阅读说明：本技术 血液凝固活性的测定方法 (Method for measuring blood coagulation activity ) 是由 筱原翔 熊野穣 新井信夫 窗岩清治 藤森祐多 于 2021-03-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供能使施用Lonoctocog Alfa的患者的受试体的测定变得容易的同时抑制人为失误的血液凝固活性的测定方法。由血液凝固活性的测定方法解决了上述课题,所述方法包括：取得基于从施用(1)含SEQ ID NO:1所表示的序列的多肽、或者(2)含与SEQ ID NO:1所表示的序列具有95％以上的相同性的多肽、且具有作为血液第VIII凝血因子的活性的多肽的患者采集的血液受试体中的凝固波形的微分相关参数的工序,及取得的上述参数而取得上述血液受试体中的血液第VIII凝血因子的活性值的工序。(The present invention provides a method for measuring blood coagulation activity, which can facilitate measurement of a subject of a patient to whom Lonocicepg Alfa is administered and can suppress human error. The above object is solved by a method for measuring blood coagulation activity, comprising: a step of obtaining a parameter related to differentiation of a coagulation waveform in a blood specimen collected from a patient to whom (1) a polypeptide comprising a sequence represented by SEQ ID NO:1 or (2) a polypeptide comprising 95% or more identity to a sequence represented by SEQ ID NO:1 and having an activity as a blood coagulation factor VIII, and a step of obtaining an activity value of the blood coagulation factor VIII in the blood specimen based on the obtained parameter.)

具体实施方式

】

【1.用语的说明】

在本说明书中，取得血液第VIII凝血因子的活性值的对象是含指定的氨基酸序列的具有作为血液第VIII凝血因子的活性的多肽。在本说明书中，将血液第VIII凝血因子简称为“第VIII因子”，有时将具有作为血液第VIII凝血因子的活性的多肽简称为“多肽”。

优选地，多肽是含SEQ ID NO:1所表示的序列的多肽。含SEQ ID NO:1所表示的序列的多肽也可受二硫键、糖链结合、由硫酸化等的修饰。

例如，可在SEQ ID NO:1的选自第153半胱氨酸残基和第179半胱氨酸残基间、第248半胱氨酸残基和第321半胱氨酸残基间、第528半胱氨酸残基和第554半胱氨酸残基间、第630半胱氨酸残基和第711半胱氨酸残基间、第944半胱氨酸残基和第971半胱氨酸残基间、第1111半胱氨酸残基和第1115半胱氨酸残基间、第1131半胱氨酸残基和第1281半胱氨酸残基间、及第1286半胱氨酸残基和第1438半胱氨酸残基间的至少1个半胱氨酸残基间形成二硫键。

SEQ ID NO:1的选自第71、第239、第757、第764、第922、及第1230的至少1个天冬酰胺残基可结合有糖链。

SEQ ID NO:1的选自第741丝氨酸残基、第743丝氨酸残基、第746丝氨酸残基、第759苏氨酸残基、第760苏氨酸残基、第765苏氨酸残基、第766苏氨酸残基、第769丝氨酸残基、及第781丝氨酸残基的至少1个也可结合有糖链。

SEQ ID NO:1的选自第346、第718、第719、第723、第776、及第792的至少1个酪氨酸残基可受硫酸化。

在本说明书中，各种氨基酸的“残基”是指构成多肽的氨基酸的构成单元，从氨基酸，对于主链的氨基而除氢原子，并且/或对于主链的羧基而除-OH而成的基。

另外，多肽可含与SEQ ID NO:1所表示的序列具有一定的比例以上的相同性的多肽。一定的比例只要是是指与含SEQ ID NO:1所表示的序列的多肽具有同程度、或者其以上的作为第VIII因子的活性的比例，就不限制。例如，作为一定的比例，是指SEQ ID NO:1所表示的序列的70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者99％。优选地，一定的比例是指95％、98％、或者99％。

作为与SEQ ID NO:1所表示的序列维持同程度、或者其以上的作为第VIII因子的活性的氨基酸取代，可举例如，各氨基酸所属的类的氨基酸间的取代。例如，在类是非极性(疏水性)氨基酸时，可含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸。在类是极性中性氨基酸时，可含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。在类是碱性氨基酸时，可含精氨酸、赖氨酸、及组氨酸。在类是酸性氨基酸时，可含天冬氨酸和谷氨酸。第VIII因子的活性的测定方法如后述。上述多肽可由基因重组技术生成。

