具体实施方式

通式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶相同或不同且表示氢原子、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳香族杂环基、COOR⁷(式中，R⁷表示取代或非取代的烷基。)或者OR⁸(式中，R⁸表示取代或非取代的烷基)。

这里，作为烷基中的取代基，可举出卤素原子、羟基等。另外，作为芳基、芳香族杂环基中的取代基，可适当地选择碳原子数1～6的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳烷基、OR^a、NR^bR^c、S(O)qR^d(式中、q表示0、1或2)、COR^e、COOR^f、OCOR^g、CONR^hRⁱ、NR^jCOR^k、NR^lCOOR^m、NRⁿSO₂R^o、C(＝NR^p)NR^qR^r、NR^sSO₂NR^tR^u、SO₂NR^vR^w、硝基、氰基和卤素原子等。这里，R^a～R^w可以相同或不同地表示氢原子、烷基、烯基、炔基、环烷基等。

作为这些取代基的取代数，可以相同或不同，最大可以为各基团中存在的氢原子的个数，优选为1～10，更优选为1～5。

以下示出上述通式(I)中规定的各基团的详细内容。另外，各基团中存在位置异构体的基团表示全部的可能的位置异构体。

作为烷基和烷氧基的烷基部分，例如，可举出直链或支链的碳原子数1～12的烷基，具体而言，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。

作为环烷基，可举出饱和或可以存在一部分不饱和键的3～12元的环烷基，可以是单环性的环烷基，或多个该单环性的环烷基稠合的多环性的稠合环烷基，或者该单环性的环烷基与芳基或芳香族杂环基稠合的多环性的稠合环烷基。作为单环性的环烷基，例如，可举出碳原子数3～8的单环性环烷基，具体而言，可举出环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环十二烷基、1－环己烯基等，作为多环性的环烷基，例如，可举出碳原子数5～12的多环性环烷基，具体而言，可举出蒎烷基、金刚烷基、双环[3.3.1]辛基、双环[3.1.1]庚基等。

作为烯基，例如，可举出直链或支链的碳原子数2～12的烯基，具体而言，可举出乙烯基、烯丙基、1－丙烯基、异丙烯基、甲基丙烯酸基、丁烯基、1,3－丁二烯基、巴豆基、戊烯基、己烯基、庚烯基、癸烯基、十二碳烯基等。

作为炔基，例如，可举出直链或支链的碳原子数2～12的炔基，具体而言，可举出乙炔基、炔丙基、1－丙炔基、异丙炔基、2－丁炔基、戊炔基、2－戊烯－4－炔基、己炔基、庚炔基、癸炔基、十二碳炔基等。

作为芳基，例如，可以举出碳原子数6～14的芳基，具体而言，可以举出苯基、萘基、蒽基、菲基等。

作为芳香族杂环基，可以相同或不同，由含有至少1以上的杂原子如氮、氧、硫等的5元或6元芳香族杂环基构成，该杂环基可以为单环性杂环基，或者多个该单环性杂环基稠合的多环性的稠合芳香族杂环基，或者该单环性杂环基与芳基稠合的多环性的稠合芳香族杂环基，例如，可以为二环性或三环性杂环基。作为单环性的芳香族杂环基的具体例，可举出呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、唑基、异唑基、二唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基等，作为多环性的稠合芳香族杂环基，可以举出苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并唑基、苯并噻唑基、咔唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、酞嗪基、喹喔啉基、噌啉基、萘啶基、吡啶并嘧啶基、嘧啶并嘧啶基、蝶啶基、吖啶基、噻蒽基、吩噻基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基等。

