一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法
阅读说明：本技术 一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法 (Method for detecting activity of mycotoxin in poplar canker by using in-vitro leaves ) 是由 赵嘉平 张冰玉 张一南 李金鑫 李敏 邢军超 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法,包括采集带有成熟叶片的杨树健康枝条,浸泡于装满无菌水中,避光保存；在无菌水中,从所述杨树健康枝条的叶柄与枝条连接处剪下叶片,将所述杨树健康枝条的叶柄向下插入所述无菌水中；将所述叶柄固定在离心管中并置于光照度为200μmol m～(-2) s～(-1)补光30分钟；测定叶片净光合速率。以毒素处理液中叶片的净光合速率与无菌水对照叶片的净光合速率之间是否出现显著差异及出现显著差异的时间作为评定杨树溃疡病真菌毒素活性的指标。该方法不受自然天气的影响,是一种方便快捷、准确的评定杨树溃疡病真菌毒素活性的方法。(The invention relates to a method for detecting the activity of mycotoxin in poplar canker by utilizing in vitro leaves, which comprises the steps of collecting healthy branches of poplar with mature leaves, soaking the branches in sterile water, and storing the branches in a dark place; cutting off leaves from the joint of the petiole and the branch of the healthy poplar branch in sterile water, and downwards inserting the petiole of the healthy poplar branch into the sterile water; fixing the petiole in a centrifuge tube and placing the centrifuge tube under the illumination of 200 mu mol m ‑2 s ‑1 Supplementing light for 30 minutes; and (4) measuring the net photosynthetic rate of the leaves. Whether a significant difference occurs between the net photosynthetic rate of the leaves in the toxin treatment solution and the net photosynthetic rate of the sterile water control leaves and the time when the significant difference occurs are taken as indexes for evaluating the activity of the mycotoxin of the poplar canker disease. The method is not affected by natural weather, and is a convenient, rapid and accurate method for evaluating the activity of mycotoxin in the poplar canker.)
技术领域
本发明属于溃疡病真菌毒素活性检测技术领域，涉及一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法。
背景技术
杨树溃疡病是我国最为重要的树木枝干病害，普遍发生于我国各个杨树适生区。溃疡病主要危害杨树幼苗和幼树，但也在多年生杨树上广泛发生杨树溃疡病造成的持续性灾害，严重影响了我国杨树人工林产业、生态公益林建设的发展。
杨树溃疡病是由溃疡病真菌(Botryosphaeria dothidea)引起的枝干病害。研究表明，病原真菌在生长过程中或与寄主相互作用的过程中会产生真菌毒素，其对寄主的酶、核酸代谢,蛋白质合成等有抑制作用,可引起膜透性增加,使茎的液体流动降低,干扰蒸腾作用并使叶片萎蔫。毒素作为多数病原菌的重要致病因子，被认为可以作为选择压替代病原菌处理寄主植株组织或器官，筛选耐毒素的植株。生物测定是病原真菌毒素测定最传统也是最直接的方法。生物测定通常以毒素对植物造成的伤害为指标，采用完整植株、种子、幼苗、部分器官、愈伤组织、植株细胞或者细胞器等多种材料进行，然而以上方法通常存在实验周期过长，材料制备费时费力等缺点。毒素处理扦插植株、水培枝条、愈伤组织以及苹果、梨果实等方法已经被用于枝干溃疡病菌毒素的生物活性的测定，但是以上测定方法中，从实验处理到毒素危害表型出现，往往需要几天或者更长时间，而且需要消耗大量的实验材料。研究证实，在杨树溃疡病菌、烂皮病菌等枝干真菌病害侵染早期，病原真菌即可显著降低杨树及其他植物叶部组织的净光合速率、气孔导度等生理指标，显示溃疡病菌毒素具有光合抑制活性。基于以上发现，需要一种基于光合参数测定的杨树溃疡病菌毒素生物活性测定的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法，该方法简单、快捷、准确、实用，并且，不受自然天气的限制，可在任何天气条件下进行测定，为快速准确鉴定杨树溃疡病真菌毒素活性，为快速筛选出抗溃疡病杨树品种、加速抗病育种进程提供有效方法。