另外，构成多肽的氨基酸也可为人工氨基酸。再者，多肽也可受上述以外的修饰。作为修饰，可举聚乙二醇化修饰、磷酸化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰、荧光修饰、生物素化修饰、由糖的修饰、脂质修饰、酰基化修饰、还原的氨基化修饰、叠氮化物修饰、烯酮修饰等。

作为多肽，最优选可举记载在非专利文献1的Lonoctocog Alfa[商品名：Afstyla(商标)]。

患者只要是要求第VIII因子的施用的者，就不限制。例如，可举具有第VIII因子缺乏症的患者。作为第VIII因子缺乏症，可举例如，血友病A、弥散性血管内凝血综合征、肝功能不全等。

血液受试体是从患者采集的血液试样，只要是可对后述的血液凝固活性进行测定的试样，就不限制。作为血液试样，可例示例如，全血或血浆。血液试样优选在采血时使用肝素制剂以外的抗凝固剂采集。作为抗凝固剂，更优选使用柠檬酸盐、例如柠檬酸钠溶液采集。作为血液试样，最优选地，作为抗凝固剂，使用3.1～3.3％(重量/容量)的柠檬酸三钠溶液，从以此抗凝固剂和患者全血的容量成为约1:8.5～9.5的方式混合的全血试样分离的血浆。

【2.血液凝固活性的测定方法】

本发明的某些实施方式涉及血液凝固活性的测定方法。

测定方法可包括：取得从施用在上述1.中说明的(1)含SEQ ID NO:1所表示的序列的多肽、或者(2)含与SEQ ID NO:1所表示的序列具有95％以上的相同性的多肽、且具有作为血液第VIII凝血因子的活性的多肽的患者采集的血液受试体中的凝固波形的微分相关参数的工序，及基于取得的上述参数而取得上述血液受试体中的血液第VIII凝血因子的活性值的工序。

参照图1(A)，对于凝固波形进行说明。图1(A)中所示的凝固波形是由一般称为凝固一段法的血液凝固活性的测定法得到的凝固波形。凝固一段法是向含要对凝固时间进行测定的纤维蛋白原的血液试样(以下，称为“受试试样”)添加对于血液凝固必要的钙离子和指定的检查试剂，向反应液照射光，监测反应液的光学的经时变化，对凝固时间进行测定的方法。

图1(A)显示凝固波形的例。在图1(A)中，纵轴(Y轴)表示透射光强度，横轴(X轴)表示监测透射光强度的测定时间(秒：sec)。凝固波形可通过将监测的透射光强度的经时变化用透射光强度和测定时间的二轴标绘来生成。图1(A)中的第I点是向受试试样添加钙离子和检查试剂的时间点，也为测定开始的时间点(t_I)。测定开始时由于反应液中的纤维蛋白原不变成纤维蛋白，反应液尚未发生纤维蛋白的析出，透射光强度显示高值。其后，当凝固反应进行而纤维蛋白开始析出时，透射光强度开始减少。这是由于析出的纤维蛋白遮光。此时点是图1(A)中的第II点，成为凝固开始时间。将凝固开始的测定时间用(t_II)表示。随着反应进行而纤维蛋白的析出进行，透射光强度减少。在受试试样的纤维蛋白原的大半变成纤维蛋白时反应收敛，透射光强度的变化成为平稳态。此时点是图1(A)中的第III点，成为凝固结束时间。将凝固结束的测定时间用(t_III)表示。凝固时间(CT)可一般以CT(sec)＝[(t_III)-(t_II)]/2的测定时间表示。其中，“-”是指减去、“/”是指除以。即，可从凝固波形取得凝固开始时间、凝固结束时间、凝固时间等的凝固活性相关参数。

但是，由于因患者而也有受试试样中所含的初期的纤维蛋白原少的情况，优选如图1(B)一样使凝固波形标准化，确定凝固时间。标准化例如，可通过将作为凝固反应开始时的第II点的透射光强度和作为凝固结束时间点的第III点的透射光强度的差异的透射光强度的变化量(dH)假定为100％，使透射光强度的变化相对值化来达成。此时，凝固时间(CT)可设定为透射光强度的变化量(dH)是例如30％、40％、50％、或者60％的时间点。在优选的实施方式中，凝固时间是透射光强度的变化量(dH)成为50％的时间。