作为卤素原子，可举出氟、氯、溴、碘的各原子。

式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物中，优选R¹和R²相同或不同且为取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳香族杂环基的化合物；作为芳基的具体例，可优选例示苯基或萘基等，作为芳香族杂环基，可优选例示呋喃基或噻吩基等。另外，进一步优选R¹为呋喃基且R²为取代或非取代的苯基、取代或非取代的呋喃基、或取代或非取代的噻吩基的化合物，作为取代苯基的基团的取代基，可优选例示甲基等烷基、甲氧基、二氟甲氧基等取代或非取代烷氧基、氟原子、氯原子等卤素原子、羟基、叔丁氧羰基等烷氧羰基、氨基、硝基、氰基等，作为取代呋喃基和取代噻吩基的取代基，可以优选例示甲基等烷基，氯原子等卤素原子等。

另外，进而更优选R³、R⁵和R⁶为氢原子且R⁴为OR⁸(优选为甲氧基或三氟甲氧基)的化合物。

作为这些化合物(I)的具体例，例如，优选N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(3－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、2－苯基－N－(5－苯基－1,3,4－二唑－2－基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(4－氯苯基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(4－硝基苯基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、2－苯基－N－[5－(3－吡啶基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(3－硝基苯基)－4－喹啉羧酰胺、2－(4－氰基苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(2－呋喃基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(5－氯－2－噻吩基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－6－甲氧基－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、2－(1－丁氧基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(2－氯苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(2－羟基苯基)－4－喹啉羧酰胺、2－(2－氨基苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(3－氯苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(3－甲氧基苯基)－4－喹啉羧酰胺、2－(3－氰基苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(3－叔丁氧羰基苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(4－氟苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、2－(4－氯苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(4－甲基苯基)－4－喹啉羧酰胺、2－(4－二氟甲氧基苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(4－羟基苯基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(4－甲氧基苯基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(4－硝基苯基)－4－喹啉羧酰胺、2－(4－叔丁氧羰基苯基)－N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(2,4－二甲基苯基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(3,4－二甲氧基苯基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(3,4－亚甲基二氧苯基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(1－萘基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(6－甲氧基－2－萘基)－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－(5－甲基－2－呋喃基)－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－6－三氟甲氧基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(5－硝基－2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－6－(4－羟基苯基)－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－6－(3－噻吩基)－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－6－(3－吡啶基)－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－(5－苯基－1,3,4－二唑－2－基)－2－苯基－6－三氟甲氧基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(2－氯苯基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－6－三氟甲氧基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(4－甲氧基苯基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－6－三氟甲氧基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(5－氯－2－噻吩基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺、N－[5－(4－甲氧基苯基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－4－喹啉羧酰胺和N－(5－苯基－1,3,4－二唑－2－基)－2－(2－噻吩基)－4－喹啉羧酰胺等，更优选N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－6－三氟甲氧基－4－喹啉羧酰胺。

作为式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物的药理学上允许的盐，可举出药理学上允许的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。作为药理学上允许的酸加成盐，可举出盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸等各种无机酸盐、以及作为有机酸的甲酸、乙酸、丙酸、富马酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸等羧酸类、甲磺酸、对甲苯磺酸等磺酸类、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸类。作为药理学上允许的金属盐，可举出锂、钠、钾等各碱金属盐、镁、钙等各碱土金属盐、铝、锌等各金属盐，作为药理学上允许的铵盐，可举出铵、四甲基铵等各种盐，作为药理学上允许的有机胺盐，可举出三乙胺、哌啶、吗啉、甲苯胺等各种盐，作为药理学上允许的氨基酸加成盐，可举出赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等的加成盐。

本发明的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐作为STAT3抑制剂记载于日本专利第5650529号公报(上述专利文献1)中，可以利用该公报中记载的方法来制造。已知该喹啉羧酰胺衍生物或其盐抑制STAT3的二聚体形成而起到抗肿瘤效果。

本发明的癌症分子靶向药物是指出于以下目的而开发的药剂，所述目的在于通过将与肿瘤细胞的增殖、浸润、转移相关的分子作为靶点，抑制肿瘤细胞的增殖，同时抑制肿瘤的发展过程，从而不仅抑制原发肿瘤，而且还抑制肿瘤的转移。

