一种评价生物滤池反冲洗效果的方法
阅读说明：本技术 一种评价生物滤池反冲洗效果的方法 (Method for evaluating backwashing effect of biological filter ) 是由 柏耀辉 林慧 周洁 王东麟 曲久辉 于 2021-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种评价生物滤池反冲洗效果的方法,涉及饮用水处理领域。该方法包括：分别采集生物滤池反冲洗前以及反冲洗后不同恢复时间的滤料样品；提取滤料样品中微生物的DNA并进行基因测序,获得基因测序数据；对基因测序数据进行处理,计算每个滤料样品中微生物的物种丰度,获得物种丰度数据集；以物种丰度数据集作为响应变量,以是否进行反冲洗处理作为解释变量,以反冲洗后的恢复时间作为协变量,建立主响应曲线PRC模型,提取反冲洗后不同恢复时间的典范系数,作为评价生物滤池反冲洗效果的指标。典范系数能对微生物群落结构的恢复程度进行定量评价,用来在微生物层面上表征反冲洗的效果,具有操作方便快捷、准确度高的优点。(The invention provides a method for evaluating the backwashing effect of a biological filter, and relates to the field of drinking water treatment. The method comprises the following steps: respectively collecting filter material samples with different recovery times before and after backwashing of the biological filter; extracting DNA of microorganisms in the filter material sample and performing gene sequencing to obtain gene sequencing data; processing the gene sequencing data, calculating the species abundance of microorganisms in each filter material sample, and obtaining a species abundance data set; and (3) establishing a main response curve PRC model by taking the species abundance data set as a response variable, taking whether backwashing is carried out or not as an explanation variable and taking the recovery time after backwashing as a covariate, and extracting model coefficients of different recovery times after backwashing as indexes for evaluating the backwashing effect of the biological filter. The model coefficient can quantitatively evaluate the recovery degree of the microbial community structure, is used for representing the backwashing effect on the microbial layer surface, and has the advantages of convenience and rapidness in operation and high accuracy.)
技术领域
本发明涉及饮用水处理
技术领域
，具体涉及一种评价生物滤池反冲洗效果的方法。背景技术
饮用水生物滤池广泛用于去除各类有机物、无机物和颗粒物，但随着生物滤池运行时间的延长，滤层中生物量和非生物颗粒量不断积累，显著增加了生物滤池的水头损失，从而导致滤床堵塞，影响生物滤池的过滤性能。此外，滤料层定植的稳定且富有活性的生物膜薄层更是维持其良好过滤性能的关键，当生物膜过厚时，营养物质和氧气向生物膜的扩散将受到限制。因此，饮用水处理厂的生物滤池需要定期进行反冲洗。一方面反冲洗水和气的冲刷可以利用空气的搅动作用加大滤层的膨胀体积，剥离滤料表面截留的污染物等非生物颗粒，另一方面通过反冲洗适当控制和维持滤层上附着生物膜的生物量，以确保土著微生物群落对污染物的吸附或生物转化能力。