在本说明书中，在“凝固波形”中，可含不对于监测的透射光强度进行标准化而生成的凝固波形和基于对于监测的透射光强度进行上述标准化而得到的修正监测数据而生成的凝固波形(以下，称为“修正凝固波形”)。作为凝固波形，优选使用修正凝固波形。在本说明书中，将从修正凝固波形取得的凝固时间称为“修正凝固时间”。

能由凝固一段法测定的，血液凝固活性的包括性的测定方法可举活化部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time；APTT)、凝血酶原时间(PT)等。另外，能利用包括性的测定方法测定的，各种凝血因子活性也能由凝固一段法测定。能利用APTT测定活性的凝血因子是第VIII因子、第V因子、第X因子、第IX因子、第XI因子、第XII因子、前激肽释放酶、高分子激肽原、凝血酶原、纤维蛋白原等。能利用PT测定活性的凝血因子是第VII因子、第V因子、第X因子、凝血酶原、纤维蛋白原等。

本实施方式取得第VIII因子的活性值。第VIII因子的活性值可利用APTT取得。其中，在“取得”中，可含算出活性值，或者从其他接受活性值。

在对APTT进行测定时，指定的检查试剂可含氧化硅、鞣花酸、硅藻土等的活化剂；动物来源、植物来源、或者人工合成的磷脂等的，APTT试剂。APTT测定用检查试剂可使用市售的检查试剂。例如，可例示Sysmex株式会社制的ThromboCheckAPTT 系列、积水Medical株式会社的COAGPIAAPTT-N等、Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH的Datafi·APTT等。另外，根据国际标准法，钙离子可由20mM的氯化钙溶液供给。

受试试样、APTT测定用检查试剂和钙离子的混合在指定的稀释液内进行。作为稀释液，可例示如生理盐水一样与人的血浆等张但无pH调整功能的溶液、缓冲液等。作为缓冲液，可例示Owren's Veronal缓冲液、咪唑缓冲液。作为稀释液，优选Owren's Veronal缓冲液。

在上述中，显示了将纤维蛋白原的析出的检测由透射光强度的变化检测的例，但还可变为透射光强度，使用散射光量、吸光度等。

APTT的测定也可使用血液凝固测定装置测定。血液凝固测定装置可例示例如，Sysmex株式会社制的全自动血液凝固检查装置CN-6000、CN-3000、CS-2400、CS-2500、CS-5100、CS-1600、及CS-600系列；及半自动血液凝固测定装置CA-101、及CA-104。在本实施方式中，由于有取得凝固波形的微分相关参数的必要，优选使用搭载进行凝固波形的微分处理的软件的全自动血液凝固检查装置。

第VIII因子的活性值已知第VIII因子的活性值，基于从所述活性值互相不同的多个标准血浆试样制成的校准曲线而取得。根据以往的方法，基于对于从受试试样取得的凝固活性相关参数和与上述凝固活性相关参数相对应的参数制成的第VIII因子的活性值的校准曲线而取得利用APTT的第VIII因子的活性值。校准曲线从由将血液凝固试验用标准人血浆用生理盐水、或者第VIII因子缺乏血浆等经多个阶段稀释的标准血浆试样的APTT测定取得的凝固活性相关参数制成。在校准曲线的制成中使用血液凝固试验用标准人血浆时，以将血液凝固试验用标准人血浆的第VIII因子活性假定为100％而以活性值成为例如理论上选自90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、及10％的至少1个方式将血液凝固试验用标准人血浆用生理盐水、或者第VIII因子缺乏血浆稀释的试样作为第VIII因子的活性值已知的标准血浆试样使用。在标准血浆试样中，可作为第VIII因子的活性值100％的标准血浆试样含血液凝固试验用标准人血浆。另外，在标准血浆试样中，可作为第VIII因子活性值0％的标准血浆试样含第VIII因子缺乏血浆。这样，可从血液凝固试验用标准人血浆调制第VIII因子活性值互相不同的多个标准血浆试样。

血液凝固试验用标准人血浆可为从血液凝固功能无异常的多个人采集的血浆的混合血浆，也可为使用从Siemens株式会社等销售的血液凝固试验用标准人血浆。第VIII因子缺乏血浆是例如，从George King Bio-Medical，Inc.(USA)等可商购。

