具体实施方式

本发明人已经开发了一种基于液滴微流体的改进的单细胞ChIP方法，所述方法相比于在Rotem中公开的Drop-ChIP技术导致了每个个体细胞富集的基因座的数量的5至10倍增加(参见图7)。该方法允许以高灵敏度和高精度在单细胞水平评估组蛋白修饰、DNA修饰的碱基(包括用于在单细胞或任何生物要素水平识别正在进行的DNA复制事件的修饰的核苷酸)、染色质/DNA相关因子。该方法适用于识别具有与另一者不同的特征的细胞群或任何生物要素，这些特征是组蛋白和/或DNA修饰、因子的存在。这些要素的存在或不存在然后潜在地指示基因表达中的变化，因此可以用作生物标记物、恢复该等变化的治疗靶标。

充分理解的是，细胞可以表示细胞核，作为染色质结构的区室。细胞或细胞核或任何生物要素可以是固定的生物要素。固定剂的实例包括醛(包括但不限于甲醛、多聚甲醛)，醇(包括但不限于乙醇和甲醇)，氧化剂，汞，苦味酸盐，羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(HOPE)固定剂。

如在Drop-ChIP(Rotem等，2015，Nature Biotechnol.33(11)：1165-1172)中，分别生成包含细胞的液滴和包含条形码的液滴，然后在专用的微流体融合设备中将其重新注入并一对一融合(见图1)。然而，本发明的方法在表征条形码策略的至少两个方面不同于Rotem。第一，本发明人用携带数百万个独特或最丰富的DNA序列的水凝胶珠粒(或任何固体载体)代替了从包含寡核苷酸的微量滴定板乳化的可溶性条形码。第二，根据本发明的一个方面的条形码结构的新型设计允许线性扩增所有条形码化核小体，而非仅如Rotem中那样在两端上均对称地条形码化的核小体。第三，条形码设计包括增加感兴趣的核酸的条形码化的效率的额外特征。这些特征包括将保护性部分添加至“不完整条形码”以防止它们附着于感兴趣的核酸。在另一个方面，条形码可包含在全长寡核苷酸上的保护性碱基(保护性碱基包括但不限于硫代磷酸酯(phosphorotioate)、LNA/BNA、核苷酸亚磷酰胺(phosphoramitidite)、合成环、非3’OH或5’P碱基、2’-O-甲基-DNA/RNA)，这些保护性碱基将保护全长条形码，而非全长条形码可用核酸外切酶来消化。

可以添加一组额外的条形码(称为“实验条形码”)以在单个免疫沉淀反应中多路进行不同实验。后续生物信息学分析将允许基于“实验条形码”的序列对实验条件进行多路分解。

充分理解的是，条形码是可将源自一个区室的核酸的具体特征与源自另一区室的核酸的具体特征区分开的核酸序列。这些条形码的产生是本领域技术人员已知的，并且可以代表随机序列(侧接或不侧接已知序列)，或通过拆分合并合成(split pool synthesis)产生(Klein等，Cell，2015)。

此外，根据本发明的一个方面的方法的特征在于同步/暂停步骤，所述同步/暂停步骤限制了液滴之间的染色质消化中的细胞间变化。

前述优点公开于下文表征本发明的一个方面的方面和实施方式中。在实施例和图中提供了本发明的实施。

在本发明的一个方面，提供了一种使用微流体系统来识别一个或多个感兴趣的基因组区域的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供至少第一类型的液滴，其中所述第一类型的液滴包含

i.生物要素，

ii.裂解缓冲液，和

iii.核酸酶，

b.在暂时使所述核酸酶失活的条件下收集所述第一类型的液滴，

c.孵育所述第一类型的液滴，从而重新激活所述核酸酶，

d.提供至少第二类型的液滴，其中所述第二类型的液滴包含核酸序列，

e.融合所述第一类型的液滴和所述第二类型的液滴，从而生成第三类型的液滴，

f.孵育所述第三类型的液滴，从而将所述核酸序列连接至至少一个感兴趣的基因组区域，

g.对所述一个或多个感兴趣的基因组区域进行测序。

本发明的一个方面的方法是在微流体系统中实现的。在本发明的一个方面的背景下，术语“微流体系统”是指具有通常以微米或亚微米规模制造的一个或多个通道和/或腔室的系统或装置。

本发明的一个方面的方法的特征在于存在第一、第二和第三类型的液滴。如本文所使用的，与液滴相关联的术语“第一”、“第二”和“第三”用于根据液滴的内容物来区分液滴。由于该方法是在微流体系统中进行的，因此术语“液滴”也指“微流体液滴”。因此，在微流体系统的背景下，术语“液滴”也指被第二流体包围的第一流体的单独部分，其中第一流体和第二流体是不混溶的。

根据本发明的一个方面的方法的阶段或步骤，液滴可包含于微流体系统中(芯片上)或与微流体系统分开的收集器设备中(芯片外)。液滴可具有球形或非球形形式。

在本发明的一个方面的一个实施方式中，液滴的体积范围为约20pl至约100pl。优选地，液滴的体积范围为约30pl至约70pl。更优选地，液滴的体积范围为约40pl至约50pl。理想地，液滴的体积为约45pl。如本文所用，术语“约”是指规定值的值±10％的范围。