作为本发明的癌症分子靶向药物，可举出选自ALK抑制剂、EGFR抑制剂、多激酶抑制剂、HER2/EGFR抑制剂、mTOR抑制剂、BRAF抑制剂、MEK抑制剂和BCR－ABL抑制剂中的1种以上(以下，称为“本发明的癌症分子靶向药物”)。

在此，“ALK抑制剂”抑制间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase：ALK)的酪氨酸激酶

“EGFR抑制剂”抑制表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor：EGFR)的T790M基因突变和激活突变，

“多激酶抑制剂”抑制参与肿瘤细胞增殖和血管生成的RAF、血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor：VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived growth factor Receptor：PDGFR)、转染期间重排(Rearranged duringTransfection，RET)等多个酪氨酸激酶，

“HER2/EGFR抑制剂”抑制EGFR家族的EGFR和HER2(EGFR2)这两者，

“mTOR抑制剂”抑制哺乳类雷帕霉素靶点蛋白(mammalian target of rapamycin：mTOR)，

“BRAF抑制剂”抑制突变型BRAF(V600E、V600K和V600D变异阳性)的激酶活性，

“MEK抑制剂”抑制丝裂原激活细胞外信号调节激酶(Mitogen-activatedextracellular signal-regulated kinase：MEK)1/MEK2的激酶活性，

“BCR－ABL抑制剂”抑制断裂点簇集区-Abelson(Breakpoint cluster region-abelson，Bcr－Abl)、KIT、PDGFR的酪氨酸激酶。

具体而言，作为ALK抑制剂，例如可举出克唑替尼(Crizotinib)、阿来替尼(Alectinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、劳拉替尼(Lorlatinib)、布加替尼(Brigatinib)、恩曲替尼(Entrectinib)；作为EGFR抑制剂，例如可举出奥希替尼(Osimertinib)、吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、阿法替尼(Afatinib)、达克替尼(Dacomitinib)、西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)；作为多激酶抑制剂，例如可举出索拉非尼(Sorafenib)、凡德他尼(Vandetanib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、瑞戈菲尼(Regorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、阿昔替尼(Axitinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、卡博替尼(Cabozantinib)、尼达尼布(Nintedanib)；作为HER2/EGFR抑制剂，例如可举出拉帕替尼(Lapatinib)；作为mTOR抑制剂，例如可举出依维莫司(Everolimus)、坦罗莫司(Temsirolimus)、GDC－0980(RG7422)、AZD2014、PI－103、KU－0063794、AZD8055、GSK1059615、OSI－027、PF－04691502、PF－05212384(PKI－587)、WAY－600、GSK2126458、PP242、WYE－125132、WYE－687、PP－121、Torin 2、Torin 1、INK 128；作为BRAF抑制剂，例如可举出达拉非尼(Dabrafenib)、维莫非尼(Vemurafenib)、康奈非尼(Encorafenib)；作为MEK抑制剂，例如可举出曲美替尼(Trametinib)、比美替尼(Binimetinib)；作为BCR－ABL抑制剂，例如可举出伊马替尼(Imatinib)、达沙替尼(Dasatinib)、博舒替尼(Bosutinib)、普纳替尼(Ponatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)。作为优选的癌症分子靶向药物，可举出阿来替尼、克唑替尼、色瑞替尼、奥希替尼、索拉非尼、凡德他尼、乐伐替尼、拉帕替尼、依维莫司、达拉非尼、曲美替尼、伊马替尼、达沙替尼。

