一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法
阅读说明：本技术 一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法 (Blood stream infection pathogen negative bacteria trace broth fluorescence drug sensitization method ) 是由 赵志军 周云花 杨宁爱 康宇婷 于 2021-01-25 设计创作，主要内容包括：本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法,包括：挑取单个菌落于培养基中过夜培养并进行12个梯度设计,测试菌浓度的OD-(625)值；用无菌去离子水将缓冲液稀释,得到稀释后的缓冲液；将20μL ApoH磁珠、缓冲液以及培养后的菌落在37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min,得到细菌-ApoH磁珠混合物；将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃、12000rpm离心、弃上清以及重悬得到菌悬液；将菌悬液置于MS分离柱上过柱,得到过柱后的反应液；使用反应液进行96孔板荧光药敏试验。本申请提供所述方法检测血流感染病原菌时,由于利用的是磁珠富集原理来进行检测,而且磁珠富集细菌能够提高检测灵敏度,从而提高检测的阳性率和检出率。(The application provides a blood stream infection pathogen negative bacteria trace broth fluorescence drug sensitivity method, which comprises the following steps: single colonies were picked and grown overnight in medium and subjected to 12 gradient design to test OD of bacterial concentration 625 A value; diluting the buffer solution by using sterile deionized water to obtain a diluted buffer solution; incubating 20 mu L of ApoH magnetic beads, buffer solution and cultured colonies for 15min at the temperature of 37 ℃ by a bacteria culture shaker at 300rpm to obtain a bacteria-ApoH magnetic bead mixture; magnetic treatment of bacterium-ApoHCentrifuging the bead mixture at 4 ℃ and 12000rpm, discarding the supernatant and resuspending to obtain a bacterial suspension; putting the bacterial suspension on an MS separation column to pass through the column to obtain reaction liquid after passing through the column; the reaction solution was used to perform a 96-well plate fluorescence susceptibility test. When the method is used for detecting the pathogenic bacteria infected by the blood stream, the detection is carried out by utilizing the magnetic bead enrichment principle, and the detection sensitivity can be improved by enriching bacteria by the magnetic beads, so that the positive rate and the detectable rate of the detection are improved.)
技术领域
本申请涉及病原微生物技术领域，尤其涉及一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法。
背景技术
血流感染(Bloodstream infection,BSI)是指各种病原微生物(包括细菌、病毒或真菌)入侵血液，在血液中繁殖并产生和释放毒素等代谢产物，并诱导细胞因子释放，引起全身感染、中毒和炎症反应，甚至可能导致凝血和纤溶系统的改变，引起全身多器官功能障碍综合征，是一种严重的全身感染性疾病。因此，血流感染的控制越来越受到人们的关注。