如本文所用，术语“裂解缓冲液”是指能够裂解生物细胞的缓冲液。术语“裂解缓冲液”的含义在本领域技术人员的公知常识之内。

如本文所用，术语“基因组区域”是指DNA或RNA编码的核酸序列。

如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割连接核酸分子中的核苷酸残基的磷酸二酯键的酶试剂。核酸酶可消化双链、单链、环式和线性核酸分子。在本发明的一个方面的背景下，核酸酶可以是切割在多核苷酸链内的磷酸二酯键的核酸内切酶，或切割在多核苷酸链的末端处的磷酸二酯键的核酸外切酶，可以是转座酶。核酸酶也可以是位点特异性核酸酶，其切割在特定核苷酸序列(例如识别序列)内的特定磷酸二酯键。核酸酶的非限制性实例是微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease，MNase)。在一个特定的实施方式中，核酸酶是微球菌核酸酶(MNase)。

如本文所用，术语“生物要素”可指单个细胞、细胞核、包含核酸的细胞器(例如线粒体)，并且可以从生物体、人或非人受试者获得。在后一种情况下，非人受试者不限于哺乳动物受试者。

由于细胞是以不同时间尺度依次处理的，因此对液滴中的单个生物要素进行酶促测定具有挑战性。例如，细胞或任何生物要素的包封步骤持续约20分钟，其是与孵育步骤相同的数量级。因此，在一开始包封于液滴中的细胞或任何生物要素与生产结束时包封于液滴中的细胞或任何生物要素相比将与核酸酶接触更长的时间。对于融合设备中液滴的重新注入，可以作出类似的观察(参见图1中的一般方案)。确实，取决于实验的设计，两种乳液的融合可持续1小时至4小时，这意味着一些含有片段化DNA的液滴在融合之前以及其微球菌核酸酶被EGTA失活之前“等待”数小时。因此，同步和暂停酶活性是至关重要的，以避免引入在个体细胞或任何生物要素之间的染色质消化变化。

值得注意的是，在常规批量ChIP-seq分析中，核酸酶的失活在加入EGTA的核酸酶孵育后立即发生。不同的是，在单细胞ChIP-seq分析中，EGTA不可以立即加至液滴内，并且核酸酶仅在与包含条形码的液滴融合后才被失活。

为了控制和限制染色质消化中细胞间或任何生物要素变化，本发明人引入了在使所述核酸酶暂时失活的条件下收集第一类型的液滴的步骤。目的是使液滴中的核酸酶活性同步/暂停的所述收集步骤是在每个孵育步骤之前进行的。本发明人发现，液滴区室使微球菌核酸酶对温度变化敏感且能够选择性地阻断/重新激活并重新阻断酶活性。对核酸酶活性的这种严格控制在批量中是不可能的。该影响被怀疑不是依赖于单独的微球菌核酸酶活性，而是依赖于任何酶。

因此，根据另一个实施方式，所述方法进一步包括在步骤(e)之前在使所述核酸酶暂时失活的条件下收集第一类型的液滴的步骤。

在又一个实施方式中，步骤(b)的条件包括选择-20℃至10℃范围的温度，并且步骤(c)的条件包括选择20℃至40℃范围的温度。

可以在微流体系统外(芯片外)孵育液滴以进行单细胞染色质片段化。当裂解发生在液滴中时，来自裂解细胞的核DNA可接触核酸酶。因此，消化的动力学对于优先地产生单核小体特别重要，所述单核小体保留于液滴中。

在一个特定的实施方式中，定时所述孵育步骤(c)以获得片段化为单核小体的核DNA。

在又一个实施方式中，所述一个或多个感兴趣的基因组区域包含一个或多个修饰的基因组区域。

在又一个实施方式中，所述一个或多个感兴趣的基因组区域是修饰的基因组区域。

根据本发明，所述修饰的基因组区域包含与核酸序列相关联的蛋白质复合物和/或核酸序列。在一个特定的实施方式中，所述修饰的基因组区域是修饰的单核小体。在另一个实施方式中，所述修饰的基因组区域是转录因子结合位点、染色质修饰子结合位点、染色质重塑子(remodeler)位点、组蛋白伴侣(chaperone)结合位点。

根据本发明，所述修饰的基因组区域还可包含翻译后修饰，所述翻译后修饰选自乙酰化、酰胺化、脱酰胺化、羧化、二硫键、甲酰化、糖基化、羟基化、甲基化、肉豆蔻酰基化、亚硝基化、琥珀酰化(assuccinylation)、丁酰化、磷酸化、异戊烯化、核糖基化、硫酸化、SUMO化(sumoylation)、泛素化及其衍生物。

根据本发明，修饰的基因组区域还可包含组蛋白变体，所述组蛋白变体选自CENP-A/CID/cse4(着丝粒的表观遗传标记物)、H3.3(转录)、H2A.Z/H2AV(转录/双链断裂修复)、H2A.X(性染色体的双链断裂修复/减数分裂重塑)、macroH2A(基因沉默/X染色体失活)、H2A.Bbd(活性染色质的表观遗传标记物)、H3.Z(对外部刺激的细胞应答的调节)、H3.Y(对外部刺激的细胞应答的调节)。

