阅读说明：本技术 齐墩果酸及其衍生物在制备促进骨折愈合的药物中的应用 (Application of oleanolic acid and derivatives thereof in preparation of medicines for promoting fracture healing ) 是由 舒冰 董玉峰 王拥军 杨骏杰 赵永见 张岩 赵东峰 王晶 张�浩 程韶 张伟强 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及齐墩果酸及其衍生物的医药用途,具体公开了齐墩果酸及其衍生物在制备促进骨折和/或骨质疏松性骨折愈合的药物中的应用。本发明确证不同浓度齐墩果酸及其衍生物的局部干预,具有促进骨形成和提升骨量的作用,可以显著促进骨折部位的愈合和修复,且高剂量齐墩果酸及其衍生物也无明显肝肾毒性。本发明可用于医学和兽医学应用,使用途径包括注射、缓释技术或者支架材料中复合齐墩果酸及其衍生物等局部给药方式,亦可与其它补充活性成分、试剂、药物或激素一起施用。(The invention relates to medical application of oleanolic acid and derivatives thereof, and particularly discloses application of oleanolic acid and derivatives thereof in preparation of a medicine for promoting fracture and/or osteoporotic fracture healing. The invention confirms the local intervention of oleanolic acid and derivatives thereof with different concentrations, has the effects of promoting bone formation and bone mass, can obviously promote the healing and repair of fracture parts, and has no obvious hepatotoxicity or hepatotoxicity due to high dose of oleanolic acid and derivatives thereof. The invention can be used for medical and veterinary applications, and the application route comprises local administration modes of injection, slow release technology or composite oleanolic acid and derivatives thereof in stent materials, and the like, and can also be used together with other supplementary active ingredients, reagents, medicaments or hormones.)

齐墩果酸及其衍生物在制备促进骨折愈合的药物中的应用

技术领域

本发明涉及齐墩果酸及其衍生物的医药用途，具体涉及齐墩果酸及其衍生物的局部给药，作为各种原因造成的骨折修复的局部治疗方法的应用。

背景技术

骨折属于非常常见的临床疾病，鉴于骨组织特点，愈合时间较长，长期卧床静养及制动，会导致肌肉萎缩、静脉血栓、坠积性肺炎等并发症的发生，这种情况在老年人尤其突出；更严重的是，由于老年、绝经、肾功能不全、肠道疾病等基础性疾病和多种因素的影响，常常会导致骨折愈合和修复延迟，从而显著延长了整个病程，造成并发症发生率大大增加，对患有其他严重基础疾病的老年患者甚至有致命的危险。治疗方面，目前主要是手术治疗，老年患者及患有其他严重基础疾病的患者甚至不能接受手术，药物治疗也主要是针对其基础疾病，而能够促进骨折部位愈合和修复的药物却较为少见。因此，临床上迫切需要开发能够促进骨折愈合和修复的药物，从而缩短疗程，减少并发症。

目前关于齐墩果酸及其衍生物促进骨折愈合的作用则未见研究报道。

发明内容

本发明的主要目的是开发能够促进骨折愈合的药物，从而缩短疗程，减少并发症，进而提供一种能有效促进骨折愈合的治疗方法。

为了实现这个目标，本发明人进行了相关研究，发现齐墩果酸及其衍生物局部给药可以有效促进骨折愈合，这种功效可以用于治疗各种原因造成的骨折和/或骨质疏松性骨折。

本发明所述的齐墩果酸为式(I)所示的化合物。

本发明所述齐墩果酸衍生物是引入羧基、羟基和双键等功能基团，式(IV)中具有下述分子结构的齐墩果酸衍生物A-H：

A:11位C＝O，12、13位双键；

B:11位羟基，12、13位分别为CH₂；

C:11、12位双键，13、18位双键；

D:11位CH₂，12位C＝O，13位>CH；

E:11位CH₂，12位羟基；

F:9、11位双键，12位C＝O；

G:9、11位双键，12位CH₂，13位>CH；

H:11，12位分别为CH₂，13位>CH。

本发明的再一个目的是提供齐墩果酸及其衍生物在促进骨折和/或骨质疏松性骨折愈合的应用方式。

本发明基于发现齐墩果酸及其衍生物可以促进骨折愈合。齐墩果酸及其衍生物中任意一种作为药物干预，与药学上可接受、适合医药用途的赋形剂与/或载体结合，制成医学和兽医学应用的药物；采用局部给药，包括局部注射、各种局部缓释技术、或支架材料中复合齐墩果酸或其衍生物；齐墩果酸及其衍生物的局部干预的浓度为5μM-20μM。

附图说明

图1为齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后14天肾脏HE染色图。图1显示，齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后，小鼠肾脏未发现明显组织结构异常。