已有研究表明，生物滤池中的生物膜未受到任何干扰时，可以最大程度的发挥生物降解功能，保持高效的过滤性能，因此，反冲洗后滤层生物膜微生物的群落结构发生改变，严重影响了生物滤池的出水水质和产水量。但随着停留时间的延长，滤层中土著微生物的群落结构呈现出恢复的趋势，当滤层生物膜群落结构基本恢复至反冲洗前的水平时，可以开始下个过滤周期，使得生物滤池仍具有较好的过滤性能。反冲洗对于维持生物滤池的功能至关重要，其反冲强度和频率更是对土著微生物群落造成直接干扰，因此对生物滤池反冲洗效果的评价以及对滤层生物膜恢复时间的评估显得尤为重要。
目前饮用水生物滤池性能评价大多是基于生物滤池中生物量、生物活性、有机物去除率等进行评价。例如，中国非专利文献“温度和反冲洗对饮用水生物滤池影响的研究”采用SOUR法来表征生物膜的活性，采用脂磷法测定生物量，基于反冲洗前后总生物量的损失情况以及总生物活性来评价反冲洗后的滤池性能，此外，还研究了反冲洗对有机物、氨氮和NO2 --N去除率的影响。又如，中国非专利文献“反冲洗对曝气生物滤池运行效能和微生物群落结构的影响”通过监测反冲洗周期的各个阶段滤池对主要污染物的去除情况，以及分析反冲洗对微生物群落结构、菌群密度的影响来对反冲洗效果进行评价。然而，针对微生物群落结构的变化无法采用定量的指标进行表征，不能直观地反映反冲洗的效果，生物量、生物活性、有机物去除率等指标虽然可以进行量化，但是普遍具有检测过程复杂、精度不高、误差较大的问题。因此，研究一种能够对生物滤池反冲洗效果进行量化，且操作方便快捷、准确度高的方法成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中评价生物滤池反冲洗效果的方法检测过程复杂、精度不高、误差较大的缺陷，从而提供一种基于主响应曲线PRC模型来评价生物滤池反冲洗效果的方法。
本发明提供一种评价生物滤池反冲洗效果的方法，包括如下步骤：
(1)分别采集生物滤池反冲洗前以及反冲洗后不同恢复时间的滤料样品；
(2)提取步骤(1)采集的滤料样品中微生物的DNA并进行基因测序，获得基因测序数据；
(3)对步骤(2)获得的基因测序数据进行处理，计算每个滤料样品中微生物的物种丰度，获得物种丰度数据集；
(4)以步骤(3)获得的物种丰度数据集作为响应变量，以是否进行反冲洗处理作为解释变量，以反冲洗后的恢复时间作为协变量，建立主响应曲线PRC模型，以反冲洗前滤料样品中微生物的物种丰度为参考值，提取反冲洗后不同恢复时间的典范系数，作为评价生物滤池反冲洗效果的指标。
进一步地，所述方法还包括：以反冲洗后的恢复时间为横坐标，以典范系数为纵坐标，构建loess局部加权回归拟合曲线并以该曲线评价生物滤池反冲洗效果。
进一步地，在步骤(3)中，运用Wilcox非参数检验筛选出反冲洗前后物种丰度发生显著变化且变化大于2倍的微生物，以筛选出的微生物的丰度形成所述物种丰度数据集。
进一步地，在步骤(4)中，使用R软件包vegan建立主响应曲线PRC模型。
进一步地，在步骤(2)中，对微生物DNA的16S rRNA V3-V4区段进行双末端测序。
进一步地，在步骤(2)中，使用Illumina NovaSeq 6000和/或Illumina MiSeq高通量测序仪进行测序，测序模式选择PE250、PE150、PE300中的至少一种。
进一步地，在步骤(3)中，获得物种丰度集的方法包括：
对获得的原始测序数据raw reads进行去杂、去引物、去接头、过滤低质量reads，得到高质量数据clean data；
对clean data依次进行合并双端数据、去除低质量reads、去噪、去冗余，生成扩增子序列变异ASVs；
对ASVs进行物种注释并计算每个滤料样品中微生物的物种丰度。
进一步地，使用QIIME2对clean data进行处理，生成ASVs。
进一步地，使用qiime vsearch join-pairs合并双端数据；使用q2-quality-filter q-score-joined根据质量得分phred>4去除低质量reads；使用qiime deblurdenoise-16S识别和过滤嵌合子以进行去噪。
进一步地，使用QIIME2的q2-feature-classifier运用预先训练好的Naive Bayes分类器进行物种注释。