根据本发明，所述修饰的基因组区域还可包含修饰的DNA序列，所述修饰的DNA序列选自甲基化及其衍生物、修饰的核苷酸(例如EdU、BrdU、IdU、CldU等)。最常见的修饰碱基的方法是添加甲基标记物，并且在各种物种中，已经在胞嘧啶和腺嘌呤上发现甲基化，产生5mC、N4-甲基胞嘧啶(N4mC)或6-甲基腺嘌呤(6mA)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。

如上文介绍的，在Rotem中公开的方法的显著局限在于，只有对称索引化的核小体才可被扩增，并且可为测序文库的一部分。该要求极大地增加了系统的严格性，并对核小体施加了强力的选择，其限于两端均与条形码连接的那些。与Drop-ChIP方法相反，本发明人已经出人意料地发现，从仅一端对核小体进行索引化会增加单细胞覆盖率并最终提高该系统在单细胞染色质谱分析之间区分更细微变化的能力。

在又一个实施方式中，核酸序列不对称地连接至所述至少一个或多个感兴趣的基因组区域。

如本文所用，术语“不对称连接”是指与感兴趣的基因组区域连接的至少一个条形码的存在，由此所述连接是仅与所述感兴趣的基因组区域的两个末端之一。

在本发明进一步的方面，提供一种核酸序列，其包含：

a.至少一个索引序列，

b.测序接头，和

c.至少一个位于3’-和/或5’-端处的保护官能团。

如本文所用，术语“核酸序列”是指单链或双链核酸。在另一个实施方式中，“核酸序列”可以是DNA或RNA。在一个优选的实施方式中，“核酸序列”是双链DNA。在一些实施方式中，“核酸序列”包含双链DNA，所述双链DNA包含第一链条形码和第二链条形码。在一些实施方式中，所述第一链条形码和第二链条形码包含互补序列。在一些实施方式中，所述第一链条形码和第二链条形码包含非互补序列。

如本文所用，术语“索引序列”是指独特的核苷酸序列，所述独特的核苷酸序列可与任何其他索引序列以及核酸序列(其中其被包含)内的任何其他核苷酸序列区别开来。“索引序列”可以是随机的或特别设计的核苷酸序列。“索引序列”可以是任何序列长度的。可以将根据本发明进一步的方面的核酸序列与感兴趣的基因组区域(靶标)连接以标记需要识别的物种和/或区分其群体内的标记物种的不同成员。因此，在本发明的一个方面的背景下，术语“索引序列”和“条形码”可以互换地使用。

如本文所用，术语“测序接头”是指已知序列的寡核苷酸，其与感兴趣的多核苷酸或多核苷酸链的连接或掺入使得能够产生准备扩增的所述感兴趣的多核苷酸或多核苷酸链的产物。

在本发明进一步的方面的一个实施方式中，所述核酸序列进一步包含至少一个切割位点。

如本文所用，术语“切割位点”是指易于由任何方式(包括但不限于能够切割单链或双链核酸序列的酶)被切割的核酸序列的靶区域。在本发明的一个方面的背景下，所述“切割位点”可用于切割或以其他方式释放核酸序列的一部分。所述“切割位点”被切割剂识别，所述切割剂可以是天然的、合成的、未修饰的或修饰的。

在本发明的一个实施方式中，保护官能团选自在3’端上的间隔元件和在5’端上的双脱氧修饰碱基。在本发明的一个方面的背景下，合适的非限制性间隔元件是三碳间隔子(C3间隔子)。

在本发明的另一个实施方式中，所述至少一个切割位点是包含回文区的限制性位点。

如本文所用，术语“限制性位点”是指被限制性内切酶(例如核酸内切酶)识别的位点。本领域技术人员熟悉限制性核酸内切酶及其限制性位点。限制性位点的非限制性实例包括BamHI、Bsrl、Notl、Xmal、PspAI、DpnI、Mbol、Mnll、Eco57I、Ksp6321、Dralll、Ahall、Smal、Mlu1、Hpal、Apal、Bcll、BstEII、Taql、EcoRI、Sacl、Hindll、Haell、Drall、Tsp509l、Sau3AI、Pacl。

在本发明的另一个实施方式中，所述核酸序列适合用于根据本发明的第一方面及其实施方式所述的方法。

在本发明的另一个实施方式中，所述核酸序列适合用于对从受试者获得的样品中的表观遗传状态进行谱分析。

如本文所用，术语“样品”是指生物样品。

如本文所用，术语“受试者”是指人或非人受试者。在后一种情况下，非人受试者不限于哺乳动物受试者。

根据本发明的一个方面的方法可以在基因的鉴定，在受试者中的疾病状态的诊断和/或预后中涉及的因素，以及用于受试者中的疾病状态的诊断和/或预后和用于控制治疗性分子对染色质的作用的方法中找到不同应用。

在本发明的背景下，疾病状态可以指涉及核小体或核酸序列的任何修饰以及影响染色质结构、调节和功能的蛋白质的定位。如本文所用，表述“疾病状态”还涵盖细胞增殖的异常速率，其使得疾病的治疗需要调节细胞周期。增生性疾病的实例包括但不限于癌症。

