具体实施方式

本发明涉及一种包含曲贝德生及IL-2的抗癌用配合组合物。本发明的组合物尤其对实体癌(例如乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌或直肠癌等)的治疗有用。

本发明的组合物在给药时，曲贝德生及IL-2可以以依次或同时给药或个别给药的方法联合给药。因此，本发明的组合物在给药时，各成分在生物体内以治疗学上有效剂量同时存在，表现出彼此协同效应。

在本发明另一方面，本发明涉及一种含有曲贝德生、用于与IL-2联合给药的抗癌用组合物。这种本发明的组合物尤其对实体癌(例如乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌或直肠癌等)的治疗有用。

在本发明又一方面，本发明涉及一种含有IL-2、用于与曲贝德生联合给药的抗癌用组合物。本发明的组合物尤其对实体癌(例如乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌或直肠癌等)的治疗有用。

下面根据实施例，详细说明本发明。不过，以下实施例只用于对本发明举例，并非本发明的思想或范围限定于此。

为了确认本发明的组合物的抗癌效果，在小鼠实体癌模型中实施了作为TGF-β2抑制剂的曲贝德生与IL-2联合使用的体外(in-vitro)抗癌效果实验。例如，在多样的实体癌细胞株中确认TGF-βmRNA表达量，在他们中确认了曲贝德生单独处理及与以IL-2激活免疫细胞(activation)的PBMC(外周血单核细胞：peripheral blood mononuclear cell)联合处理下的癌细胞凋亡效果。另外，在加入人PBMC而实现人源化的免疫缺陷小鼠中，确认了曲贝德生与IL-2联合使用的人癌细胞(xenograft model)的生长抑制效果。

实验例1：以多样癌为对象的TGF-β2mRNA level定量及相对定性分析

1)TGF-β2mRNA表达分析

使用如下表1所示的细胞株进行实验。

[表1]

使用RNA prep kit(德国凯杰公司)从上表1的各细胞株1x10⁷个中提取(preparation)RNA，然后，以提取的RNA 1μg为模版，在37℃下，在1小时期间合成cDNA。

利用TGF-β2特异性引物(specific primer)F(ATCGATGGCACCTCCACATATG)及R(GCGAAGGCAGCAATTATGCTG)，执行对cDNA 10μl的PCR(变性95℃1分钟、退火57℃1分钟、延伸72℃1分钟、35周期及最终延伸72℃5分钟)。然后，与对GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase：3-磷酸甘油醛脱氢酶)的PCR结果对比，确认了利用TGF-β1及TGF-β2谱带强度的TGF-β1及TGF-β2的mRNA表达。

图1至图3图示了TGF-β1或TGF-β2mRNA的相对定性分析及定量分析结果。

实验结果可知，在皮肤癌细胞、肺癌细胞、乳房癌细胞中，TGF-βmRNA表达相对较多。

实验例2：多样实体癌细胞株中曲贝德生单独处理的细胞凋亡效果

在多样实体癌细胞株中，确认了曲贝德生单独处理的细胞凋亡效果。

1)细胞培养

如上表1所示，根据细胞类型，使用了RPMI1640(10％FBS，抗菌-抗真菌剂，HEPES)、DMEM(10％FBS，抗菌-抗真菌剂)等培养基，细胞在37℃、CO₂ 5％环境下培养。

2)曲贝德生转染(transfection)

将表1记载的各细胞株如下表2所示进行接种(seeding)后，在37C、5％CO₂条件下培养24小时，转染了曲贝德生。

具体的转染方法如下：

将曲贝德生在无血清培养液(Serum free media)(培养液A：RPMI 1640或DMEM)中稀释，使得在最终制备的培养液(即，包含以下说明的培养液A、培养液B及细胞培养液的培养液)中，分别达到20nM、40nM、80nM及160nM的浓度。

将脂质体(Lipofectamine)2000既定量添加于无血清培养液(培养液B：RPMI 1640或DMEM)，使得成为下表2所示实验条件。

使培养液A及培养液B分别在常温下反应5分钟后，按12孔板基准，将培养液A 50ul与培养液B 50ul(1:1体积比)混合，再在常温下反应20分钟。

将所述“1)细胞培养”步骤中准备的细胞的培养液更换为新的10％FBS培养液后，将结束反应的培养液A及B的混合物加入于细胞培养液。

[表2]

3)细胞毒性分析(Cytotoxicity Assay)

为了细胞毒性分析，进行曲贝德生转染后第二天，利用EZCYTOX(DAEILLAB服务公司)，以O.D 450nm值测量了细胞的活性度，通过Annexin V及PI染色，利用FACS(Fluorescence activated cell sorter：荧光激活细胞分类器)，进行了细胞凋亡(Apoptosis)/坏死(Necrosis)分析。

图4至图8是利用EZCYTOX分析曲贝德生单独处理在癌细胞株中的生长抑制的结果。可知，借助于曲贝德生给药，癌细胞株的活性被抑制。不过，在Capan-2及SK-MEL-28细胞株中，观察到细胞凋亡不大。

实验例3：乳房癌细胞株中以IL-2激活的人PBMC与曲贝德生联合使用的细胞凋亡效果试验

1)IL-2激活

利用ficoll-plaque plus(购自通用电气医疗集团)分离外周血液的PBMC(外周血单核细胞：peripheral blood mononuclear cell)后，在添加了10％FBS、IL-2(20ng/ml)的培养液中按4x10⁶/ml浓度培养，第五天利用FACS在CD4+/CD8+T cell中确认了CD69(T cellactivation marker：T细胞激活标记)的表达。