另外，将例如，CrossEightMC(日本血液制剂机构)、Kovaltry(商标)(Bayer药品株式会社)、Advate(武田药品工业株式会社)、Adynovate(商标)(武田药品工业株式会社)、NovoEight(商标)(Novo Nordisk Pharma株式会社)、Eloctate(商标)(Sanofi株式会社)等的血液第VIII凝血因子制剂添加到第VIII因子缺乏血浆中，也可调制标准血浆试样。血液第VIII凝血因子制剂由于已知第VIII因子的活性值，可以成为期望的活性值的方式将血液第VIII凝血因子制剂添加到第VIII因子缺乏血浆中，调制活性值互相不同的多个标准血浆试样。

在第VIII因子的活性值的取得中使用的凝固活性相关参数一般是凝固时间。但是，在本实施方式中，在第VIII因子的活性值的取得中使用凝固波形的微分相关参数。凝固波形的微分相关参数通过对于监测APTT测定中的反应液的光学的经时变化而得到的凝固波形(以下，称为“原凝固波形”)进行微分处理来得到。微分处理记载在美国专利申请第2018-0306820号公报中，将其整合到本说明书。

例如，对于原凝固波形进行一阶求导而得到的一阶求导凝固波形是凝固速度的参数。一阶求导凝固波形的峰的顶点表示最大凝固速度。在本说明书中，最大凝固速度有时表示为“min1”。另外，凝固速度的一阶求导凝固波形的值有时以绝对值表示，此时，最大凝固速度可以“|min1|”表示。

再者，通过对于原凝固波形进行二阶求导处理而得到二阶求导凝固波形。二阶求导凝固波形是凝固加速度、及凝固减速度的参数。在二阶求导凝固波形中，与一阶求导凝固波形的峰在同轴方向得到的峰的顶点表示最大凝固加速度。在本说明书中，最大凝固加速度有时表示为“min2”。另外，最大凝固加速度有时以绝对值表示，此时可以“|min2|”表示。在二阶求导凝固波形中，相对于表示加速度的轴方向而处于对极侧的轴方向的峰表示最大凝固减速度。在本说明书中，最大凝固加速度有时表示为“max2”。另外，最大凝固减速度有时以绝对值表示，此时可以“|max2|”表示。

上述的一阶求导也可对于修正原凝固波形进行。在本说明书中，从修正凝固波形生成的一阶求导凝固波形称为修正一阶求导凝固波形。另外，修正一阶求导凝固波形的峰的顶点表示修正最大凝固速度。修正最大凝固速度在本说明书中有时以“Ad|min1|”表示。

再者，通过对于修正原凝固波形进行二阶求导处理而得到修正二阶求导凝固波形。在修正二阶求导凝固波形中，与修正一阶求导凝固波形的峰在同轴方向得到的峰的顶点表示修正最大凝固加速度。在本说明书中，最大凝固加速度有时表示为“Ad|min2|”。在修正二阶求导凝固波形中，相对于表示加速度的轴方向而处于对极侧的轴方向的峰表示修正最大凝固减速度。在本说明书中，最大凝固加速度有时表示为“Ad|max2|”。

凝固波形的微分相关参数只要是反映一阶求导凝固波形、修正一阶求导凝固波形、第二次阶求导凝固波形、及修正二阶求导凝固波形的形状的参数即可。例如，在本实施方式中，使用选自最大凝固速度、最大凝固加速度、最大凝固减速度、修正最大凝固速度、修正最大凝固加速度、及修正最大凝固减速度的至少1个凝固波形的微分相关参数而制成校准曲线。另外，一阶求导凝固波形、修正一阶求导凝固波形、第二次阶求导凝固波形、及修正二阶求导凝固波形的曲线下面积(Area under curve)及曲线下区域的重心位置等也作为凝固波形的微分相关参数使用。进而，向制成的校准曲线适用与从受试试样取得的校准曲线相对应的凝固波形的微分相关参数的值，取得受试试样内的第VIII因子的活性值。

校准曲线的制成、凝固波形的微分相关参数的取得、受试试样中所含的第VIII因子的活性值的取得可由搭载在上述全自动血液凝固检查装置的软件进行。

【实施例】

接下来，显示实施例，对于本实施方式更详细地进行说明。但是，本发明不限定于实施方式解释。

【1.材料及方法】

【(1)受试试样的调制】

各受试试样基于记载在各药剂的附带文书的活性值，向先天性第VIII因子缺陷血浆(George King Bio-Medical,Inc.(USA))添加市售的第VIII因子制剂至最终活性值成0.05IU/dL、0.30IU/dL、1.00IU/dL而调制。