根据本发明的一个方面的方法可用于抗药性的体外诊断和/或预后，其中通过使用微流体系统对从受试者获得的细胞中的单细胞染色质状态进行谱分析，所述方法包括以下步骤：

a.提供至少第一类型的液滴，其中所述第一类型的液滴包含

i.生物要素，

ii.裂解缓冲液，和

iii.核酸酶，

b.在暂时使所述核酸酶失活的条件下收集所述第一类型的液滴，

c.孵育所述第一类型的液滴，从而重新激活所述核酸酶，

d.提供至少第二类型的液滴，其中所述第二类型的液滴包含核酸序列，

e.融合所述第一类型的液滴和所述第二类型的液滴，从而生成第三类型的液滴，

f.孵育所述第三类型的液滴，从而将所述核酸序列连接至一个或多个感兴趣的基因组区域，

g.对所述一个或多个感兴趣的基因组区域进行测序。

所述抗药性可能是新出现的抗药性和/或现存的抗药性。所述抗药性的出现可以归因于表观遗传异质性。

单细胞染色质谱分析表现为探查任何复杂生物系统内的染色质状态的异质性和动力学的独特工具：除癌症外，它还可被应用于其他疾病(特别是自身免疫疾病，传染性、代谢疾病)和健康系统，尤其是研究细胞分化和发展以及免疫监控。

根据本发明的一个方面的方法可用于确定患者分层，其中使用微流体液滴中的单细胞表观遗传学谱分析将抗药性与不同染色质状态相关联是需要的。

在本发明的实施方式中，提供了一种用于处于疾病状态和/或怀疑处于疾病状态的受试者中的抗药性的诊断和/或预后的方法。

在本发明的实施方式中，提供了用于健康受试者中的抗药性的诊断和/或预后的方法。

根据本发明，可以在受试者接受治疗或疗法之前、期间或之后的时间点进行所述受试者中的抗药性的诊断和/或预后。所述诊断和/或预后也可以在任何其他时间点进行。所述治疗或疗法可能是使用化学治疗药物、化学药物或生物药物(例如抗体(及其衍生物或片段))的治疗或疗法，包括抗免疫检查点治疗，例如趋化因子，例如激素，例如细胞因子(及其衍生物)，或例如由以下组成的细胞疗法：TIL(肿瘤浸润的T细胞)注射，CAR T细胞(嵌合相关抗原)，CAR NK细胞，TCR疗法(以可溶性或细胞性疗法的形式)，例如疫苗接种(癌症疫苗、病毒疫苗、诱导疫苗接种的树突状细胞疗法)，例如溶瘤病毒，例如纳米粒子。

在本发明的实施方式中，提供了一种用于显示抗药性和/或怀疑具有抗药性的受试者的诊断和/或预后的方法。

所述受试者可以是处于疾病状态和/或被怀疑具有疾病状态的受试者或健康受试者。

如本文所用，术语“诊断”是指关于受试者是否可能显示或发生抗药性的确定。如本文所用的术语“诊断”是指本领域技术人员可以藉此估计和/或确定受试者患有和/或进一步发生抗药性(例如对治疗剂、化学治疗药物、化学药物或生物药物(例如抗体(及其衍生物或片段))的抗性的概率(“可能性”)的方法，包括抗免疫检查点治疗，例如趋化因子，例如激素，例如细胞因子(及其衍生物)，或例如由以下组成的细胞疗法：TIL(肿瘤浸润的T细胞)注射，CAR T细胞(嵌合相关抗原)，CAR NK细胞，TCR疗法(以可溶性或细胞性疗法的形式)，例如疫苗接种(癌症疫苗、病毒疫苗、诱导疫苗接种的树突状细胞疗法)，例如溶瘤病毒，例如纳米粒子)的方法。在本发明的情况下，“诊断”包括使用测定的结果，最优选scChIP。

如本文所用，术语“预后”是指对于疾病(例如癌症，包括复发和转移性扩散、炎症、感染性疾病、自身免疫疾病、代谢疾病、遗传和非遗传疾病)的可归因于抗药性的死亡或发展的可能性的预测。

根据本发明的方法可使用源自身体样品的单细胞。

在本发明的实施方式中，所述身体样品是流体和/或固体。如本文所用，所述身体样品可以来自组织、血液、血清、血浆、唾液、粪便、尿液、乳房、肺、结肠、肠、脑、结肠、肾脏或任何其他身体样品。

根据本发明，所述一个或多个感兴趣的基因组区域是修饰的基因组区域。所述修饰的基因组区域包含核酸序列和/或与核酸序列相关联的蛋白质复合物。所述修饰的基因组区域包括翻译后修饰，所述翻译后修饰选自乙酰化、酰胺化、脱酰胺化、羧化、二硫键、甲酰化、糖基化、羟基化、甲基化、肉豆蔻酰基化、亚硝基化、磷酸化、异戊烯化、核糖基化、硫酸化、SUMO化、泛素化及其衍生物。

进一步地，所述细胞源自处于疾病状态和/或被怀疑处于疾病状态的受试者或健康受试者。在本发明的一个实施方式中，所述细胞是未经处理和/或经处理的，或者所述细胞来自未经治疗或经治疗的受试者。