通常血流感染病情较为凶险，若不能及时进行抗感染治疗，预后较差，将会增加临床患者发病率和死亡率，有研究表明早期诊断可以降低因血流感染而诱发的病死率。血流感染是一种时间紧迫的医疗紧急情况，应该像创伤护理或心肌梗死一样有紧迫感，对此有明确的反应时间。抗生素敏感性试验(Antimicrobial susceptibility test,AST)是测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力，来确定细菌对抗生素的敏感性，是目前公认的针对细菌耐药性和敏感性的方法。所以捕获细菌之后，利用密度梯度离心法将漂浮于上清液中的死菌除去，而且为了达到血流感染快速检测治疗的目的，只需证明患者确有血流感染并快速给出抗菌药敏试验结果，然后直接进行微量肉汤快速荧光培养，无需将细菌培养再挑取单个菌落培养以达到细菌分纯的目的。
目前临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度法、自动化仪器等。许多临床实验室使用纸片扩散法作为常规的药敏试验，其缺点是不适用于生长缓慢的菌株及一些苛养菌；稀释法的主要缺点是操作繁琐；抗生素浓度法的成本太高，不适合常规试验应用；自动化仪器需要仪器才能进行。这些方法对临床血流感染病原菌血培养阳性率和检出率低，阳性率为9％左右、检出率为85％左右，而且都主要靠血培养来诊断血流感染，但血流感染患者的阳性血性血培养瓶中的血液样本传统抗菌药敏检测的总周转时间超过三天，因为其需要三个过夜培养步骤：血培养、传代培养和抗菌药敏试验培养，以致治疗延迟，并且容易受到微生物污染。大约30％-50％的血液培养结果显示，在那些似乎有感染的患者身上呈阴性。这些阴性血培养可能是由于病原体计数低或血样中存在非培养性感染因子所致。而且在阳性血液培养瓶中，细菌与大量血细胞混合，细菌浓度范围为107至109CFU/mL，不可预测。由于常规AST系统通过测量抗生素给药病原体培养物的光密度(OD)来检测细菌群体的变化，它们非常敏感地依赖于初始接种菌株的量，并且应严格控制细菌的初始浓度。因此，使用常规方法不能将血培养阳性瓶直接用于抗生素敏感性试验，需要在琼脂平板上进行传代培养以获得准确浓度的纯菌种，从而使用细菌原液，进行过夜抗生素敏感性试验过程。由于检测灵敏度低，存在一定的污染率，以至于影响早期血流感染的诊断和治疗。
发明内容
本申请提供了一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法，以解决检测灵敏度低，存在一定的污染率，以致于影响早期血流感染的诊断和治疗的问题。
本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法，包括以下步骤：
挑取单个菌落于培养基中过夜培养并进行12个梯度设计，测试菌浓度的OD625值；
用无菌去离子水将缓冲液稀释，得到稀释后的缓冲液；
将20μL ApoH磁珠、所述缓冲液以及培养后的菌落在37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物；
将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃下进行12000rpm离心、弃上清以及重悬得到菌悬液；
将菌悬液置于MS分离柱上过柱，得到过柱后的反应液；
使用反应液进行96孔板荧光药敏试验。
可选的，挑取单个菌落于培养基中过夜培养并进行12个梯度设计，测试菌浓度的OD625值包括：
实验挑取单个大肠埃希菌(ATCC-25922)菌落于装有适量的LB肉汤培养基的锥形瓶中摇菌过夜，其中，温度为37℃和转速为180rpm/min；然后于质量分数为0.9％，5mL的生理盐水进行菌落量的梯度设计；其中加入的菌落(CFU/mL)分别为：1×109、1.5×108、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100，还有0.9％生理盐水对照组；
用多功能微孔板监测仪分别测相应菌浓度的OD625值。
可选的，用无菌去离子水将缓冲液稀释，得到稀释后的缓冲液包括将10×TTGB-10缓冲液用无菌去离子水稀释至2×TTGB-10缓冲液。
可选的，所述将20μL ApoH磁珠、所述缓冲液以及培养后的菌落在37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物步骤包括：
首先在含有菌浓度(CFU/mL)为1×109、1.5×108、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100以及0.9％生理盐水对照的5mL 0.9％生理盐水中加入5mL 2×TTGB-10缓冲液，然后向每个相应管中加入20μL ApoH磁珠；
将管子于37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物。
可选的，所述将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃、12000rpm离心、弃上清以及重悬得到菌悬液的步骤包括：
将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃以及12000rpm离心10min，弃上清；
将弃上清的所述混合物于pH值为7.4的1mL PBS溶液中重悬，重悬条件为4℃、12000rpm离心5min，弃上清；
将弃上清之后的悬浮液再次于1mL PBS重悬得到菌悬液。
可选的，所述将菌悬液置于MS分离柱上过柱，得到过柱后的反应液步骤包括：
将菌悬液置于MS分离柱上，反应液含有未标记的细菌，再用1mL清洗缓冲液洗柱子；
从分离装置中取出MS分离柱，放置到新的离心管中，吸取1mL清洗缓冲液，反应含有所需成分；
将反应液于4℃以及12000rpm离心5min，弃上清后用100μL PBS重悬，得到重悬后的反应液。
可选的，所述使用反应液进行96孔板荧光药敏试验步骤包括：
