具体实施方式

为了便于理解，下面将对本申请进行更全面的描述，并给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1式IV化合物的合成

取400g化合物II溶于0.5L无水THF中，N₂保护下小心分批加入1.58g Na，搅拌反应至钠块完全消失并无气泡产生后，将511.43g III充分溶解至800mL无水THF中并分批加入到反应体系中，反应搅拌过夜。

LC-MS和TLC检测II反应完全后，滴入稀盐酸溶液。浓缩有机溶剂至一般体积大小，混合物用500mL×2水洗两次，500mL饱和氯化钠水溶液洗一次。混合物用无水硫酸钠干燥并浓缩，粗品用硅胶拌样并柱层析纯化。以PE/EA＝5:1洗脱得中间产物IV。

实施例2式IV化合物的合成

取400g化合物II溶于0.5L无水THF中，N₂保护下小心分批加入1.58g Na，搅拌反应至钠块完全消失并无气泡产生后，将511.43g III充分溶解至800mL无水THF中并分批加入到反应体系中，反应搅拌过夜。

LC-MS和TLC检测II反应完全后，滴入稀盐酸溶液。浓缩有机溶剂至一般体积大小，混合物用500mL×2水洗两次，500mL饱和氯化钠水溶液洗一次。混合物用无水硫酸钠干燥并浓缩，粗品用硅胶拌样并柱层析纯化。以PE/EA＝5:1洗脱得中间产物IV。

实施例3式IV化合物的合成

取400g化合物II溶于0.5L无水THF中，N₂保护下小心分批加入56.22g四甲基氢氧化铵，搅拌反应至四甲基氢氧化铵完全消失后，将791.86g III充分溶解至800mL无水THF中并分批加入到反应体系中，反应搅拌过夜。

LC-MS和TLC检测II反应完全后，滴入稀盐酸溶液。浓缩有机溶剂至一般体积大小，混合物用500mL×2水洗两次，500mL饱和氯化钠水溶液洗一次。混合物用无水硫酸钠干燥并浓缩，粗品用硅胶拌样并柱层析纯化。以PE/EA＝5:1洗脱得中间产物IV。

实施例4式IV化合物的合成

取400g化合物II溶于0.5L无水THF中，N₂保护下小心分批加入18.76g四甲基氢氧化铵，搅拌反应至四甲基氢氧化铵完全消失后，将395.93g III充分溶解至800mL无水THF中并分批加入到反应体系中，反应搅拌过夜。

LC-MS和TLC检测II反应完全后，滴入稀盐酸溶液。浓缩有机溶剂至一般体积大小，混合物用500mL×2水洗两次，500mL饱和氯化钠水溶液洗一次。混合物用无水硫酸钠干燥并浓缩，粗品用硅胶拌样并柱层析纯化。以PE/EA＝5:1洗脱得中间产物IV。

实施例5式V化合物的合成

230g产物IV溶于230mLDCM中，加入350mL浓度为20％三氟乙酸，45℃回流3-4天。检测IV反应完后，混合物浓缩除去三氟乙酸。将浓缩液缓慢滴入-40℃的冰乙醚中，析出固体。将固体过滤并加入DCM溶解后滴入-40℃的冰乙醚中，重复4-5次。抽滤出的固体旋蒸除去残余溶剂，得产物V。

实施例6式V化合物的合成

230g产物IV溶于230mLDCM中，加入350mL浓度为50％三氟乙酸，45℃回流3-4天。检测IV反应完后，混合物浓缩除去三氟乙酸。将浓缩液缓慢滴入-40℃的冰乙醚中，析出固体。将固体过滤并加入DCM溶解后滴入-40℃的冰乙醚中，重复4-5次。抽滤出的固体旋蒸除去残余溶剂，得产物V。

实施例7式V化合物的合成

230g产物IV溶于230mLDCM中，加入350mL浓度为35％的三氟乙酸，45℃回流3-4天。检测IV反应完后，混合物浓缩除去三氟乙酸。将浓缩液缓慢滴入-40℃的冰乙醚中，析出固体。将固体过滤并加入DCM溶解后滴入-40℃的冰乙醚中，重复4-5次。抽滤出的固体旋蒸除去残余溶剂，得产物V。