在一个实施方式中，用化学治疗药物、化学药物或生物药物处理来自经治疗的受试者的经处理的细胞。

在优选的实施方式中，用化学治疗药物、化学药物或生物药物(例如抗体(及其衍生物或片段)，包括抗免疫检查点治疗，例如趋化因子，例如激素，例如细胞因子(及其衍生物)或例如由以下组成的细胞疗法：TIL(肿瘤浸润的T细胞)注射，CAR T细胞(嵌合相关抗原)，CAR NK细胞，TCR疗法(以可溶性或细胞性疗法的形式)，例如疫苗接种(癌症疫苗、病毒疫苗、诱导疫苗接种的树突状细胞疗法)，例如溶瘤病毒，例如纳米粒子)处理所述细胞。在更优选的实施方式中，用化学治疗药物处理所述细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述细胞未经处理或所述细胞来自未经治疗的受试者。

如本文所用，“疾病状态”是指疾病，例如癌症或传染性疾病、自身免疫疾病、代谢疾病、炎症疾病、遗传和非遗传疾病。

在本发明的一个实施方式中，受试者的疾病状态包括癌症、感染性疾病、自身免疫疾病、炎症疾病、代谢疾病、遗传疾病、非遗传疾病。

在本发明的一个实施方式中，疾病状态包括从不可检测的至第四期的任何阶段的癌症。在本发明的一个实施方式中，癌症包括任何类型的癌症，例如实体和/或液体癌症。

在本发明的优选实施方式中，受试者的疾病状态是乳腺癌。

根据本发明，受试者可能是雄性或雌性受试者。在本发明的优选实施方式中，所述受试者是雌性受试者。

在根据本发明的一个方面的方法中，所述单细胞染色质状态已经丢失了促进抗药性的基因的染色质标记物。所述染色质标记物包括不同组蛋白修饰H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3。预期H3K4me3标记物允许基因不被永久沉默和使其在需要时被激活。预期H3K27me3标记物可使所述基因沉默。预期在基因增强子处的H3K27ac标记物促进基因激活。

在一个实施方式中，所述单细胞染色质状态已经丢失了可能导致抗药性的基因的染色质标记。染色质标记包括组蛋白修饰H3K4me3和H3K27me3。

如本文所用，“染色质标记物”、“基因的标记物”或“标记物”是指有助于在不同染色质状态内定义表观基因组特征的DNA和组蛋白修饰和/或变体，其高度指示细胞类型和组织身份。可以利用这些标记物的全基因组谱分析来了解基因组调控的全局景观，然后例如区分在正常和疾病细胞状态的背景下的表观基因组差异。技术人员知道如例如在(Consortium Epigenomics 2015，Nature 518(7539)：317-329)或其他研究中公开的若干染色质标记物。

在一个实施方式中，单细胞染色质状态已获得标记物，其中所述标记物具有去沉默作用。

如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”可互换地使用且涉及恶性肿瘤形成。恶性肿瘤形成的实例包括实体瘤和血液肿瘤。实体瘤由乳腺、膀胱、骨骼、脑、中枢和周围神经系统、结肠、内分泌腺(例如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头颈、肾脏、肝、肺、喉和下咽、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾脏、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤、输尿管、阴道和外阴的肿瘤示例。恶性肿瘤包括由视网膜母细胞瘤和威尔姆氏瘤(Wilms tumor)示例的遗传癌症。此外，恶性肿瘤包括所述器官中的原发性肿瘤和远处器官中的相应的继发性肿瘤(“肿瘤转移”)。血液肿瘤由白血病和淋巴瘤的侵袭性和惰性形式示例，即非霍奇金斯病、慢性和急性髓性白血病(CML/AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、霍奇金斯病、多发性骨髓瘤和T细胞淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合症、浆细胞肿瘤形成、副肿瘤综合症、原发部位未知的癌症以及与艾滋病相关的恶性肿瘤。

为了确定癌症已发展的程度，通常在诊断时的生长和扩散方面以第一至第四期对癌症进行标记。在第一期中，癌症局限于身体的一个部位且可通过手术切除。在第二和第三期中，癌症是局部晚期的且可通过化学疗法、放射或手术来治疗。在第四期中，癌症已经转移或扩散至其他器官且可通过化学疗法、放射或手术来治疗。(第五期仅用于受威尔姆氏肿瘤影响的患者，其中两个肾脏均受影响。)

如本文所用，“代谢疾病”包括但不限于代谢综合症X、先天性代谢错误、线粒体疾病、磷代谢紊乱、卟啉症、蛋白原代谢缺乏症、代谢性皮肤病、消耗性综合症、水-电解质失衡、代谢性大脑疾病、钙代谢紊乱、DNA修复-缺乏紊乱、铁代谢紊乱、脂质代谢紊乱、吸收不良综合征。

如本文所用，“自身免疫疾病”包括但不限于多发性硬化症，淀粉样变性病，强直性脊柱炎，抗GBM/抗TBM肾炎，抗磷脂综合征，自身免疫血管性水肿，自身免疫自主神经异常，自身免疫脑脊髓炎，自身免疫肝炎，结节性多发性动脉硬化，I、II、III型多腺体综合征，风湿性多肌痛，多发性肌炎，发作性睡病，坏疽性脓皮病，雷诺现象，间质性膀胱炎(IC)，青少年关节炎，青少年糖尿病(1型糖尿病)，青少年肌炎(JM)，反应性关节炎，新生儿狼疮，视神经脊髓炎，腹腔疾病，恰加斯病(Chagas disease)，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，孕激素性皮炎，牛皮癣，牛皮癣性关节炎，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)，横贯性脊髓炎，1型糖尿病，溃疡性结肠炎(UC)，慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss综合征(CSS)或嗜酸性肉芽肿病(EGPA)，嗜中性白血球减少症，眼瘢痕性天疱疮，视神经炎，回文型风湿症。

