Ni-IDA柱。用100mL Buffer E(50mM Tris-HClpH 8.0，2M NaCl，0.1％TritonX-100)洗涤Ni-IDA柱；50mL Buffer F(50mM Tris-HCl pH8.0，50mM NaCl，0.1％TritonX-100，10mM咪唑)洗涤Ni-IDA柱；50mL Buffer G(50mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl，0.1％TritonX-100，250mM咪唑)洗涤Ni-IDA柱，纯化得到的二苯醚类除草剂硝基还原酶DnrA，DnrA的SDS-PAGE电泳图见图5，表明处理后的菌体蛋白样品在IPTG诱导后，出现了一条大小约为42kDa的蛋白条带，而携带His和TRX标签的DnrA理论分子量为45kDa，说明纯化的目的蛋白正是DnrA。
实施例4
硝基还原酶DnrA活力测定
标准的酶促反应体系(3mL)：在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，加入50μL纯化后的DnrA酶液(实施例3中纯化所得)，添加终浓度为50mg/L的底物(乙羧氟草醚或者乳氟禾草灵)和0.2mM的NADPH，35℃酶促反应30min。然后加入3mL二氯甲烷萃取中止反应，取有机相2mL于通风橱吹干，用400μL甲醇溶解，用0.22μm有机相滤器过滤除去杂质，获得液相样品。HPLC检测酶反应后底物的含量。一个酶活力单位(U)定义为：在pH 7.0，温度30℃条件下，每分钟催化减少1μmol底物所需的酶量。DnrA对乙羧氟草醚、乳氟禾草灵的酶活分别为1.97、4.94。
实施例5
硝基还原酶DnrA对二苯醚类除草剂的降解和转化以及代谢产物的确定
标准的酶促反应体系(3mL)：在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，加入50μL纯化后的DnrA酶液(实施例3中纯化所得)，添加终浓度为50mg/L的底物(乙羧氟草醚或者乳氟禾草灵)和0.2mM的NADPH，35℃酶促反应30min。然后加入3mL二氯甲烷萃取中止反应，取有机相2mL于通风橱吹干，用400μL甲醇溶解，用0.22μm有机相滤器过滤除去杂质，获得液相样品。利用HPLC-MS/MS对DnrA还原转化不同底物的产物进行鉴定。
采用紫外和高效液相色谱测定提取液中二苯醚类除草剂的含量，液相色谱条件：流动相甲醇：水(80：20，V/V)，Zorbax C18 ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温为40℃，紫外检测器，测定波长254nm、272nm，进样量20μL，流速为1.0mL·min-1。外标法按峰面积定量。硝基还原酶DnrA对二苯醚类除草剂乙羧氟草醚、乳氟禾草灵的转化和降解HPLC图，如图6、7所示。硝基还原酶DnrA在30min对50mg/L乙羧氟草醚或者乳氟禾草灵降解率均超过85％。
采用液质联用仪(LC/MS/MS)测定降解产物，方法如下：首先吸取上述2mL有机相吹干，然后加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。液相色谱条件：流动相为乙腈，色谱柱为phenomenex Kinete C18(2.6μm，2.1mm×100mm)，进样量2μL，流速为0.3mL·min-1，程序为梯度洗脱(0.5-12min 10％甲醇，12-15min 90％甲醇，15-15.1min 90％甲醇，15.1-18min 10％甲醇)。质谱检测选用：AB Sciex高分辨串联质谱仪，Triple TOF 5600+LC/MS/MS系统，离子源为ESI，正离子检测模式，质量扫描范围(m/z)：100～550；同时选用二苯醚类除草剂原药(为99％分析纯级，原药对照中加入灭活的纯酶，其他条件与处理相同)采用上述相同的液质条件进行检测，二苯醚类除草剂原药乙羧氟草醚、乳氟禾草灵的HPLC/MS/MS检测结果如图8、9所示。
由图8、9图谱数据分析得出二苯醚类除草剂分别经硝基还原酶DnrA水解断裂硝基还原键后生成氨基二苯醚类除草剂，生化反应途径见图10。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 二苯醚类除草剂硝基还原酶基因dnrA及其硝基还原酶和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)
<400> 1
atgataaaaa gtgataagga ggtttttgtg atgaataaca caatcgaaac cattttgaat 60
catcggtcaa tccggtcttt tactgatcag cttttgacag ctgaagaaat tgatacatta 120
gtgaaaagtg cgcaggctgc gtctacatcc agctatgtgc aggcatattc gattatcggg 180