实施例8式VI化合物合成

往100ml单口瓶中加入50ml二氯甲烷，依次加入化合物V(8.45g，2.5mmol)，DSC(1.29g,5mmol)，Et₃N(0.09g，0.9mmol)，反应物在30℃条件下反应搅拌12h。反应结束后(通过TLC监测反应是否完全)，减压旋蒸至小体积，将油状液体滴至搅拌中的冰石油醚中，生成白色颗粒固体。将固体过滤，所得滤饼溶解于少量二氯甲烷中，旋蒸除去异丙醇，继续将其在石油醚中沉降，所得固体过滤。将白色固体转移至500ml单口瓶中，常温下用减压旋蒸仪将残留的石油醚等溶剂蒸除，最终获得中间产品VI(11.04g,白色粉状固体)。收率：83％。

实施例9式VI化合物合成

往100ml单口瓶中加入50ml二氯甲烷，依次加入化合物V(8.45g，2.5mmol)，DSC(1.61g,6.25mmol)，Et₃N(0.09g，0.9mmol)，反应物在30℃条件下反应搅拌12h。反应结束后(通过TLC监测反应是否完全)，减压旋蒸至小体积，将油状液体滴至搅拌中的冰石油醚中，生成白色颗粒固体。将固体过滤，所得滤饼溶解于少量二氯甲烷中，旋蒸除去异丙醇，继续将其在石油醚中沉降，所得固体过滤。将白色固体转移至500ml单口瓶中，常温下用减压旋蒸仪将残留的石油醚等溶剂蒸除，最终获得中间产品VI(11.7g,白色粉状固体)。收率：88％。

实施例10式VI化合物合成

往100ml单口瓶中加入50ml二氯甲烷，依次加入化合物VI(8.45g，2.5mmol)，DSC(1.94g,7.5mmol)，Et₃N(0.09g，0.9mmol)，反应物在30℃条件下反应搅拌12h。反应结束后(通过TLC监测反应是否完全)，减压旋蒸至小体积，将油状液体滴至搅拌中的冰石油醚中，生成白色颗粒固体。将固体过滤，所得滤饼溶解于少量二氯甲烷中，旋蒸除去异丙醇，继续将其在石油醚中沉降，所得固体过滤。将白色固体转移至500ml单口瓶中，常温下用减压旋蒸仪将残留的石油醚等溶剂蒸除，最终获得中间产品VI(12.2g,白色粉状固体)。收率：91.76％。

实施例11式I化合物的合成

准确称量RGD(1.73g,5mmol)和SPA-PEG₄-SPA(5.32g,10mmol)加入到100mL PBS缓冲溶液中(PH＝7.2)，搅拌2小时后再向其中加入DOX(7.2g,12mmol)，室温避光反应48h直至反应结束,加入200ml二氯甲烷/甲醇(V/V＝5:1)萃取水相，有机相干燥后减压浓缩，粗品通柱层析层析纯化获得2.58g纯品I收率为43.15％。

实施例12式I化合物的合成

准确称量RGD(2.42g,7mmol)和SPA-PEG₄-SPA(5.32g,10mmol)加入到100mL PBS缓冲溶液中(PH＝7.6)，搅拌2小时后再向其中加入DOX(8.37g,14mmol)，室温避光反应48h直至反应结束,加入200ml二氯甲烷/甲醇(V/V＝5:1)萃取水相，有机相干燥后减压浓缩，粗品通柱层析层析纯化获得2.81g纯品I收率为47％。

实施例13式I化合物的合成

准确称量RGD(2.77g,8mmol)和SPA-PEG₄-SPA(5.32g,10mmol)加入到100mL PBS缓冲溶液中(PH＝8)，搅拌2小时后再向其中加入DOX(9g,15mmol)，室温避光反应48h直至反应结束,加入200ml二氯甲烷/甲醇(V/V＝5:1)萃取水相，有机相干燥后减压浓缩，粗品通柱层析层析纯化获得2.72g纯品I收率为45.5％。