进一步地，使用Greengenes 13_8按99％聚类操作分类单元OTUs序列中的V4区段训练所述分类器。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的评价生物滤池反冲洗效果的方法，通过对微生物DNA提取、测序和分析，得到微生物的物种丰度，建立主响应曲线(principal response curve，PRC)模型，进而提取典范系数对滤层中生物膜微生物群落结构的恢复程度进行定量评价，用来在微生物层面上表征反冲洗的效果，该方法具有操作方便快捷、准确度高的优点。本发明还通过主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)进行反冲洗前后微生物群落结构差异的研究，与本发明提供的评价方法所得结果进行对比，印证了该评价方法的可靠性。
2.本发明提供的评价生物滤池反冲洗效果的方法，以反冲洗后的恢复时间为横坐标，以典范系数为纵坐标，构建loess局部加权回归拟合曲线并以该曲线评价生物滤池反冲洗效果，通过该曲线能够将微生物群落的恢复程度直观地反映出来，更有利于确定反冲洗效果最佳的时期。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中石英砂滤池模拟反应器(a)和锰砂滤池模拟反应器(b)的结构示意图；
图2是本发明实施例1中石英砂滤池模拟反应器反冲洗前后PRC主响应曲线；
图3是本发明实施例1中石英砂滤池模拟反应器反冲洗前后PRC主响应曲线；
图4是本发明实施例2中石英砂滤池模拟反应器反冲洗前及反冲洗后0h群落结构改变的PCoA图；
图5是本发明实施例2中锰砂滤池模拟反应器反冲洗前及反冲洗后0h群落结构改变的PCoA图；
图6是本发明实施例2中石英砂滤池模拟反应器反冲洗前及反冲洗后48h群落结构改变的PCoA图；
图7是本发明实施例2中锰砂滤池模拟反应器反冲洗前及反冲洗后48h群落结构改变的PCoA图。
附图说明：
1-滤柱；2-进水管；3-出水管；4-溢流管；5-蠕动泵；6-气泵；7-石英砂滤料；8-锰砂滤料。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。
实施例1
本实施例提供一种评价生物滤池反冲洗效果的方法，步骤如下：
(1)构建砂滤池模拟反应器
如图1所示，为了模拟砂滤池的反冲洗处理，构建了石英砂滤池模拟反应器(a)和锰砂滤池模拟反应器(b)，反应器均由滤柱1、进水管2、出水管3、溢流管4、蠕动泵5和气泵6组成，其中，进水管2设置于滤柱1的顶部、出水管3设置于滤柱1的底部，溢流管4设置于靠近滤柱1顶部的侧壁上，蠕动泵5和气泵6分别与进水管2相连，在石英砂滤池模拟反应器的滤柱1中用于填充石英砂滤料7，在锰砂滤池模拟反应器的滤柱1中用于填充锰砂滤料8。通过调节蠕动泵5和气泵6向滤柱1中泵入水和气体，水经过滤柱1中填充的滤料后由滤柱1底部的出水管3流出，当滤柱1中水位过高时由溢流管4流出。
(2)滤料样品采集和反冲洗处理
采集的滤料样品分别来自于江苏刘湾净水厂的石英砂滤池和通新净水厂的锰砂滤池。
将采集的石英砂滤料样品和锰砂滤料样品分别填充到石英砂滤池模拟反应器和锰砂滤池模拟反应器的滤柱中，每种滤料样品设置3个平行实验，总共6个滤柱。实验分如下三阶段进行：
第一阶段，开始进行反冲洗，反冲洗结束后按照空床接触时间4h运行15天，待测样品的采集时间设置为反冲洗前、反冲洗后0h、6h、12h、24h、48h、72h、7d、15d，共9个采样时间；
第二阶段，在第一阶段结束后进行反冲洗，反冲洗结束后按照空床接触时间2h运行15天，待测样品的采集时间设置为反冲洗前、反冲洗后0h、6h、12h、24h、48h、72h、7d、15d，共9个采样时间；
第三阶段，在第二阶段结束后进行反冲洗，反冲洗结束后按照空床接触时间0.5h运行15天，待测样品的采集时间设置为反冲洗前、反冲洗后0h、6h、12h、24h、48h，共6个采样时间。
采集的待测样品是含有生物膜的表层滤料(厚度约1cm)。
反冲洗的条件：采用气水混合反冲洗，膨胀率约为33.3％，膨胀体积约为5cm，气冲强度为100mL/(min·m2)，水冲强度为90L/(h·m2)，反冲洗历时5min。通过控制蠕动泵和气泵对上述参数进行控制。
空床接触时间通过调节流速进行控制。
(3)DNA提取及16S rRNA测序
使用无DNA酶的强力土壤试剂盒(DNeasy Power Soil Kit,QIAGEN,Germany)提取0.5g待测样品中微生物群落的DNA。
使用Illumina NovaSeq 6000高通量测序仪对提取的微生物DNA的V3-V4区段(515F/806R引物对，前端引物序列515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，后端引物序列806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行双末端测序，测序模式选择PE250，共产出34,319,502条原始测序数据raw reads。
