具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及式I所示的化合物：

上述化合物可作为甲基苯丙胺的半抗原使用，该半抗原最大程度保留了甲基苯丙胺的官能团的结构特征，经此半抗原制备得到的甲基苯丙胺人工抗原能够发挥出最佳的构效优势，从而得到特异性强、灵敏度更高的抗体。

术语“半抗原”是指部分或不完全抗原。半抗原是不能刺激抗体形成但与抗体反应的无蛋白质的物质。

本发明还涉及一种甲基苯丙胺人工抗原，其为如上所述的化合物与免疫原性载体的偶联物。

在一些实施方式中，所述的甲基苯丙胺人工抗原具有式II所示的化学式：

本文使用的“免疫原性载体”是免疫原性物质，通常为蛋白质，其能够在一个或多个位置处与半抗原接合，从而使得能够产生可与这些半抗原结合的抗体。免疫原性载体物质的示例包括但不限于被认定为是外来的并从而引发宿主免疫应答的蛋白质、糖蛋白、复合聚氨基多糖、颗粒以及核酸。聚氨基多糖可使用已知用于此制备的任何常规方法由多糖进行制备。

各种蛋白质类型可以用作免疫原性载体，在一些优选的实施方式中，所述载体蛋白选自钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、乳铁蛋白、辣根过氧化物酶、甲状腺球蛋白、免疫球蛋白、激素(例如胰岛素)以及卵清蛋白中的至少一种。

免疫原性载体还可包括聚氨基多糖，这些聚氨基多糖是通过单糖的重复缩合而构建成的高分子量聚合物。多糖的示例为淀粉、糖原、纤维素、碳水化合物、树胶诸如阿拉伯树胶、琼脂等。多糖还包含聚(氨基酸)残基和/或脂质残基。

免疫原性载体还可以为单独的或缀合至上述聚(氨基酸)或多糖中的一个的聚(核酸)。

免疫原性载体还可包括固体颗粒。颗粒的直径通常为至少约0.02微米(μm) 且不超过约100μm，并且通常为约0.05μm至10μm。颗粒可以为有机或无机的、溶胀性的或非溶胀性的、多孔的或无孔的，最佳为接近于水的密度，一般为约 0.7至1.5g/mL，并且由可为透明的、部分透明的或不透明的材料构成。颗粒可以为生物材料，诸如细胞和微生物，包括非限制性的示例诸如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)和病毒。颗粒也可包含有机和无机聚合物、脂质体、胶乳、磷脂囊泡或脂蛋白。

本发明还提供抗体，其由如上所述的甲基苯丙胺人工抗原免疫得到。

术语“抗体”是指能够结合抗原或其部分(根据本发明，能够结合至抗精神病药物或其代谢物)的特异性蛋白质。抗体是响应于通过注射被引入到宿主，例如动物或人体内的免疫原而产生的。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是他们的抗体片段。

“抗体”是指完整的抗体或其与完整的抗体竞争结合的片段。一般来讲，当解离常数小于或等于1μM，优选地小于或等于100nM且最优选地小于或等于10nM 时，抗体可以称为是特异地结合抗原。抗体片段包含完整抗体的一部分，优选地，完整抗体的抗原结合区或可变区。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv 片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。“双特异性”或“双功能”抗体之外的抗体应理解为它的每一个结合位点是相同的。

可以通过各种本领域普通技术人员已知的技术的任意一种制备抗体。在一种这样的技术中，包含甲基苯丙胺人工抗原的免疫原起初注射进任何哺乳动物的各种品种(例如，小鼠，大鼠，兔，绵羊以及山羊)。甲基苯丙胺人工抗原也可以联合免疫佐剂(如福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂)将免疫原注射进动物宿主；更优选地是按照多次加强免疫的预定方案注射，并且周期性地使动物放血。然后，对多肽特异性的抗体可以通过例如使用连接到合适的固相支持物上的多肽的亲和层析从血清等成分中纯化出来。

可通过Kohler和Milstein完整建立的杂交瘤方法，例如Nature256:495-497(1975)，来产生单克隆抗体。杂交瘤方法通常涉及免疫宿主或来自宿主的淋巴细胞，收获分泌淋巴细胞或具有分泌淋巴细胞的潜能的单克隆抗体，将淋巴细胞与永生化的细胞融合，并且选择分泌所期望的单克隆抗体的细胞。