其中，从与式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐的联用效果的方面考虑，作为癌症分子靶向药物，优选ALK抑制剂、EGFR抑制剂、多激酶抑制剂、mTOR抑制剂、BRAF抑制剂、MEK抑制剂、BCR－ABL抑制剂，进一步优选为ALK抑制剂、多激酶抑制剂。另外，作为癌症分子靶向药物，优选为阿来替尼、克唑替尼、色瑞替尼、奥希替尼、索拉非尼、凡德他尼、乐伐替尼、依维莫司、达拉非尼、曲美替尼、伊马替尼、达沙替尼，进一步优选为、阿来替尼、克唑替尼、色瑞替尼、索拉非尼、凡德他尼。

如后述的实施例那样，通过将式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐和本发明的癌症分子靶向药物联合给药，从而发挥明显强于单剂给药时的细胞杀伤活性和抗肿瘤效果。该细胞杀伤活性在由使用联合用药效果解析用软件CalcuSyn(HULINKS)的median-effect法(Pharmacol Rev 58:621-681,2006)算出的联用效果的评价(联合用药指数，combination index：CI)中表现出CI为0.9以下的协同效应。

因此，式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐与本发明的癌症分子靶向药物的组合作为抗肿瘤剂是有用的。另外，式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐作为与本发明的癌症分子靶向药物联合给药的抗肿瘤剂是有用的。另外，式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐作为本发明的癌症分子靶向药物的抗肿瘤效果增强剂是有用的，另外，本发明的癌症分子靶向药物作为式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐的抗肿瘤效果增强剂是有用的。

作为可用本发明的抗肿瘤剂来治疗的癌症，没有特别限定，例如，可举出非小细胞肺癌、舌癌、甲状腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、白血病等，优选为非小细胞肺癌、舌癌、甲状腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌。

将本发明的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐与癌症分子靶向药物组合而成的抗肿瘤剂可以将作为配合剂的上述式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐和癌症分子靶向药物各自的有效量以适当的配合比制剂化为一种剂型的药剂(1剂型形态)，也可以是以能够同时或间隔分别使用的方式、将含有上述各成分的各自有效量的药剂单独制剂化的药剂(2剂型形态)。

作为上述制剂的给药方式，没有特别限定，可以根据治疗目的而适当地选择，具体而言，可以例示口服制剂(片剂、包衣片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂等)、注射剂、栓剂、贴剂、软膏剂等。式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐和癌症分子靶向药物可以为不同的给药方式，也可以为相同的给药方式。

含有本发明中的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐、和/或本发明的癌症分子靶向药物的制剂可以使用药理学上允许的载体并利用通常公知的方法来制备。作为上述载体，可以例示通常的药剂中通用的各种载体，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、增溶剂、助悬剂、等渗调节剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定化剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等。

作为赋形剂，例如，可举出乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、肌醇、右旋糖酐、山梨醇、白蛋白、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、甲基纤维素、甘油、藻酸钠、阿拉伯胶和这些的混合物等。作为润滑剂，例如，可举出精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇和这些的混合物等。作为粘合剂，例如，可举出单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、乙基纤维素、水、乙醇、磷酸钾和这些的混合物等。作为崩解剂，例如，可举出干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉、昆布糖粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖和这些的混合物等。作为稀释剂，例如，可举出水、乙醇、聚乙二醇(Macrogol)、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类和这些的混合物等。作为稳定化剂，例如，可举出焦亚硫酸钠、乙二胺四乙酸、巯基乙酸、巯基乳酸和这些的混合物等。作为等渗调节剂，例如，可举出氯化钠、硼酸、葡萄糖、甘油和这些的混合物等。作为pH调节剂和缓冲剂，例如，可举出柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸钠、磷酸钠和这些的混合物等。作为无痛化剂，例如，可举出盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因和这些的混合物等。

应予说明，上述制剂中的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐、以及本发明的癌症分子靶向药物的配合量可以适当地设定，一般，制剂中式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐为0.001～5000mg，优选为0.1～1000mg，更优选为1～500mg。癌症分子靶向药物可在各药剂中允许的范围内适当地设定。例如，如果为阿来替尼，则为150～600mg，如果为索拉非尼，则为200～800mg。