实施例14DOX-PEG₄-RGD的MTT实验

本实施例是选取人乳腺癌细胞Bcap37、卵巢腺癌细胞SKOV3及肺癌细胞A549作为体外实验模型，以原药DOX为参照，采用MTT法测定PEG前药DOX-PEG₄-RGD的体外抗肿瘤活性。

因为肿瘤细胞对药物的摄取行为对其活性也存在十分重要的影响，为了更深入、直观地观察肿瘤细胞对PEG前药DOX-PEG₄-RGD的吸收，我们以Bcap37系作为体外实验模型，以原药DOX为参照物，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)来观察我们合成的前药DOX-PEG₄-RGD进入非耐药性癌细胞的途径。

(1)该实验采用以下实验仪器：

(2)该实验采用以下药品和试剂：

(3)阿霉素标准曲线的测定

如图1所示，我们以阿霉素标准溶液浓度为横坐标，其对应的OD值为纵坐标，绘出其紫外吸收标准曲线。可以看出在5.52×10^-7-6.44×10^-7mol/mL范围内线性关系良好,对其进行线性回归分析可得，其线性方程为Y＝7.15×X,X代表OD值，X代表DOX的标准溶液的浓度，其线性相关系数R¹为0.998。

(4)细胞培养

BCap37、SKOV₃及A549肿瘤细胞接种于35mm细胞培养瓶中，选用含10％小牛血清(FCS)、1％青链霉素溶液的RPMI 1640培养液，在5％CO₂相对湿度90％)、37℃的条件下培养待用。

(5)PEG前药的体外细胞毒性评价(MTT实验)

将我们合成的PEG前药DOX-PEG₄-RGD和DOX参比原药溶于PBS缓冲溶液中配成标准药液，利用前面的DOX标准曲线进行定量后待用。用0.25％的胰酶消化培养的上述细胞系并接种于96孔板中，密度为5×10⁷孔，培养过夜后；按照设定的浓度(0.001,0.01,0.1,0.5,1,5,10,100μg/mL的阿霉素当量浓度)加药并继续培养48h，离心去除培养液，用无菌PBS缓冲液洗孔板，重复三次后每孔加入新鲜不含药物的培养液继续培养24h；每孔加入无菌MTT溶液，继续培养4h，离心弃去含有MTT的培养液，用150μl/孔DMSO重新溶解紫色结晶，振荡10min后使用酶标仪于562nm下读取其OD值。最后，按以下公式计算细胞存活率和细胞生长抑制率，并绘制细胞存活率曲线图，利用IC₅₀计算器计算相应的IC₅₀。具体计算公式如下：

细胞存活率(％)＝(试验组OD值/空白对照组OD值)×100％

细胞生长抑制率(％)＝[1-(试验组OD值/空白对照组OD值)]×100％

前药DOX-PEG₄-RGD和DOX原药对Bcap37细胞、SKOV3细胞和A549细胞的MTT图，分别如图2、图3和图4所示。

由图2-图4可知，PEG前药DOX-PEG₄-RGD保留了DOX原药本身的高细胞毒性，且呈现出良好的剂量依赖性，即随着剂量逐渐增大，各种癌细胞的存活率也随之逐渐降低。图2-图4示的实验结果还表明，PEG前药DOX-PEG₄-RGD对肿瘤细胞的细胞毒性均要弱于DOX原药，具体差异详见IC₅₀值的比较(表1)。

表1

除了考察PEG前药DOX-PEG₄-RGD的细胞毒性的剂量依赖性，我们还考察了其毒性随时间的变化情况。如图5和图6所示，PEG前药DOX-PEG₄-RGD处理Bcap37和A549两肿瘤细胞株后，其72h的细胞毒性均较48h明显增强，提示药物作用时间越长，其体外抗肿瘤活性亦逐渐增强，即存在时间依赖性。

(6)PEG前药的体外细胞毒性评价(细胞形态观察)