gtttctgatc ctgagaaaaa acgtgagctg tccgtgcttg ctgggaatca gccttacgtt 240
gagaagaacg gacacttttt tgtattttgt gcggatttgt accgccatca aaaactggct 300
gaggaaaaag gtgaacatat ttctgagctg ctcgagaata cagaaatgtt tatggttagc 360
ttgattgatg cggcgctggc agcgcaaaat atgagcattg ccgctgaatc catggggctt 420
ggcatttgct atatcggtgg cattcggaat gaactggaca aggtgacaga ggtgctgcaa 480
acgcctgatc atgtgctccc gcttttcgga ctggcagtag gccatcctgc gaacctttct 540
ggcaaaaaac caagattgcc aaagcaggcc gtttatcatg agaatacgta taatgtgaac 600
acagacgatt tccgtcatac tatgaatacg tatgacaaaa ccatttctga ttactataga 660
gaaagaacaa acgggcagcg ggaagaaacg tggtccgatc aaatactgaa ctttatgaag 720
caaaagccgc gtacgtattt aaatgactac gtgaaagaaa agggctttaa taaaaactaa 780
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)
<400> 2
Met Ile Lys Ser Asp Lys Glu Val Phe Val Met Asn Asn Thr Ile Glu
1 5 10 15
Thr Ile Leu Asn His Arg Ser Ile Arg Ser Phe Thr Asp Gln Leu Leu
20 25 30
Thr Ala Glu Glu Ile Asp Thr Leu Val Lys Ser Ala Gln Ala Ala Ser
35 40 45
Thr Ser Ser Tyr Val Gln Ala Tyr Ser Ile Ile Gly Val Ser Asp Pro
50 55 60
Glu Lys Lys Arg Glu Leu Ser Val Leu Ala Gly Asn Gln Pro Tyr Val
65 70 75 80
Glu Lys Asn Gly His Phe Phe Val Phe Cys Ala Asp Leu Tyr Arg His
85 90 95
Gln Lys Leu Ala Glu Glu Lys Gly Glu His Ile Ser Glu Leu Leu Glu
100 105 110
Asn Thr Glu Met Phe Met Val Ser Leu Ile Asp Ala Ala Leu Ala Ala
115 120 125
Gln Asn Met Ser Ile Ala Ala Glu Ser Met Gly Leu Gly Ile Cys Tyr
130 135 140
Ile Gly Gly Ile Arg Asn Glu Leu Asp Lys Val Thr Glu Val Leu Gln
145 150 155 160
Thr Pro Asp His Val Leu Pro Leu Phe Gly Leu Ala Val Gly His Pro
165 170 175
Ala Asn Leu Ser Gly Lys Lys Pro Arg Leu Pro Lys Gln Ala Val Tyr
180 185 190
His Glu Asn Thr Tyr Asn Val Asn Thr Asp Asp Phe Arg His Thr Met
195 200 205
Asn Thr Tyr Asp Lys Thr Ile Ser Asp Tyr Tyr Arg Glu Arg Thr Asn
210 215 220
Gly Gln Arg Glu Glu Thr Trp Ser Asp Gln Ile Leu Asn Phe Met Lys
225 230 235 240
Gln Lys Pro Arg Thr Tyr Leu Asn Asp Tyr Val Lys Glu Lys Gly Phe
245 250 255
Asn Lys Asn
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catgccatgg atgataaaaa gtgataagga 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt tagtttttat taaagccct 29
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