使用的第VIII因子制剂如下所述。CrossEightMC是血浆分级分离制剂，此外的制剂是重组体制剂。

CrossEightMC(日本血液制剂机构)

Kovaltry(商标)(Octocog Beta；Bayer药品株式会社)

Advate(Rurioctocog Alfa；武田药品工业株式会社)

Adynovate(商标)(Rurioctocog Alfa Pegol；武田药品工业株式会社)

NovoEight(商标)(Turoctocog Alfa；Novo Nordisk Pharma株式会社)

Eloctate(商标)(Efraloctocog Alfa；Sanofi株式会社)

Afstyla(商标)(Lonoctocog Alfa；CSLBehring株式会社)

【(2)测定试剂】

在测定中，使用以下的试剂。

ThromboCheckAPTT-SLA(Sysmex株式会社)

20mM氯化钙溶液(Sysmex株式会社)

第VIII凝血因子缺乏血浆(Siemens株式会社)

Owren's Veronal缓冲液(Siemens株式会社)

血液凝固试验用标准人血浆(Siemens株式会社)

【(3)测定装置和测定流程】

在测定中，使用全自动血液凝固测定装置CS-2400(Sysmex株式会社)，由默认流程测定。利用搭载在测定装置的计算机程序，通过进行以下的步骤凝固一段法，对活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)进行测定，取得受试试样的第VIII因子的活性值。

步骤1：将抽吸的受试试样用Owren's Veronal缓冲液稀释20倍，向反应比色杯分注40μL；

步骤2：向稀释的受试试样加第VIII凝血因子缺乏血浆40μL，温育，调制第1反应溶液；

步骤3：向调制的第1反应溶液加ThromboCheckAPTT-SLA 40μL，温育，调制第2反应液；

步骤4：向第2反应溶液加20mM氯化钙溶液40μL，使凝固反应开始，在指定时间用660nm的波长测定透射光，监测经时的透射光强度的变化；

步骤5：从监测数据检测凝固开始点和凝固终末点，算出凝固时间(CT)；

步骤6：将算出的凝固时间(CT)应用于对于第VIII因子的校准曲线，算出受试体的第VIII凝血因子活性。

其中，对于第VIII因子的校准曲线使用将血液凝固试验用标准人血浆用第VIII凝血因子缺乏血浆阶段性地稀释的标准血浆试样而制成。此时，将未稀释的血液凝固试验用标准人血浆的第VIII因子的活性值设为100％。标准血浆试样也与受试试样同样地测定，作为凝固时间将该凝固时间与稀释倍率对应的第VIII因子活性，制成校准曲线。

【(4)APTT凝固波形的微分相关参数的取得】

作为APTT凝固波形的微分相关参数，算出min1、min2、Ad|min1|、max2。对于受试试样及标准血浆试样进行APTT凝固波形的微分相关参数的算出。

以上述(3)步骤4中得到的监测数据作为APTT凝固波形数据。APTT凝固波形通过以X轴作为测定时间而以Y轴作为透射光强度标绘而得到监测数据。

另外，根据记载在美国专利申请第2018-0306820号公报的方法，对APTT凝固波形进行微分处理，生成APTT凝固波形的一阶求导凝固波形、及二阶求导凝固波形。从一阶求导凝固波形进一步得到速度的波形的峰值min1。min1表示最大凝固速度。从二阶求导凝固波形得到凝固加速度的峰值min2和凝固减速度的峰值的绝对值max2。min2表示最大凝固加速度。max2表示最大凝固减速度。另外，从基于进行标准化的APTT凝固波形数据而生成的修正一阶求导凝固波形进一步得到速度的波形的峰值的绝对值|min1|，作为修正绝对值Ad|min1|。从进行标准化的APTT凝固波形生成修正一阶求导凝固波形和修正二阶求导凝固波形。

再者，基于从标准血浆试样得到的APTT凝固波形的微分相关参数而制成基于各参数的第VIII因子的活性值的校准曲线。基于此校准曲线而针对每个参数算出各受试试样的第VIII因子的活性值。

【2.结果】

【(1)各制剂的第VIII因子活性的比较】

图2显示基于由APTT一段法求出的凝固时间(CT)而算出的各制剂的第VIII因子的活性值(IU/dL)。测定由各受试试样n＝3进行。图2(A)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成1.00IU/dL时的活性值。图2(B)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.30IU/dL时的活性值。图2(C)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.05IU/dL时的活性值。在任何活性中，均为仅Afstyla显示低值。