取出抗生素粉末溶解稀释，在孔板的第一孔加入200μL浓度为64μg/mL的抗菌药物，第二至十一孔分别加入100μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀，再吸取100μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μL弃去；此时各孔药物浓度依次为：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5以及0.25μg/mL，第11列加入200μLMH肉汤培养基作阴性对照，第12列加入200μL所述反应液作阳性对照；其中，反应液浓度为1×105CFU/mL；
吸取所述反应液，用MH肉汤培养基将其浓度调至1×108CFU/mL，再用MH肉汤培养基稀释100倍使反应液浓度达到1×106CFU/mL，再按1～10列每孔100μL加入到药敏板内的各个凹孔中，使得每孔最终菌悬液浓度为1×105CFU/mL；
使用荧光试剂盒标记抗体；
将接种好的所述药敏板放置于37℃以及5％CO2温箱中培养；
所述药敏板在37℃以及5％CO2温箱中培养10h后向每孔加入荧光抗体5μL继续在37℃以及5％CO2温箱孵育30min；
利用多功能微孔板监测仪进行荧光强度的检测，并确定MIC。
由以上技术方案可知，本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法，包括以下步骤：挑取单个菌落于培养基中过夜培养并进行12个梯度设计，测试菌浓度的OD625值；用无菌去离子水将缓冲液稀释，得到稀释后的缓冲液；将20μL ApoH磁珠、所述缓冲液以及培养后的菌落在37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物；将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃、12000rpm离心、弃上清以及重悬得到菌悬液；将菌悬液置于MS分离柱上过柱，得到过柱后的反应液；使用反应液进行96孔板荧光药敏试验。
本申请提供所述方法，检测血流感染病原菌时，采血后无需血标本过夜培养和平板分纯培养，直接利用磁珠富集原理，应用ApoH磁珠从血标本中富集细菌。
本申请提供所述方法检测血流感染病原菌时，由于利用的是磁珠富集原理来进行检测，而且磁珠富集细菌能够提高检测灵敏度，从而提高检测的阳性率和检出率，使其较传统的抗菌药敏检测系统有所提高。
本申请提供所述方法检测血流感染病原菌是直接磁珠富集原理，应用ApoH磁珠与血标本中细菌结合，只需检测出血液标本中确定有细菌感染并能确定出其药敏结果，以便临床治疗即可，因此无需进行细菌分纯，直接进行抗菌药敏试验。
本申请提供的所述方法检测血流感染病原菌过程中，利用密度梯度离心法，使活菌沉积，从而区分出活菌和死菌，并除去死菌。
本申请提供的所述方法进行血流感染病原菌药敏试验，通过观察荧光强度值变化更易于药敏结果的观察。
本申请提供的所述方法检测血流感染病原菌从采血到抗生素药敏结果的总周转时间大约在13h内；从阳性血培养到抗生素药敏检出的总周转时间大约为26h。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法流程示意图；
图2为传统血流感染检测与本申请提供的方法对比图。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
参见图1，为本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法流程示意图。
本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法，包括以下步骤：
1，称取细菌放入培养基中培养并进行12个梯度设计，测试菌浓度的OD625值；
挑取单个大肠埃希菌(ATCC-25922)菌落于装有适量的LB肉汤培养基的锥形瓶中摇菌过夜，其中，温度为37℃和转速为180rpm/min；然后于质量分数为0.9％，5mL的生理盐水进行菌落量的梯度设计；其中加入的菌落(CFU/mL)分别为：1×109、1.5×108、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100，还有0.9％生理盐水对照组；
用多功能微孔板监测仪分别测相应菌浓度的OD625值。
2，用无菌去离子水将缓冲液稀释，得到稀释后的缓冲液；
用无菌去离子水将缓冲液稀释，得到稀释后的缓冲液包括将10×TTGB-10缓冲液用无菌去离子水稀释至2×TTGB-10缓冲液。
3，将20μL ApoH磁珠、所述缓冲液以及培养后的菌落在37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物；
首先在含有菌浓度为1×109、1.5×108、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100以及0.9％生理盐水对照的5mL0.9％生理盐水中加入5mL 2×TTGB-10缓冲液，然后向每个相应管中加入20μL ApoH磁珠；
将管子于37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物。
4，将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃、12000rpm离心、弃上清以及重悬得到菌悬液；
将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃以及12000rpm离心10min，弃上清；