(4)16S rRNA测序数据处理
对raw reads依次进行去杂、去引物、去接头、过滤低质量reads，得到高质量数据clean data；
使用QIIME2的pipeline处理获得的clean data：使用qiime vsearch join-pairs合并双端数据，并通过q2-quality-filter q-score-joined根据质量得分phred>4去除低质量reads，使用qiime deblur denoise-16S识别和过滤嵌合子以进行去噪，去噪后的序列直接去冗余，生成扩增子序列变异(amplicon sequence variants，ASVs)；
使用QIIME2的q2-feature-classifier运用预先训练好的Naive Bayes分类器进行物种注释，该分类器使用Greengenes 13_8按99％聚类操作分类单元OTUs序列中的V4区段训练，其中的序列已被修剪为仅包含来自16S区域的250个碱基，该区域已测序(V4区段，515F/806R引物对)；将带注释的ASV相对丰度表导出到R(v3.4.3)中，并使用ggplot2包生成堆积柱状图以可视化各个样品中微生物在不同分类单元的相对丰度。
(5)建立主响应曲线模型
运用Wilcox非参数检验筛选出反冲洗前后相对丰度发生显著变化(p<0.05)且变化大于2倍的微生物菌属，获取它们的物种丰度形成物种丰度数据集。
运用ANOISM检验对石英砂滤料在三种空床接触时间下得到的物种丰度数据集进行显著性检验，发现组间不存在显著性差异(p>0.05)。同样地，通过检验得出锰砂滤料在三种空床接触时间下得到的物种丰度数据集也不存在显著差异。因此判断空床接触时间对微生物群落的变化不产生显著影响，故将三组数据共同用于建模。
使用R软件包vegan建立主响应曲线(principal response curve，PRC)模型，执行PRC的函数为prc()，具体运行代码“mod<-prc(response＝genus,treatment＝backwashing,time＝time)”。其中，响应变量为物种丰度数据集(response＝genus)，解释变量为是否进行反冲洗处理(treatment＝backwashing)，以反冲洗后的恢复时间作为协变量(time＝time)。
建模完成后，以反冲洗前滤料样品中微生物的物种丰度为参考值，提取反冲洗后不同恢复时间的典范系数(canonical coefficient)，执行命令如下：“coeff<-prc_summary$coefficients”。以恢复时间为横坐标，以典范系数为纵坐标，构建loess(局部加权回归)拟合曲线，即PRC曲线如图2～3所示。该典范系数可以量化处理组物种丰度响应与参考组的差异程度，其中，反冲洗前各微生物菌属的相对丰度作为参考组，反冲洗后各微生物菌属的相对丰度为处理组，典范系数越大表示组间差异越大(0值代表无差异)，该值的上升(或下降)反映了总菌属相对丰度水平的上升(或下降)。
如图2～3所示，不管是在石英砂滤池还是在锰砂滤池中，生物膜微生物群落结构都呈现了相似的响应模式，反冲洗后0h起典范系数下降，对应微生物群落相对丰度减少，随着恢复时间的延长，微生物群落相对丰度逐渐上升，呈现出群落结构恢复的趋势，到48h～72h时基本恢复至反冲洗前的群落结构模式(典范系数接近0表明组间无差异)。
实施例2
本实施例利用基于bray-cutis距离的主坐标分析(principal co-ordinatesanalysis，PCoA)进行反冲洗前后微生物群落结构差异的研究。使用ANOSIM统计检验计算反冲洗前和反冲洗后0h的物种组成差异程度并形成PCoA图(如图4和图5所示)，计算反冲洗前和反冲洗后48h的物种组成差异程度，形成PCoA图(如图6和图7所示)。
由图4～7所示，反冲洗前和反冲洗后0h的微生物群落具有明显差异，但反冲洗48h后微生物群落结构逐渐恢复至反冲洗前(在PCoA图中48h时的点与反冲洗前距离较近)，无显著差异，这表明48h后群落结构基本恢复，反冲洗效果达到最佳。
因此，实施例2通过对微生物群落结构变化的分析，得出的结论与实施例1基本相同，证明本发明提供的评价方法是可靠的，能够在微生物层面上准确评估反冲洗效果，并给出了砂滤池反冲洗后生物群落恢复程度的量化指标，有利于确定出反冲洗效果最佳的时期。因此，本发明提供的方法能被用来评价生物滤池的反冲洗效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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