将本发明的抗肿瘤剂制成试剂盒时，可以设计成如下方式，即，将含有如上所述制剂化的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐、以及本发明的癌症分子靶向药物而成的药剂分别独立包装，在给药时从各自的包装中取出各自的药物制剂使用。另外，也可以将各药物制剂以适于每1次的联合给药的形式包装。

本发明中的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐、以及本发明的癌症分子靶向药物的给药量只要是式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐和本发明的癌症分子靶向药物协同发挥抗肿瘤效果并能够有效地治疗癌症的量，就没有特别限制，可根据患者的年龄、癌症类型、病期、转移的有无、治疗史、其它抗肿瘤剂的有无等而适当地设定，式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐以式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物换算量计为0.001～5000mg/天，优选为0.1～1000mg/天，更优选为1～500mg。癌症分子靶向药物可在各药剂中允许的范围内适当地设定。例如，如果为阿来替尼，则可以例示150～600mg/天，如果为索拉非尼，则可以例示200～800mg/天。

本发明中的式(I)表示的喹啉羧酰胺衍生物或其盐、以及本发明的癌症分子靶向药物的给药顺序、给药间隔只要是可得到协同效应的范围，就没有特别限定。另外，制成试剂盒时，可以将各个单独的制剂同时或间隔给药。

实施例

＜材料和实验方法＞

1.细胞培养

NCI-H2228、NCI-H1975、SK-BR-3、Hep3B、MCF-7、Caov-3、A2058、K562和SUP-B15购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，SAS和HuH-7购自国立研究开发法人医药基础·健康·营养研究所，K1、FTC-133和Ishikawa购自欧洲细胞株/微生物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures)。细胞用含有100U/mL青霉素(penicillin)、100μg/mL链霉素(streptomycin)(Thermo Fisher Scientific,商品编码15140-122)的表1的培养基在5％CO₂、37℃的条件下进行传代培养，用于实验。胎牛血清(Fetal bovine serum)(以下，简称为FBS)和MCDB 105培养基购自Sigma Aldrich(商品编码172012和117-500)，RMPI1640培养基、DMEM培养基、Ham’s F-12培养基、MEM培养基和IMDM培养基购自Thermo Fisher Scientific(商品编码A1049101、11995-065、11765-054、11095-080和12440-053)。

[表1]

2.药剂

下式表示的N－[5－(2－呋喃基)－1,3,4－二唑－2－基]－2－苯基－6－三氟甲氧基－4－喹啉羧酰胺(以下，称为“STX－1159”)依据专利文献1中记载的方法来合成。

克唑替尼(Crizotinib)、依维莫司(everolimus)和曲美替尼(trametinib)购自LCLaboratories(商品编码C-7900、E-4040、V-2800和T-8123)。阿来替尼(Alectinib)、奥希替尼(osimertinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)购自Selleckchem.com(商品编码S2762、S7297和S1164)，色瑞替尼(ceritinib)购自Active Biochem(商品编码A-1189)。索拉非尼(Sorafenib)购自Cayman Chemical(商品编码10009644)，凡德他尼(vandetanib)、拉帕替尼(lapatinib)和达拉非尼(dabrafenib)购自Santa Cruz Biotechnology(商品编码sc-220364、sc-202205和sc-364477)。伊马替尼(Imatinib)购自Cell Signaling Technology(商品编码9084)，达沙替尼(dasatinib)购自Bio Vision(商品编码1586)。全部的药剂溶解于二甲基亚砜(以下，简写为DMSO)。