可将淋巴细胞与永生化的细胞系融合以形成杂交瘤细胞，融合剂例如聚乙二醇的使用可有利于此过程。通过例证的方式，可使用通过转化而永生化的突变型啮齿动物、牛或人骨髓瘤细胞。与未融合的永生化细胞相反，基本上纯的杂交瘤细胞的群体是优选的。因此，在融合后，可使细胞在合适的培养基中生长，该培养基例如通过使用缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的突变型骨髓瘤细胞，抑制未融合的永生化细胞的生长或存活。在此类实例中，可将次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷加入培养基(HAT培养基)，以在允许杂交瘤生长的同时阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

本发明还涉及含有如上所述抗体的甲基苯丙胺检测试剂盒。

在一些实施方式中，所述试剂盒还含有偶联有信号物质的甲基苯丙胺或权利要求1所述的化合物、固相载体、反应缓冲液、封闭液、洗涤液(如PBS等)、阳性对照刺激物以及阴性对照中的一种或多种试剂盒还含有如上所述的化合物、固相载体、反应缓冲液、封闭液、洗涤液(如PBS等)、甲基苯丙胺标准品以及阴性对照中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述试剂盒还含有针对信号物质的显色试剂(如信号物质为辣根过氧化物酶，则显色试剂为TMB显色液或ECL)。

在一些实施方式中，所述抗体固定包被于所述固相载体上。

在一些实施方式中，所述固相载体选自试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔或微球。

在本发明中，术语“微粒”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、 500μm；优选为400nm～10μm。

微粒优选为磁微粒，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。

多孔板优选为酶标板，其含有的孔位可以为8、16、32、48、64、96或更多。

在一些实施方式中，所述信号物质选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。

下面非限定部分列出这些标记：

·产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

·发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物(例如吖啶酯)和染料。

·具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。

·可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。

·电子致密物质，如放射性分子(如³²P，³⁵S或¹²⁵I)。

本发明还涉及如上所述的抗体或如上所述的试剂盒在检测甲基苯丙胺中的应用。

在一些实施方式中，待检测的样本是血液、血清、血浆、抗凝血、细胞培养上清、唾液、精液、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、粪便标本、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液。优选的样本为血液、尿液或毛发。

本发明的抗体及酶联免疫检测方法可用于毛发中甲基苯丙胺残留的特异性检测，方法对于甲基苯丙胺的IC₅₀＝1.00ng/mL，线性检测范围(IC₂₀-IC₈₀)为 0.22-4.46ng/mL，检测限(IC₁₀)为0.13ng/mL，与苯丙胺的交叉反应率为4.2％。所述抗体具有灵敏度高，准确性好，样品前处理方法简单快速等显著优势，因此本发明提供的抗原和抗体，可用于建立甲基苯丙胺的酶联免疫检测方法。该法稳定可靠，且成本较低，对于甲基苯丙胺快速检测试剂盒、胶体金试纸条的研发有重要意义。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1半抗原的制备

S1.取70mg甲基苯丙胺与101.9mg溴丙酸乙酯置于25mL三口圆底烧瓶中，加入乙腈15mL搅拌溶解，通入氮气保护，依次加入62.3mg KI、12.4mg催化剂18-冠-6、77.8mg碳酸钾，升温回流反应24h，TLC跟踪检测。反应完毕，减压除去溶剂，加入冰水10mL搅拌溶解，用乙酸乙酯30mL分萃取3次，合并有机相，盐水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥4h。过滤收集母液，回收溶剂得黄色油状物MET-1，用硅胶柱纯化(甲醇/三氯甲烷，1：15，V/V)， -20℃保存备用。

反应式1：

S2.将50mg MET-1与23.9mg苯丙胺溶于乙腈中，加入23.1mg无水碳酸钾，70℃回流6h，用TLC检测。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂后，用乙酸乙酯/饱和食盐水萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥4h。过滤收集母液后减压旋蒸，MET-2粗产品用硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷，1：15，V/V)。

反应式2：

S3.取50mg MET-2与19.7mg丁二酸酐溶于20mL乙腈中，通入氮气保护，依次加入11.5mg KI、3.7mg催化剂18-冠-6、23.4mg碳酸钾，升温回流反应 24h，TLC跟踪检测。反应完毕，减压除去溶剂，加入冰水10mL搅拌溶解，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，盐水洗涤两次，收集有机相，无水硫酸钠干燥4h，过滤收集母液后用硅胶柱纯化得到目标半抗原MET-3(甲醇/二氯甲烷， 1：15，V/V)，图1为MET-3质谱鉴定图。