如本文所用，“遗传疾病”包括但不限于重症联合免疫缺陷(SCID)、镰状细胞病、皮肤癌、威尔逊病、特纳综合症(Turner syndrome)、脊髓性肌萎缩症、Tay-Sachs、地中海贫血、三甲基尿失禁、强直性肌营养不良症、神经纤维瘤病、努南(Noonan)综合征、痛性肥胖病(Dercum Disease)、唐氏综合症、Duane综合症、杜氏肌营养不良症(Duchenne MuscularDystrophy)、莱登第五因子血友病(Factor V Leiden Thrombophilia)、自闭症、常染色体显性多囊肾病、乳腺癌、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth)。

如本文所用，“炎症疾病”包括但不限于过敏、哮喘、自身免疫疾病、腹腔疾病、肾小球肾炎、肝炎、炎性肠病。

实施例

单细胞ChIP-seq程序的微流体工作流程

在图1中描绘了根据本发明的微流体方法的一般方案。(a)在45pl液滴中用细胞裂解和染色质片段化所需的试剂将细胞区室化。平行地，将带有DNA条形码的水凝胶珠粒与连接试剂和使微球菌核酸酶失活的EGTA一起包封于100p1液滴中。在融合设备中重新注入两种乳液，将包含条形码的液滴(100p1)和包含核小体的液滴(45p1)非对称地配对，并通过电场触发的电聚集来融合。用激光束对融合液滴进行一对一扫描以实时分析每个液滴的组成。(b)收集融合液滴的乳液，并在芯片外孵育，以用于在液滴中进行核小体条形码化。通过光切割从珠粒释放条形码并将其连接至核小体。合并液滴的内容物，进行免疫沉淀，并对富集的DNA进行测序。与条形码相关的读数的反卷积将所有序列归属于其原始细胞以重建单细胞染色质谱分析。

同步和暂停液滴中的染色质片段化

在45pl液滴中用包含裂解缓冲液和微球菌核酸酶的消化共混物将细胞区室化(参见图1)。在完全裂解之后，染色质被释放至液滴中，其可被微球菌核酸酶切割。本节介绍了液滴中微球菌核酸酶活性的典型校准以优先地产生具有核小体的尺寸的片段。然而，由于细胞是以不同时间尺度单独处理，因此在液滴中进行酶促测定可能具有挑战性。因此，微调酶活性以避免液滴和单细胞之间的染色质消化差异是必要的。

液滴中的细胞的区室化

每液滴细胞数量遵循泊松分布，其描述了发现每液滴x个细胞的平均数量λ的概率(Howard Shapiro，Practical Flow Cytometry，第4版，Wiley-Liss，2003)。在单细胞ChIP-seq实验中，调整细胞密度以在45pl液滴中包封λ＝0.1个细胞，从而导致90.5％的空液滴，9％包含一个单细胞的液滴，0.5％包含两个细胞的液滴和0.015％包含多于两个细胞的液滴。通过用钙黄绿素AM(钙黄绿素的非荧光衍生物)预先标记细胞来进行对液滴中的细胞的区室化的实时监控。在进入细胞之后，乙酰甲氧基(AM)被细胞内酯酶切割并释放出强烈的绿色荧光(激发/发射：495/515nm)。当液滴在检测点处穿过激光束时采集荧光，从而允许对包封的细胞的数量进行计数。

液滴收集

将液滴收集在冰上的收集管中直至包封结束(10分钟至20分钟，具体取决于起始细胞的数量)。包封后，将液滴在37℃下孵育用于微球菌核酸酶消化。

液滴中的微球菌核酸酶校准

在包封结束时，将液滴在芯片外孵育以用于单细胞染色质片段化。在液滴中裂解细胞，使它们的核DNA可用于微球菌核酸酶。该消化的动力学对于优先地产生保留在液滴中的单核小体特别重要。理想的孵育时间定义为将100％的核DNA片段化为单核小体所必需的时间。通过进行时程研究，精确校准每个样品的消化条件(包括裂解缓冲液组成、微球菌核酸酶浓度和孵育时间)。如下进行校准：生成包含细胞、缓冲液和微球菌核酸酶的45pl液滴，将其收集在收集管中，并将其在37℃下放置不同的孵育时间。在每个时间点，一定分数的液滴被破裂，并通过添加EGTA使微球菌核酸酶立即失活(参见图3)。然后纯化DNA片段并通过电泳对其进行分析。孵育时间的选择是在具有最高比例的单核小体但同时防止核小体DNA被过度消化之间的平衡。确实，假设是从核小体突出的DNA应该足够长以使得在该程序的后续步骤中能够进行条形码的有效连接。

控制液滴中的微球菌核酸酶活性

通过在细胞包封之后在冰上收集液滴来控制液滴中的微球菌核酸酶活性(参见图2)。确实，图2中的时间点t＝0分钟(其对应于液滴生产结束时但就在孵育之前所采集的一定分数的液滴)表明核DNA尚未被微球菌核酸酶消化。该证据确认了染色质消化不在液滴产生时发生，而是在37℃的孵育下立即开始(参见图2)。