实施例1药剂联用效果的评价

(1)基准用量的设定

将各细胞以达到表2中记载的密度的方式接种于96孔板，在5％CO₂、37℃的条件下培养。在接种后的第二天单独添加各药剂。在空白组中将DMSO以达到最终浓度0.05％的方式进行添加。继而在5％CO₂、37℃的条件下培养表2中记载的时间后，通过WST-8分析来评价活细胞数量。即，将WST-8试剂盒溶液(Kishida Chemical，商品编码260-96162)向各孔中分别添加10μL，在5％CO₂、37℃的条件下培养1～2小时。使用酶标仪(Molecular Devices,型号SpectraMax Plus)对因细胞内的线粒体的酶活性而生成的水溶性的蓝紫色甲瓒(Formazan)的450nm的吸光度进行测定。将其作为活细胞数量进行评价，算出50％细胞生长抑制浓度(以下，简写为IC₅₀)。各药剂的基准用量根据IC₅₀而进行设定(表3)。

[表2]细胞密度和培养时间

[表3]

基准用量

(2)基于median-effect法的联用效果的评价

将各细胞以达到表2中记载的密度的方式接种于96孔板，在5％CO₂、37℃的条件下培养。在接种后的第二天，在单独组中将STX-1159和各药剂以达到基准用量的1/4、1/2、1、2和4倍的最终浓度的方式进行添加，在联用组中以STX-1159和各药剂达到基准用量的1/4倍彼此、1/2倍彼此、1倍彼此、2倍彼此和4倍彼此组合的最终浓度的方式进行添加。空白组中将DMSO以达到最终浓度0.1％的方式进行添加。继而，在5％CO₂、37℃的条件下培养表2中记载的时间后，通过WST-8分析来测定活细胞数量。由下式算出影响分数(fractionaffected，以下，简写为fa)。

fa＝1-(药剂曝露组的活细胞数量)/(空白组的活细胞数量)

根据使用联用效果解析用软件CalcuSyn(HULINKS)的median-effect法，由将STX-1159和各药剂分别单独使用或联用曝露时的fa而算出联合用药指数(combination index，以下，简写为CI)。联用效果的评价按照表4的基于CI的分级。应予说明，当算出CI时，采用同样实施的2次以上的实验值的平均值。

[表4]

基于CI的联用效果的分级

(3)结果

使用median-effect法对STX-1159与各药剂的联用效果进行评价，结果，STX-1159与克唑替尼、阿来替尼、色瑞替尼、奥希替尼、索拉非尼、凡德他尼、乐伐替尼、拉帕替尼、依维莫司、达拉非尼、曲美替尼、伊马替尼或达沙替尼的联用表现出协同效应(表5)。根据该结果，启示了STX-1159与这些药剂的组合作为联用药物疗法都是有效的。

[表5]

联用效果的评价结果

实施例2基于STX-1159与阿来替尼的联用而对STAT3和ALK的信号传递途径构成分子的抑制

(1)基于蛋白质印迹法的评价

为了确认对NCI-H2228细胞的增殖表现出协同抑制作用的STX-1159与阿来替尼的联用会抑制细胞内的STAT3或ALK，利用蛋白质印迹法对两药剂给NCI-H2228细胞中的磷酸化STAT3、磷酸化ALK、生存素(survivin)和c-myc的蛋白质量的影响进行研究。