反应式3：

实施例2人工载体的制备

1、免疫原MET-3-BSA的制备

将15.0mg MET-3半抗原溶于0.30mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.87mg N,N-二环已基碳二亚胺和5.50mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下搅拌反应过夜，离心后取上清液记为A液。将26.48mg BSA溶于6mL 0.01mol/L PBS中，记为B 液，搅拌下将A液滴入B液中，4℃避光反应12h，反应完离心取上清，4℃下 PBS溶液透析3天，得到甲基苯丙胺人工免疫原，以1mg/mL的浓度分装于1mL 离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。

2、酶标抗原MET-3-HRP的制备

将15.0mg MET-3半抗原溶于0.30mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入9.87mg N,N-二环已基碳二亚胺和5.50mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃下搅拌反应过夜，离心后取上清液记为A液。将17.54mg HRP溶于6mL 0.01mol/L PBS中，记为B 液，搅拌下将A液滴入B液中，4℃反应12h，反应完离心取上清，4℃下PBS 溶液透析3天，得到甲基苯丙胺酶标抗原，分装于1mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。

3、甲基苯丙胺免疫原和酶标抗原的表征

(1)免疫原与酶标抗原的鉴定采用紫外扫描的方法，在180～350nm波长范围内测定免疫原和包被原的紫外吸收光谱，比较不同物质的扫描曲线，鉴定半抗原与载体蛋白是否偶联成功。由于载体蛋白和半抗原在紫外光谱条件下都具有最大吸收峰，如果偶联成功，特征吸收峰会相互叠加，从而导致最大吸收峰的蓝移。

(2)如图2所示，在280nm左右有载体蛋白特征吸收峰，人工抗原的特征吸收峰都出现了明显的蓝移，所以从紫外光谱扫描结果可以证明免疫原与酶标抗原偶联成功。

实施例3甲基苯丙胺多克隆抗体制备

1、动物免疫

2～2.5kg新西兰大白兔首次免疫时，注射免疫原的量为1.0mL/只，取0.5mL 浓度为1mg/mL的免疫原加等体积的弗氏完全佐剂，乳化充分后在大白兔背部皮下多点注射，每点约200μL；21天后进行第2次免疫，免疫剂量1.0mL/只，用弗氏不完全佐剂乳化；以后每隔14天加强免疫1次，一般共免疫5次。在第 3次免疫和第5次免疫后，均采血进行抗血清效价测定。实验动物做好编号、管理和记录，注意大白兔的健康状况。

2、抗血清效果分析

(1)第3次和第5次免疫后的第7天，实验大白兔耳朵静脉采血40μL，离心取抗血清，用nanodrop检测其抗体浓度后，分装-20℃保存备用。

(2)采用酶联免疫法测定抗血清的效价和特异性，其步骤如下：

S1.包被：将1mg/mL的抗血清用碳酸缓冲液稀释1000倍，并做空白对照组，100μL/孔加入到酶标板中，置于37℃水浴箱中孵育过夜。

S2.洗涤：倾去孔内液体，设定洗板机参数每孔加去离子水300μL，洗板2 次，然后甩干洗涤液。

S3.封闭：每孔加120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，置于37℃烘箱1h至烘干。

S4.加酶标抗原及标准品：将酶标抗原梯度稀释；将甲基苯丙胺标准品溶于适量甲醇配制成1.0mg/mL的标准品溶液，4℃保存备用。效价列：每孔加100μL 的空白稀释液和100μL梯度稀释的酶标抗原，最后两孔加PBS作空白对照；抑制列：每孔加20μL的标准品溶液和100μL梯度稀释的酶标抗原，最后两孔加标准品稀释液作空白对照；振荡后室温孵育40min，洗板6次。