在孵育之后以及在融合设备中重新注入时将液滴置于冰上可“暂停”微球菌核酸酶活性并限制染色质消化中的细胞间变化。为了这个目的，在12分钟的微球菌核酸酶孵育之后取两个液滴部分：一个部分被立即处理以控制消化，而第二部分被预先存于冰上1小时，然后进行类似处理。如预期的，图2上的时间点t＝12分钟和t＝12分钟+1小时冰确认了微球菌核酸酶在冰上存储的部分中不再具有活性(相比于t＝20分钟的时间点)。因此，将液滴存储在冰上“暂停”了微球菌核酸酶活性，从而防止液滴之间的染色质消化再次发生变化。

DNA条形码化策略

通过链霉亲和素-生物素连接和可光切割部分将DNA条形码接合至水凝胶珠粒，使得其在暴露于紫外线时能够从珠粒释放(Klein等，2015，Cell 161(5)：1187-1201)。条形码的合成包括将微珠分布于包含连接试剂和20bp寡核苷酸的96种组合(后称为索引1)的微孔板中。将索引1连接至珠粒并将其合并，之后再次分布于包含20bp寡核苷酸的96种新组合(后称为索引2)的第二微孔板中。通过重复此拆分-合并方法3次，轻松生成96³种可能的条形码组合的文库(即884,736种组合)。

条形码化水凝胶珠粒的质量控制

条形码化珠粒是scChIP-seq技术的核心试剂之一，其质量已得到系统地控制以确保细胞间变化是源自其组蛋白修饰模式中的真正生物差异，而不是技术伪像。

从珠粒释放的DNA条码的Tapestation谱分析显示，>75％是全长(146bp处的较大峰)，以及未能完整的中间体的存在(图5)。平均而言，全长条形码的数量被估计为每条形码化水凝胶珠粒5×10⁷个拷贝。

为了验证条形码从水凝胶珠粒的释放，将DNA探针与条形码杂交至珠粒上。然后将后者包封于100p1液滴中，并如scChIP-seq实验中那样芯片外收集。如Eyer(Eyer等，2017，Nature Biotechnology 35(10)：977-982)报道的，将部分液滴作为单一列队(singlefile)重新注入至测微室中，并通过辐射荧光显微镜对微珠成像，同时荧光条形码仍然结合在珠粒上。如预期的，荧光定位在珠粒上(参见图5)。将第二部分的包含珠粒的液滴暴露于紫外线以引发条形码释放。如上所述，在光切割之后的包含珠粒的液滴的辐射荧光显微显示了液滴中荧光的均匀分布，其表明完全的条形码释放(参见图5)。最后，对每一批新的条形码化珠粒进行单珠测序。通过在384孔板中进行有限稀释来分离珠粒。通过成像仅选择包含一个珠粒的孔以用于条形码的扩增和测序。测序数据的分析显示了16个珠粒的前两个最丰富的条形码的分数。识别出每珠粒数十万种不同的条形码，但平均而言，最丰富的条形码占测序读数的97.7％。第二丰富的条形码平均占读数的少至0.17％，这表明所有其他识别出的条形码是可忽略不计的(参见图5)。

条形码设计

条形码通过链霉亲和素-生物素连接与珠粒结合，其进而通过可光切割实体与寡核苷酸的5’端分开。后者包含可光切割基团和使空间相互作用最小化的烷基间隔基(整个实体被称为PC-接头，参见图4)。第一生物素化的和PC接头寡核苷酸是所有条形码共有的，并包含T7启动子序列和Illumina测序接头(SBS12序列)。T7启动子序列充当T7 RNA聚合酶的识别位点以在体外转录反应(IVT)中启动免疫沉淀后富集的条形码化核小体的线性扩增。在单细胞RNA-seq方案中的逆转录后的cDNA的无偏倚、灵敏和可再现扩增中广泛采用了这种扩增策略(Hashimshony等，2012，Cell Reports 2(3)：666-673)。在第二步中，Illumina测序接头充当PCR手柄以完成测序文库的制备。并且，此接头作为启动读数#2和对条形码序列的读取的引物对于样品的下一代测序而言是必需的。用该第一共有寡核苷酸接合的珠粒然后通过连续连接3个索引来用于条形码合成。不幸的是，对第一单细胞ChIP-seq数据集的分析显示，只有很少的读数(～38％)具有完整且正确的条形码结构。

在图3中描绘了优化的条形码结构，其允许消化条形码多联体以及减少非全长条形码的连接。条形码用Pac1限制性位点的一半框起来，其仅在形成多联体的情况下才被重建。那些在免疫沉淀之后但在线性扩增之前被消化以清理文库。通过引入3’C3间隔子修饰条形码光切割侧。该修饰在3’碱基的3’-羟基处引入间隔臂并阻断连接。随着间隔基的添加，连接的方向被强制为是从条形码的3’-端至核小体。非全长条形码用包含3’C3间隔子和5’反向二脱氧-T碱基的“嵌段”寡核苷酸序列来完整。再次地，两种修饰均目的在于限制不需要的连接事件。