2)IL-2及曲贝德生联合给药分析

如上所述，利用ficoll-plaque plus(通用电气医疗集团)分离外周血液的PBMC后，在添加10％FBS、IL-2(20ng/ml)的培养液中，按4x10⁶/ml浓度培养。在培养第三天，将曲贝德生转染(transfection)于癌细胞后，24小时后，将目标癌细胞的培养液更换为10％FBS培养液，在IL-2培养第五天，将PBMC按癌细胞株(seeding)：效应器(免疫效应细胞)＝1：10比率(细胞数比率)置于10％FBS RPMI media 2ml后，添加于孔板进行培养。

非激活PBMC另行利用聚蔗糖分离，用作对照组。另外，不加入任何PBMC的细胞株也用作对照组。曲贝德生在转染时变化培养液中的浓度(即，分别针对0nM、10nM、40nM浓度)进行了实验。

在24小时后，通过PI染色分析了细胞毒性(cytotoxicity)结果。

实验例4：胰脏癌细胞株中以IL-2激活的人PBMC与曲贝德生联合使用的细胞凋亡效果试验

以与实验例3类似的方法，对胰脏癌细胞株(AsPC-1)实施了实验。

实验例5：黑色素瘤细胞株中以IL-2激活的人PBMC与曲贝德生联合使用的细胞凋亡效果实验

以与实验例3类似的方法，针对黑色素瘤细胞株(Hs 294T)实施了实验。

实验例6：肺癌细胞株中以IL-2激活的人PBMC与曲贝德生联合使用的细胞凋亡效果实验

以与实验例3类似的方法，对肺癌细胞株(A549)实施了实验。

实验例7：直肠癌细胞株中以IL-2激活的人PBMC与曲贝德生联合使用的细胞凋亡效果实验

以与实验例3类似的方法，对直肠癌细胞株(HT29、DLD-1、LS174T)实施了实验。

将实验例3至7的实验结果图示于图9至图13。如图所示，可知曲贝德生与IL-2联合给药组(IL-2activated PBMC)相比曲贝德生单独给药组(非激活PBMC及DMEM或RPMI)或IL-2单独给药组(IL-2activated PBMC、曲贝德生0nM)，细胞凋亡效果极大增加。

实验例8：(体内试验)三阴性乳房癌细胞株中以人PBMC人源化的免疫缺陷小鼠(NSG mouse)中IL-2与曲贝德生联合使用的癌生长抑制效果试验

在对NSG(NOD/SCID/Gamma)免疫缺陷小鼠注入人PBMC而实现人源化的小鼠中，实施了用于确认人三阴性乳腺癌(TNBC：triple negative breast cancer)细胞株MDA-MB-231的生长在曲贝德生单独给药时、IL-2单独给药时及曲贝德生与IL-2联合给药时分别受到何种影响的实验

实验方法

准备了冻结干燥的粉末形态的曲贝德生(TBD)及液剂形态的基因重组人IL-2(rhIL-2，韩国JW CreaGene；Cat.No.JW-H031-0025)。曲贝德生的保管条件为2～8℃，基因重组人IL-2的保管条件为-80℃。

将曲贝德生溶解于灭菌生理盐水使用。基因重组人IL-2将浓度25μg/250μl(2x10⁸IU/mg)溶液在临给药前稀释使用。

将NSG小鼠分成10组，每组6只，按下表3的用量，进行腹腔内给药(IP)。

[表3]

异种移植模型制作

使MDA-MB-231细胞在37℃5％CO₂培养环境下增殖。使用了包含10％FBS的RPMI1640(包括左旋谷酰胺、25mM HEPES)培养基，当细胞占25T烧瓶表面的70～80％时，按1:5比率进行转种培养。

在肿瘤移植日，将所述培养的肿瘤细胞按1×10⁷细胞/100μl悬浮于PBS，按1×10⁷细胞/小鼠，在小鼠右肋(flank)部位皮下移植100μl。

人-PBMC(Hu-PBMC)NSG小鼠模型制作

将人PBMC在37℃水槽(water bath)中解冻(thawing)，利用包含20％FBS的RPMI1640(含DNAse I)，进行2次清洗(washing)，在37℃、5％CO₂培养环境下稳定30分钟。

培养30分钟后，将PBMC在PBS中稀释为5×10⁷至10×10⁷细胞/ml的浓度后，1只小鼠按1×10⁷细胞/只的用量给药(癌细胞给药后第三天进行PBMC给药)。

给药方法

针对如上所述进行PBMC给药的小鼠，在PBMC给药后第二天(癌细胞移植后第五天)，按表3的用量，按1次/2日间隔，将曲贝德生进行腹腔内给药共8次，在PBMC给药后第四天(癌细胞移植后第七天)，按表3的用量，按1次/1日间隔，将IL-2给药4天后停药3天，以此为一个周期，共腹腔内给药两个周期。

接种、PBMC给药、曲贝德生给药及IL-2给药日程如下：

肿瘤体积(Tumor Volume)测量

从曲贝德生及/或IL-2给药后起，按1次/2日测量了肿瘤体积。即，肿瘤体积自肿瘤接种(0天)后第5天起，按1次/2日测量。肿瘤体积利用卡尺(Caliper：CD-15CPX，数显卡尺，日本三丰公司)，测量了在注入部分产生的癌细胞块的大小，按下述数学式计算了体积：

[数学式]

肿瘤体积(TV：mm³)＝(W²×L)/2

在上式中，W为短轴长度，L为长轴长度。

所述实验结果可知，与只单独给药曲贝德生或只单独给药IL-2相比，曲贝德生及IL-2联合给药时，协同发挥癌细胞的生长抑制效果(参照图14及图15)。

工业实用性

本发明的抗癌配合组合物可以用于抗癌给药。