S5.显色：每孔加入100μL TMB显色液，室温显色20min，然后每孔加入 100μL的终止液(10％H₂SO₄)。

S6.读数测定：在波长450nm条件下用酶标仪读取吸光值(OD)。

(3)选择吸光度值在1.0～1.5区间内的抗血清稀释倍数为抗血清效价，抗血清的效果由其抑制率得出，相同的药物浓度下，抑制率越高，则抗体对此药物的灵敏度越高。

3、抗血清的纯化

(1)选择抑制率及效价最佳的实验大白兔，麻醉昏迷后心脏采全血，再通过脊柱脱臼对实验动物进行安乐死处理；

(2)血液经37℃温浴20min后，5000rpm离心20min，取上层血清，分装后置于-20摄氏度保存；

(3)5mL兔抗血清用10mL醋酸盐缓冲液进行稀释，并用1mol/L NaOH 溶液将pH调制4.5；

(4)搅拌条件下，往血清中缓慢逐滴加入375μL正辛酸，继续搅拌30min 后，4℃条件下静置1h，使杂蛋白充分沉淀析出；

(5)静置结束后经4℃ 12000rpm条件下离心15min，用125μm滤膜进行过滤，取得上清液；

(6)上清液加入0.1mol/L PBS缓冲液1.5mL，再用浓度为1mol/L的NaOH 溶液调节pH，使得pH＝7.4；

(7)冰浴条件下，30min中内缓慢加入4.432g的硫酸铵，使得其能够成 45％饱和度；4℃的条件下静置2h，再在4℃ 12000rpm条件下离心15min，将上清液除去，取得沉淀；

(8)沉淀用5mL 0.1mol/L PBS(pH＝7.4)复溶，再进行超滤3次；

(9)超滤后的多抗用0.1mol/L PBS(pH＝7.4)稀释10倍，分装后-20℃保存。

实施例4酶联免疫测定毛发中甲基苯丙胺方法的建立

1、酶联免疫(ELISA)反应具体包括以下步骤：

S1.包被：用碳酸缓冲液将甲基苯丙胺抗体稀释至合适浓度，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。

S2.洗涤：倾去孔内液体，洗板2次，每孔加洗涤液300μL，甩干。

S3.封闭：每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干，倒置于37℃烘箱中1h备用。

S4.毛发前处理：称取25mg毛发置于研磨管内，加入1mL PBS(pH＝8.0) 和20颗直径为2mm的锆珠，置于研磨仪中，以2800rpm振荡25秒，共4个循环，每个循环之间停10秒。振荡结束后静置30秒，上清即为待测样品溶液。

S5.加样及孵育：每孔依次加入20μL药物稀释液或待测样品溶液，100μL 稀释一定倍数的酶标抗原；震荡混匀，室温中孵育40min后，每孔加入洗涤液 300μL，洗板机洗板6次，甩干。

S6.显色：每孔加入TMB显色液100μL，置于室温中显色20min后，每孔加入100μL终止液(10％H₂SO₄)。

S7.测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值。

S8.计算：用Origin8.6的四参数拟合模块建立甲基苯丙胺的标准曲线，以各标准品吸光度与零浓度标准品吸光度的比值(B/B₀)为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标，做出标准曲线，计算IC₅₀值。

2、配制20ng/mL、10ng/mL、4ng/mL、1ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL 的甲基苯丙胺标准品溶液，建立酶联免疫检测方法的标准曲线。图3为甲基苯丙胺标准曲线。该方法针对甲基苯丙胺IC₅₀＝1.00ng/mL，线性检测范围(IC₂₀-IC₈₀) 为0.22-4.46ng/mL，检测限(IC₁₀)为0.13ng/mL，与苯丙胺等类似物无明显交叉。

实施例5抗体交叉反应率的测定

1、按实施例4中所得最佳包被抗体浓度和最佳酶标稀释倍数，以结构类似物苯丙胺、麻黄碱、甲氧那明，功能类似物吗啡及氯胺酮为竞争标准品，进行 ELISA实验，检测甲基苯丙胺多克隆抗体的特异性，其半数抑制浓度(IC₅₀)和交叉反应率(CR)数值在表1中列出。

表1

实验结果表明，本甲基苯丙胺抗体与结构或功能类似物苯丙胺、麻黄碱、甲氧那明、氯胺酮、吗啡均无明显交叉。麻黄碱与甲氧那明是哮喘药等常见处方药物的主要成分，本方法中甲基苯丙胺抗体与这两种药物均无交叉，说明本发明的甲基苯丙胺抗体特异性好，检测结果不易受含有麻黄碱与甲氧那明药物影响，建立的酶联免疫检测方法准确性高。

通过查阅文献，检索得到已发表的关于甲基苯丙胺特异性检测的半抗原结果如下(表2)。通过对比发现，本发明的半抗原所得到的抗体灵敏度更高，半抗原设计更为合理。

表2部分已发表的甲基苯丙胺半抗原结构

参考文献 [1]Waliluk M,Phensri T,Vimolmas L.Simultaneous detection ofamphetamine,methamphetamine and ephedrine by heterology competitive anzyme-linked immunosorbent assay[J].Asian Biomedicine,2007,1(2)

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。