将弃上清的所述混合物于pH值为7.4的1mL PBS溶液中重悬，重悬条件为4℃、12000rpm离心5min，弃上清；
将弃上清之后的悬浮液再次于1mL PBS重悬得到菌悬液。
5，将菌悬液置于MS分离柱上过柱，得到过柱后的反应液；
将菌悬液置于MS分离柱上，使液体自然流下，反应液含有未标记的细菌，再用1mL清洗缓冲液洗柱子；
从分离装置中取出MS分离柱，放置到新的离心管中，吸取1mL清洗缓冲液，反应含有所需成分；
将反应液于4℃以及12000rpm离心5min，弃上清后用100μL PBS重悬，得到反应液。
6，使用反应液进行96孔板荧光药敏试验。
取出抗生素粉末溶解稀释，在孔板的第一孔加入200μL浓度为64μg/mL的抗菌药物，第二至十一孔分别加入100μL的MH肉汤培养基，从第一孔吸取100μL加入第二孔，混匀，再吸取100μL至第三孔，依次类推，第十孔吸取100μL弃去；此时各孔药物浓度依次为：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5以及0.25μg/mL，第11列加入200μLMH肉汤培养基作阴性对照，第12列加入200μL所述反应液作阳性对照；其中，反应液浓度为1×105CFU/mL；
吸取所述反应液，用MH肉汤培养基将其浓度调至1×108CFU/mL，再用MH肉汤培养基稀释100倍使反应液浓度达到1×106CFU/mL，再按1～10列每孔100μL加入到药敏板内的各个凹孔中，使得每孔最终菌悬液浓度为1×105CFU/mL；
使用荧光试剂盒标记抗体；
将接种好的所述药敏板放置于37℃以及5％CO2温箱中培养；
所述药敏板在37℃以及5％CO2温箱中培养10h后向每孔加入荧光抗体5μL继续在37℃以及5％CO2温箱孵育30min；
利用多功能微孔板监测仪进行荧光强度的检测，并确定MIC(最低抑菌浓度)。
实施例
选取标准菌株大肠埃希菌ATCC25922进行血流感染病原阴性菌微量肉汤快速荧光药敏试验，将接种了庆大霉素、四环素、环丙沙星和亚胺培南的微量肉汤药敏板置于35℃温箱中分别培养4h、6h、8h、10h后取出，再向每孔加入5μL经Alexa Fluor 488 ProteinLabeling Kit(Alexa Fluor 488蛋白质标记试剂盒)标记的Lipid A LPS PolyclonalAntibody(LPS多克隆抗体)(1：30)并于35℃恒温培养箱继续培养30min，利用多功能微孔板监测仪检测荧光强度值大小来确定MIC。庆大霉素、四环素、环丙沙星和亚胺培南药敏孔在不同培养时间点下的荧光强度值变化见表1，通过检测发现，接种有庆大霉素、四环素、环丙沙星和亚胺培南的MH肉汤的荧光强度值从培养4h到10h基本逐渐减低，直到在35℃温箱中培养10h，再添加5μl荧光抗体继续培养30min后，荧光强度值为0的药敏孔，意味着此时这些含有抗生素的药敏孔已无细菌存活，随着药物浓度的增加荧光强度值基本逐渐降低，说明细菌量逐渐减少，根据CLSIM100文件可知庆大霉素MIC≤4μg/mL、四环素MIC≤4μg/mL、环丙沙星MIC≤1μg/mL、亚胺培南MIC≤1μg/mL，结果敏感。
表1.荧光药敏试验大肠埃希菌ATCC-25922药敏结果的统计
由以上技术方案可知，本申请提供一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法，包括以下步骤：挑取单个菌落于培养基中过夜培养并进行12个梯度设计，测试菌浓度的OD625值；用无菌去离子水将缓冲液稀释，得到稀释后的缓冲液；将20μL ApoH磁珠、所述缓冲液以及培养后的菌落在37℃细菌培养摇床300rpm孵育15min，得到细菌-ApoH磁珠混合物；将细菌-ApoH磁珠混合物于4℃、12000rpm离心、弃上清以及重悬得到菌悬液；将菌悬液置于MS分离柱上过柱，得到过柱后的反应液；使用反应液进行96孔板荧光药敏试验。
为了减少目前抗生素耐药性检测过程的总周转时间(TAT)，本申请的主要目的是在无分离、分纯培养过程的情况下处理来自血培养阳性瓶的宽动态范围的接种菌株量来开发一种血流感染病原菌微量肉汤快速荧光药敏系统，预期血流感染病原菌微量肉汤快速荧光药敏系统在不影响检测结果准确度的情况下，从血培养到抗菌药敏试验的总周转时间为27h，较目前临床传统血流感染病原菌抗菌药敏检测的总周转时间缩短38小时；而且通过检测荧光强度值判断MIC，更加简便。
本申请提供所述方法检测血流感染病原菌时，由于利用的是磁珠富集原理来进行检测，而且磁珠富集细菌能够提高检测灵敏度，从而提高检测的阳性率和检出率，使其较传统的抗菌药敏检测系统有所提高。
本申请提供所述方法检测血流感染病原菌是直接磁珠富集原理，应用ApoH磁珠与血标本中细菌结合，只需检测出血液标本中确定有细菌感染并能确定出其药敏结果，以便临床治疗即可，因此无需进行细菌分纯，直接进行抗菌药敏试验。
本申请利用ApoH磁珠在20分钟内(病原体与ApoH磁珠结合15min，洗珠5min)富集5mL血培养瓶中的细菌，并且检测限也为1CFU/mL。传统的微量肉汤稀释法是将病原菌与抗生素共培养20h左右通过观察肉汤浊度并检测肉汤OD值来判断MIC值，而本申请先将病原菌与抗生素快速共培养10h后加入荧光抗体孵育0.5h，利用荧光抗体特异结合病原菌并通过检测荧光强度值来确定MIC值更省时、直观。图2为传统血流感染检测与本申请提供的方法对比图。本申请提供的所述方法检测血流感染病原菌从采血到抗生素药敏结果的总周转时间大约在13h内；从阳性血培养到抗生素药敏检出的总周转时间大约为26h。
本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。