将NCI-H2228细胞以达到2×10⁵细胞/孔的方式接种于6孔板，在5％CO₂、37℃的条件下进行培养。在接种后的第二天将STX-1159以最终浓度达到5μM的方式或者将阿来替尼以最终浓度达到0.01或0.1μM的方式单独或联用添加。在空白组中将DMSO以达到最终浓度0.1％的方式添加。添加药剂后在5％CO₂、37℃的条件下培养24小时后回收细胞。将细胞用冰冷PBS清洗1次，加入添加了蛋白酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque株式会社,商品编码25955-11)和磷酸酶抑制剂混合物(Nacalai Tesque株式会社,商品编码07574)的RIPABuffer(25mM Tris-HCl,pH7.6，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl)将细胞裂解。对该裂解液实施电泳，使用半干型转录装置将丙烯酰胺凝胶内的蛋白质转录到Immobilon PVDF膜上。转录后，将膜封闭，以4℃在1次抗体(抗磷酸化STAT3(Y705)抗体：Cell Signaling Technology,商品编码CST9131，抗STAT3抗体：Cell SignalingTechnology,商品编码CST4904，磷酸化ALK(Y1278/Y1282/Y1283)抗体：Cell SignalingTechnology,商品编码CST3983，抗ALK抗体：Cell Signaling Technology,商品编码CST3633，抗生存素抗体：R&D Systems,商品编码AF886，抗c-myc抗体：Cell SignalingTechnology,商品编码CST9402和抗β-actin抗体：Sigma Aldrich,商品编码A5316)溶液中浸渍过夜。进一步以室温在2次抗体溶液中浸渍1小时后，使用ECL select(GE HealthcareJapan株式会社,商品编码RPN2235)来检测膜上的目标蛋白质。

(2)结果

将蛋白质印迹法的结果示于图1。

对STX-1159与阿来替尼的联用是否抑制细胞内的STAT3或ALK进行研究。认为在STX-1159单独的作用下使磷酸化STAT3、生存素和c-myc减少，另外，在阿来替尼单独的作用下使磷酸化ALK、磷酸化STAT3和c-myc减少。认为磷酸化STAT3和c-myc(STAT3途径和ALK途径的下游因素)与各单剂相比，通过将两药剂联用而实现了进一步的减少。根据该结果，认为STX-1159与阿来替尼的联用通过重复抑制STAT3途径而协同发挥细胞增殖抑制作用。

实施例3 STX-1159与mTOR抑制剂的联用效果的评价

(1)基准用量的设定

将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞或MDA-MB-468(为雷帕霉素时)以分别为2.5×10³/100μL/孔或1.0×10³/100μL/孔的方式接种于96孔板，在5％CO₂、37℃的条件下进行培养。在接种后的第二天，单独添加表7中记载的各药剂。空白组中将DMSO以达到最终浓度0.05％的方式进行添加。继而，在5％CO₂、37℃的条件下培养48小时后，通过WST-8分析来评价活细胞数量。即，将WST-8试剂盒溶液(Kishida Chemical，商品编码260-96162)向各孔中分别添加10μL，在5％CO₂、37℃的条件下培养1～2小时。使用酶标仪(Molecular Devices，型号SpectraMax Plus)对因细胞内的线粒体的酶活性而生成的水溶性的蓝紫色甲瓒的450nm的吸光度进行测定。将其作为活细胞数量进行评价，算出50％细胞生长抑制浓度(以下，简写为IC₅₀)。各药剂的基准用量根据IC₅₀而进行设定(表6)。

[表6]

基准用量

(2)WST-8分析的实验方法

将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞或MDA-MB-468(为雷帕霉素时)以分别为2.5×10³/100μL/孔或1.0×10³/100μL/孔的方式接种于96孔板。在37℃的CO₂培养箱内孵育，24hr后，丢弃上清液，添加80μL的分析用培养基。添加梯度稀释后的10μL的mTOR抑制剂溶液(表7中记载的药剂)，接着添加梯度稀释后的10μL的STX-1159溶液。在CO₂培养箱内静置48小时后除去上清液，用PBS(-)100μL清洗1次。以100μL/孔添加用分析用培养基10倍稀释后的WST-8溶液，用酶标仪测定波长450nm的吸光度。利用测定值而算出CI。

(3)CI值的计算

STX-1159与mTOR抑制剂的联用效果通过使用Calcusyn软件(BIOSOFT，Cambridge，UK)进行解析。基于CI的联用效果的分级使用与实施例1的表4相同的基准。将结果示于表7。

(4)结果

STX-1159与表7中记载的mTOR抑制剂的联用表现出协同效应(表7)。根据其结果，启示了STX-1159与这些药剂的组合作为联用药物疗法都是有效的。

[表7]