图2为齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后14天肝脏HE染色图。图2显示，齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后，小鼠肝脏未发现明显组织结构异常。

图3为齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预14天后腰椎部位三维重建图。图3显示，模型组腰椎骨量下降，提示骨质疏松模型成功建立，齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后，各组腰椎骨量上升。

图4为齐墩果酸及其衍生物A-G局部干预14天后骨折部位三维重建图。图4显示，模型组骨折部位骨皮质不连续，仍存在明显骨折线，齐墩果酸及其衍生物A-G干预14天后，绝大部分干预组骨折部位骨皮质连续，骨修复显著加快。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。

本发明以下实施例中，未特别标示的实验方法，即HE染色和MiCT骨扫描为本领域通用的实验方法。

实施例

1、小鼠骨质疏松性骨折模型的制备：

小鼠置入连接呼吸麻醉机的密闭盒，启动麻醉机，待小鼠麻醉后将小鼠头部塞入麻醉机的面罩接口，小鼠取俯卧位，定位小鼠双侧髂后上棘，以后方髂骨上约1cm，脊柱旁约1cm处为中心备皮并消毒。以后方髂嵴上约1cm，以脊柱为中心切纵行切口，长约2cm，切开皮肤、钝性分离皮下，选取双侧脊柱旁1cm处肌层，取纵行切口0.5cm，暴露双侧卵巢(外形为红色菜花状，可见表面有不规则结节状卵泡)。用镊子提起卵巢及输卵管，并用丝线结扎周围组织及部分输卵管，切除卵巢。回纳组织后缝合切口及皮肤。假手术组操作与去卵巢组相同，只是不进行结扎，不切除卵巢。缝合伤口后用金霉素眼膏涂于伤口防止感染。

小鼠置入连接呼吸麻醉机的密闭盒，启动麻醉机，待小鼠麻醉后将小鼠头部塞入麻醉机的面罩接口，将小鼠左后肢备皮。取左小腿外侧纵行切口，约2cm，分离皮肤、皮下组织及筋膜，暴露胫骨中段；同时在膝关节外侧开一小口，约2mm，显露髌骨及髌韧带。用1ml注射器针头于胫骨平台偏前方沿胫骨长轴打入约1.5cm长度，稍退回针头后用咬骨钳剪断针头，用眼科剪剪断胫骨中段，插入针头进行髓内固定，缝合切开的肌肉、皮下组织和皮肤。

2、药物配制及干预

采用0.5％硝酸纤维素钠溶液制备5μM-20μM齐墩果酸及其衍生物A-G悬浮液。取100μl注入微型渗透泵，局部缓释1.1μl/hr。加手术组和模型组微型渗透泵内仅注入100μl的0.5％硝酸纤维素钠溶液。

取左小腿外侧纵行切口，约2cm，分离皮肤、皮下组织及筋膜，暴露胫骨中段(以上步骤可在骨折模型造模时一起操作)。沿胫骨插入输药管释出端，使输药管释出口抵达缓释部位。另在小鼠左侧肋骨下缘切开表皮，制备一0.6cm左右的横行切口，用血管钳由切口处皮下沿肋骨向脊柱方向钝性分离皮下筋膜，撑出一个1.5*0.8cm左右胶囊大小的空间。在渗透泵中注满100ul溶液，将泵植入制备的皮下空间。输药管输入端通过50ml注射针头向释药棒方向穿刺，裁剪输药管输入端以达合适长度，并与释药棒连接。清洁切口后迅速缝合切口。

3、实验结果

3.1肝、肾毒性检验

齐墩果酸及其衍生物A、B局部(20μM)干预14天后，处死小鼠，取小鼠肾脏和肝脏，制备冰冻切片，进行HE(苏木精和伊红)染色。显示齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后，小鼠肾脏和肝脏未发现明显组织结构异常，本发明没有明显不良反应和毒性(如图1、2所示)。

3.2骨组织三维重建

齐墩果酸及其衍生物A-H局部(5μM-20μM)干预14天，处死小鼠，取小鼠腰椎和损伤胫骨，经10％中性福尔马林固定后，进行miCT扫描和骨三维重建。结果显示模型组腰椎骨量下降，提示骨质疏松模型成功建立，齐墩果酸及其衍生物A、B局部干预后，各组腰椎骨量上升(如图3所示)。

骨折胫骨三维重建也发现该方法可以加速小鼠骨折部位的羽翮愈合(如图4所示)：模型组骨折部位骨皮质不连续，仍存在明显骨折线，齐墩果酸及其衍生物A-H干预14天后，绝大部分干预组骨折部位骨皮质连续，骨修复显著加快。