本实验以人乳腺癌细胞Bcap37为观察对象，按照设定的浓度(0.1,1,10,l00μg/mL的阿霉素当量浓度)加完药后，培养48h，后用PBS缓冲液洗三次，再加入培养液继续培养24h，之后将培养皿置于光学显微镜下进行观察。结果如图7所示，可见细胞株的对照组细胞形态较均一，生长迅速。

如图8和图9所示，当使用浓度为l0ug/mL的DOX原药和阿霉素前药DOX分别处理Bcap37细胞72h后，可以观察到两实验组中大部分癌细胞的完整性均消失，视野中见大量的细胞碎片，提示经过药物处理后，大量Bcap37发生了细胞凋亡或坏死。表明PEG前药DOX-PEG4-RGD保留了DOX原药的高细胞毒性的特点，具有很强的体外细胞毒性。

实施例15DOX-PEG4-RGD的体内研究

在取得良好的体外实验结果之后，我们进一步对PEG前药DOX-PEG₄-RGD开展了体内研究。本实施例主要包括两部分：其一，以小鼠为实验动物，考察了阿霉素前药DOX-PEG₄-RGD的药代动力学性质；其二，建立和利用荷卵巢癌移植瘤的裸鼠实验模型，以肿瘤体积变化和裸鼠的体重变化为观察标准，结合组织病理学技术，同时观察了PEG前药DOX-PEG₄-RGD的体内生物安全性和抗肿瘤活性。

(1)实验仪器

(2)药品及试剂

(3)细胞培养及实验动物培养

将人乳腺癌细胞Bcap37接种到细胞培养瓶里面，选择1640完全培养液，在含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中开展培养以及传代过程。

(4)荷瘤裸鼠模型的建立

将实验裸鼠随机分成PBS组、DOX组和DOX-PEG₄-RGD组，每组裸鼠各4只。将培养好的乳腺癌细胞按照1x10⁶细胞/只，接种至6-8周的BALB/C裸鼠的右后背皮下，待肿瘤直径长至3-4mm时开始实验，BALB/C裸鼠模型如图10所示。

(5)实验药物的配制

本实验采用PBS(PH 7.4)缓冲溶液作为空白对照组。

DOX组药物的配制方法：精确称取盐酸阿霉素药物，先用少量纯净水溶解，后用预先配制好的PBS缓冲溶液(上述PBS缓冲液与灭菌纯净水按照1：1体积比均匀混合)进行稀释，配制成1mg/mL的DOX注射溶液,储备待用。

DOX-PEG₄-RGD组药物的配制方法：先称取一定量的PEG前药DOX-PEG₄-RGD，将其充分溶解于约0.5mL乙腈中，然后在避光以及剧烈搅拌的条件下，将上述乙腈溶液缓慢滴加至上述PBS缓冲溶液中(保证DOX-PEG4-RGD终浓度为1mg/mL左右)，整个滴加过程控制在2分钟内完成。待滴加结束后，在避光条件下继续剧烈搅拌10分钟，然后在真空减压状态下完全除去溶剂乙腈，获得澄清透明的紫红色溶液，然后通过已经标定的阿霉素的标准曲线来精确测定其精确的药物浓度，储备待用。

另一方面，为了比较DOX的溶解性区别，分别称取DOX各10mg充分溶解于1ml的PBS溶液中，通过光学显微镜观察样品的溶解情况，如图11所示，可以很清楚的发现，在同样溶解浓度下，DOX-PEG₄-RGD的PBS溶液中只有少部分未溶解的固体，而DOX的PBS溶液中却存在大量未溶解的固体，这充分表明，经过PEG修饰的DOX的溶解性获得了明显改善。