条形码化珠粒在液滴中的包封

可以通过泊松分布来估计将离散物体(例如水凝胶珠粒)加载至液滴中。以与细胞的包封相同的方式，在液滴在检测点处穿过激光束时，实时监控珠粒的加载。在单细胞ChIP-seq实验中，其通常实现65％至75％的包含条形码化水凝胶珠的液滴。

包含核小体的液滴与包含条形码的液滴融合

将细胞和DNA条形码分别包封以防止条形码被微球菌核酸酶消化。为了在单细胞水平上对染色质进行索引化，必须在第二步中将DNA条码递送至包含核小体的液滴中。这是通过使用触发电场在专用微流体设备中主动融合两个液滴群体来实现的。

来自“细胞乳液”的液滴和来自“条形码乳液”的液滴作为单一列队重新注入微流体融合设备中。实现适当的电聚集需要将来自两种乳液的液滴一对一配对。水动力使更快的且较小的45pl液滴(“细胞乳液”)能够赶上100pl液滴(“条形码乳液”)并与其接触，因为接触对于两个液滴融合是必须的(Mazutis等，2009，Lab on a Chip 9(18)：2665)。与液滴产生相似，在融合液滴在检测点处穿过激光束时获得其荧光强度(参见图1)。

从单细胞ChIP-seg谱分析重建细胞类型特异性染色质状态

如图7所示，将人T淋巴细胞和人B淋巴细胞分别包封，并用两组不同的条形码来索引化。在液滴中对核小体进行条码化之后，将来自两种细胞类型的索引化染色质合并，进行染色质免疫沉淀并对文库进行测序

通过合并索引化染色质，避免了引入与测序文库的免疫沉淀或制备有关的偏倚(批次效应)。每个测序读数会携带双重信息：(1)单细胞条形码序列，其将读数分配给其起源细胞；(2)“细胞类型特异性序列”，其将读数分配给一种细胞类型(B或T淋巴细胞)。

为了确认条形码对于单个细胞是独特的，已经用小鼠和人细胞系的混合物进行了实验，其显示97％的条形码被毫无疑义地分配给单个物种，其与已占用的包含单个细胞的液滴的百分比(95％)一致，如图13所示。

已验证scChIP-seq程序从H3K4me3和H3K27me3修饰的单细胞分布重述细胞身份的效率和准确率。使用两组独立的条形码化接头分别处理人Ramos(B细胞)和Jurkat(T细胞)(如图1a-b所示)，并在液滴中连接接头之后，合并条形码化核小体并对其进行免疫沉淀。对于H3K4me3和H3K27me3组蛋白标记物，分别实现了每细胞1,630和1,633个独特读数的平均覆盖率，和跨技术和生物重复实验的高相关性(图14a-c，分别为r＝0.96和0.98，p<10-15)。

对于单细胞染色质谱分析实验两者，通过一致性聚类识别了对应于每个细胞系的两个稳定聚类(图15a和图16a)，将细胞身份与对H3K4me3和H3K27me3谱分析分别为超过99.7％和99.5％的特异性相匹配。聚集的单细胞谱分析以高准确率重述了成批ChIP-seq谱分析(图15b-c，对于H3K4me3和H3K27me3，分别为r＝0.93和0.97，p<10-15，图14f)。通过差异性分析识别了对Ramos和Jurkat细胞具有特异性的许可性和抑制性染色质特征(图16b)。聚焦于H3K4me3，其在转录起始位点附近积累，我们识别了多组协调的谱系特异性基因，如在对每个细胞系具有特异性的染色质特征中富集的(图16c)。这些结果确认，scChIP-seq程序是在单细胞水平上检测染色质景观，根据其染色质状态以高准确率对单细胞进行分类，并识别细胞群体之间的区别性染色质特征的稳健方法。

单细胞条形码和细胞类型特异性序列的反卷积

通过首先搜索在条形码的20聚索引之间发现的恒定4bp接头来从读数#2中提取条形码，从而允许每个接头中最多1个错配。如果识别了正确的接头，则提取三个散布的20聚索引并将其连接在一起以形成60bp的非冗余条形码序列。使用灵敏读数映射器Cushaw3，用3组96索引(96³)的所有884,736个组合的文库来映射条形码序列。每组索引都是错误修正的，因为将一个索引转换为另一个索引花费超过为3的编辑距离。因此，我们将在整个条形码中的总错配阈值设置为3，每索引为2或更少，以避免将序列错误分配给错误的条形码Id。在第二个较慢的步骤中，将不可以映射至Cushaw3索引文库的序列拆分成其个体索引，将每个索引与96个可能索引的集进行比较，从而允许每个个体索引中最多2个错配。未通过这两个步骤分配给条形码Id的任何序列都被丢弃。

以高达平均每细胞10,000个基因座的高覆盖率在单细胞水平上对组蛋白修饰进行谱分析会有助于揭示肿瘤样品内相对罕见的染色质状态的存在。预期该单细胞染色质谱分析成为探查任何复杂生物系统内染色质的异质性和动力学的作用的独特工具：除癌症外，其还可被应用于其他疾病和健康系统，尤其是研究细胞分化和发展用于患者分层。

根据本发明的方法可以用于揭示具有抗性癌细胞特有的染色质特征的罕见的细胞在治疗之前存在，并可通过癌症疗法对其进行选择。