【(2)APTT凝固波形的微分相关参数间的数据比较】

图3(A)显示上述(1)的结果中凝固时间(CT)的差异最大的Advate和Afstyla的各参数值。CT的单位是秒，此外的数据表示计算值。另外，图3(B)显示两者的APTT凝固波形的一阶求导波形。图3(C)显示两者的APTT凝固波形的二阶求导波形。再者，在图4(A)中，显示两者的修正后的APTT凝固波形的一阶求导波形。在图4(B)中，显示两者的修正后的APTT凝固波形的二阶求导波形。在一阶求导波形中，Y轴以凝固速度(dT/dt)表示。其中，T是测量到最大透射光强度的时间，t是测量到最小透射光强度的时间。在二阶求导波形中，Y轴以凝固速度(dT²/dt²)表示。

如图3(A)所示，当看CT时，Afstyla的方的CT长，显示第VIII因子的活性低。但是，在对min1、Ad|min1|、及max2进行比较时，表示Advate和Afstyla的第VIII因子活性值的差异比对CT进行比较之时的Advate和Afstyla的第VIII因子活性值的差异小。

【(3)每APTT凝固波形的微分相关参数的校准曲线】

接下来，将针对每个APTT凝固波形的微分相关参数制成的校准曲线示于图5及图6。图5(A)显示min1的校准曲线，图5(B)显示min2的校准曲线。图6(A)显示Ad|min1|的校准曲线，图6(B)显示Max2的校准曲线。校准曲线的各轴以对数刻度表示。Y轴表示各参数的值，X轴表示第VIII因子的活性值。任何参数的校准曲线直线性均良好，表示可评价第VIII因子的活性值。

【(4)使用APTT凝固波形的微分相关参数的Afstyla的活性值的算出】

基于记载在附带文书的活性值，向先天性第VIII因子缺陷血浆添加Afstyla至最终活性值成5IU/dL、30IU/dL、100IU/dL而取得APTT凝固数据。基于此数据而取得各APTT凝固波形的微分相关参数值，适用于校准曲线，算出第VIII因子的活性值。结果示于图7。图7(A)显示第VIII因子的活性值，图7(B)显示添加回收率(％)。使用APTT凝固波形的微分相关参数算出的Afstyla的第VIII因子的活性值显示比从CT算出的活性值高的值，显示接近理论值的值。另外，回收率也变得良好。

【(5)使用APTT凝固波形的微分相关参数算出的第VIII因子活性】

在图2中对于显示活性的受试试样，使用APTT凝固波形的微分相关参数算出第VIII因子的活性值。

图8显示基于最大凝固速度min1而算出的各制剂的第VIII因子的活性值。图8(A)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成1.00IU/dL时的活性值。图8(B)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.30IU/dL时的活性值。图8(C)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.05IU/dL时的活性值。

图9显示基于修正最大凝固速度Ad|min1|而算出的各制剂的第VIII因子的活性值。图9(A)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成1.00IU/dL时的活性值。图9(B)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.30IU/dL时的活性值。图9(C)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.05IU/dL时的活性值。

图10显示基于最大凝固加速度min2而算出的各制剂的第VIII因子的活性值。图10(A)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成1.00IU/dL时的活性值。图10(B)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.30IU/dL时的活性值。图10(C)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.05IU/dL时的活性值。

图11显示基于最大凝固减速度max2而算出的各制剂的第VIII因子的活性值。图11(A)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成1.00IU/dL时的活性值。图11(B)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.30IU/dL时的活性值。图11(C)显示向先天性第VIII因子缺陷血浆加各制剂至成0.05IU/dL时的活性值。Afstyla显示比基于凝固速度而算出的第VIII因子的活性值高的值，与其他制剂的活性值的差异被解除。

因此表示，在Afstyla(Lonoctocog Alfa)的施用效果判定中，不使用凝固速度而使用凝固波形的微分相关参数的有用。

另外，变得没必要对于得到的活性值确定施用Afstyla(Lonoctocog Alfa)的患者的受试体，使测定变得容易的同时抑制人为失误变得可能。

序列表

<110> KEIO UNIVERSITY

TOKYO SAISEIKAI CENTRAL HOSPITAL

SYSMEX CORPORATION

<120> 血液凝固活性的测定方法

<130> 19-048JP

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组第VIII因子

<400> 1

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

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His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

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His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

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Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

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Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

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Tyr