(6)PEG前药DOX-PEG₄-RGD的体内安全性及抗癌活性实验

待肿瘤直径生长至3-4mm的时候，以PBS注射溶液和DOX注射溶液分别作为阴性和阳性对照，考察DOX-PEG₄-RGD注射溶液的体内安全性和抗肿瘤活性。我们选用了5mg/kgDOX等效剂量，每4天经尾静脉给药一次，第一次给药记为第1天，共给药7次，同时记录动物的体重和肿瘤体积，观察裸鼠的反应和活动状态。根据测得的肿瘤体积和体重数据绘制抑瘤曲线和体重变化曲线，并且根据实验结束时每组动物肿瘤的体积计算治疗的抑瘤率(IRT,inhibitory rate of tumor)，肿瘤体积:V＝a×b²(a,肿瘤长径；b,肿瘤短径)。抑瘤率:IRT(％)＝100％×(m_c-m_e)/m_c。m_c和m_e为实验组和对照组的肿瘤平均重量)。

由图12可以明显看出，同PBS阴性对照组对比，PEG前药DOX-PEG₄-RGD与DOX组实验鼠肿瘤外观明显小很多，说明DOX表现出非常明显的抑瘤效果，实验结束后经过计算DOX的抑瘤率达到43％，而DOX-PEG₄-RGD的抑瘤率达到40％。虽然DOX原药阳性对照组的抑瘤效果较DOX-PEG₄-RGD有明显提高，但DOX原药阳性对照组的裸鼠体重发生了极其显著和迅速的降低，如图14所示，体重降低接近40％，而DOX-PEG₄-RGD实验组的裸鼠体重变化和PBS阴性对照组相比只呈现少量的下降。事实上，DOX对照组的裸鼠在给药5次后便因出现高度消瘦/衰竭状态，90％裸鼠死亡而不得不终止实验。这些结果表明PEG前药DOX-PEG₄-RGD体内毒副作用较DOX原药显著减低，安全性明显提高，同时保留了理想的抑瘤活性。作为一种新型前体药物，PEG前药DOX-PEG₄-RGD的体内安全剂量范围较DOX原药将有显著改善，即阿霉素前药DOX-PEG₄-RGD具有体内高效抗肿瘤和低毒副作用的优点。

(7)移植瘤及心脏的组织病理学研究

为了更加深入比较并评价DOX原药及PEG前药DOX-PEG₄-RGD的体内安全性和抑瘤作用，我们将各个组别实验裸鼠的心脏以及肿瘤组织进行固定，并且对其切片进行组织病理学观察。如图15所示，PBS组心脏均没有明显病变，心肌纤维排列较为整齐，未发现心肌纤维断裂，无肥厚或者萎缩，细胞质均匀丰富，没有水肿，没有炎症细胞浸润，细胞膜没有增厚。对比PBS、DOX和DOX-PEG₄-RGD组的心脏组织切片可以发现，与PBS组相比，DOX组小鼠心肌组织表现为显著的心肌细胞肥大、肌细胞排列紊乱和明显的炎性细胞浸润，存在严重的间质纤维化，出现明显的心衰组织病理学特征。DOX-PEG₄-RGD治疗组小鼠与DOX组相比，无显著的心肌结构重构表现，心肌细胞排列相对规则，未见较多明显的心肌细胞肥大或者炎性浸润。PBS和DOX-PEG₄-RGD组两组的心脏组织切片极其相似，这表明即使连续7次对动物处理高达每次5mg/kg DOX当量的PEG前药DOX-PEG₄-RGD，其仍没有显示出强的心脏毒性，这与之前该组实验动物状态良好以及体重变化未出现异常的结果相一致。

对肿瘤组织切片进行H&E染色后能够观察到，如图16所示，DOX原药和阿霉素前药DOX-PEG₄-RGD实验组肿瘤组织的癌细胞绝大多数呈现出典型的细胞凋亡形态，例如细胞密度明显降低、细胞质消失、胞桨空泡化、核染色质皱缩或者碎裂等，而这些特征性变化在DOX-PEG₄-RGD组较DOX组更加明显。这些实验结果进一步表明PEG前药DOX-PEG₄-RGD不但体内安全性较DOX原药有显著改善，安全剂量相较DOX原药也大幅度提高,其抑瘤效果也极其理想。

以上所述实施例仅表达了本申请的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。