本发明提供了一种利用离体叶片杨树溃疡病真菌毒素活性的方法，其包括以下步骤：
(1)采集带有成熟叶片的杨树健康枝条，浸泡于装满无菌水中，避光保存；
(2)在无菌水中，从所述杨树健康枝条的叶柄与枝条连接处剪下叶片，将所述杨树健康枝条的叶柄向下插入所述无菌水中；
(3)将所述叶柄固定在离心管中并置于光照度为200μmol m-2s-1补光30分钟；
(4)将叶片转移到含有5.00％毒素的处理液中，分别于10min、30min、50min、70min、90min后测定叶片净光合速率，评定杨树溃疡病真菌毒素活性的指标。
进一步地，以毒素处理液中叶片的净光合速率与无菌水对照叶片的净光合速率之间是否出现显著差异及出现显著差异的时间作为评定指标，测定时间为日照时间。
进一步地，所述的浓度毒素处理液为包含5.00％杨树溃疡病菌毒素的水溶液。
进一步地，所述的杨树溃疡病菌毒素为丙酮沉淀的病菌毒素。
进一步地，净光合速率的测定采用光合系统测定的净光合速率，每个处理选择3株苗木，每株苗木测定2片成熟叶。
附图说明
图1为本发明中利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法的流程图；
图2为5.00％毒素处理液处理新疆杨叶片和无菌水处理对照叶片净光合速率的差异状况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。应当指出，优选实施方式不应视为对本发明的限制，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
如图1所示，本发明包括以下步骤：
(1)采集带有成熟叶片的杨树健康枝条，浸泡于装满无菌水中，避光保存；
(2)在无菌水中，从所述杨树健康枝条的叶柄与枝条连接处剪下叶片，将所述杨树健康枝条的叶柄向下插入所述无菌水中；
(3)将所述叶柄固定在离心管中并置于光照度为200μmol m-2s-1补光30分钟；
(4)将叶片转移到含有5.00％毒素的处理液中，分别于10min、30min、50min、70min、90min后测定叶片净光合速率，评定杨树溃疡病真菌毒素活性的指标。
下面结合实施案例对本发明作进一步说明，植物主要以新疆杨(Populus albavar.pyramidalis Bge.)为例，杨树溃疡病真菌主要以溃疡病菌(Botryosphaeriadothidea)菌株CZA为例，不限制本发明适用范围：。
1、溃疡病菌CZA平板培养
真菌材料为中国林科院水分生理研究室保存的溃疡病菌株CZA。将菌株CZA在2.0％PDA培养基(2.0％马铃薯提取物,2.0％葡萄糖,1.5％琼脂)上活化后，25℃、黑暗培养。
2、溃疡病菌CZA液体培养
菌株经PDA培养7d后，无菌条件下，划取直径约4mm菌饼接种于装有已灭菌的300ml马铃薯葡萄糖培养液(PD)的容量为500ml的三角瓶中，每瓶接种5块菌饼，在25℃、110r/min、黑暗条件下，震荡培养10天。
3、溃疡病菌CZA毒素提取
培养后的菌液无菌条件下采用0.2μm的微孔滤膜进行过滤，所得滤液在38℃-40℃下，用旋转蒸发器真空旋转蒸发至30ml，分3次加入150mL丙酮，在室温下振荡萃取l h。之后移出丙酮，剩下的不溶部分用旋转蒸发器真空旋转蒸发去除丙酮后，用无菌水溶解定容至300mL，即得病菌毒素原液，置于4℃冰箱中储藏待用。
4、毒素处理液配制
按体积比配制包含5.00％杨树溃疡病菌毒素的水溶液。
5、室外取样
取带有2片成熟叶片的新疆杨健康枝条，迅速浸泡于装满无菌水的水桶中，避光带回实验室。
6、室内样品处理
在液体中，从叶柄与枝条连接处剪下叶片，在水中将叶柄向下插入5ml离心管中。离心管口向上，将装满水的离心管连同里面的叶柄取出，用胶带纸将叶柄固定在离心管中。将离心管竖直放在试管架上，放置于光照度为200μmol m-2s-1的自制补光架下，补光30分钟。
7、毒素处理液处理及光合参数测定
将补光后叶片迅速转移到5.00％毒素处理液中，分别于10min、30min、50min、70min、90min后测定叶片净光合速率。净光合速率的测定采用Li-6400光合系统(LI-COR,Lincoln,USA)，测定的净光合速率包括净光合速率、蒸腾速率、气孔导度等，每个处理选择3株苗木，每株苗木测定2片成熟叶。
8、数据分析
采用SPSS软件对测定的光合生理数据进行平均数计算、差异显著性检验。如图2所示，为5.00％毒素处理液处理新疆杨叶片和无菌水处理对照叶片净光合速率的差异状况。
统计结果表明，5.00％毒素处理液中的叶片，处理10min到处理后30min，净光合速率保持不变。毒素处理液处理50min后，净光合速率平均值为15.14±6.86，相比前3次测量有降低的趋势，但不同叶片之间光合速率差异较大，虽然显示毒素处理对光合作用的抑制，但与对照之间差异不显著。毒素处理液处理70min后，叶片净光合速率极显著低于其对照叶片(ANOVA，P<0.01)。因此，5.00％的杨树溃疡病真菌毒素在处理离体叶片70min后即对杨树叶片的净光合速率产生显著影响，说明其具有活性，且活性较强。
本发明有经济、快速、准确、材料易得的显著特点，可以应用于枝干溃疡病菌毒素性能测定、不同杨树种类或无性系的抗溃疡病菌能力测定、溃疡病菌毒素等相关毒素分离过程中不同组分的快速生物测定等方面。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种结核分枝杆菌的药物敏感性检测方法