具体实施方式

图1所示，一种生物制品的痕量DNA提取方法，包括四个步骤，步骤一：蛋白消化。步骤一分为如下七个流程，(1)分别设置双头控温金属浴模块至55℃和60℃；(2)采用六只标签2mL的低吸附离心管，三只离心管标记为样本、三只离心管标记为样本+ERC(ExtractionControl,已知量的提取质控DNA)、另外三根样本管标记为PBS缓冲液作为空白对照；(3)分别在每管内添加100μl样本或100ul样本+ERC(已知量的提取质控DNA)或100ul的PBS缓冲液；(4)分别在每管内加入10μl 5M NaCl(磁珠表面硅基结合DNA需要一定浓度的Na+形成盐桥结构，胍盐主要是让DNA和水分离开让DNA更容易接触磁珠)；(5)分别在每管内加入70ul蛋白酶K消化液振荡混匀后，在双头控温金属浴模块内55℃温育1小时；(6)取出样本添加360ul蛋白促溶剂，转至双头控温金属浴模块内60℃温育15分钟；(7)从金属浴中取出样本，快速离心30s，室温冷却5分钟备用。第一步骤中，蛋白消化主要用于去除蛋白质，由于生物制品的蛋白含量通常高于常规生物样品(这是因为有效药物成分是经过浓缩的治疗性蛋白，有些生物制品的剂量涉及高浓度的蛋白成分)，因此目前市场上的DNA提取需要先稀释100-1000倍生物制品再进行提取，即便如此，高蛋白浓度带来的检测干扰还是存在的。针对这一技术障碍，本实施例在蛋白消化后增加了一步蛋白促溶的步骤，让蛋白消化后的蛋白进一步去除，从而解决了高浓度蛋白对后续PCR扩增抑制干扰的问题。因此，生物制品能实现100倍内的稀释或不稀释来进行DNA提取及检测，其检测结果更接近实际的DNA残留量。

图1所示，一种生物制品的痕量DNA提取方法，步骤二：DNA结合。步骤二分为四个流程，(1)将室温的磁珠振荡混匀；(2)在样本混合物中加入10μl磁珠和400μl异丙醇，并立即手动颠倒混匀两次；(3)将装有全部混合物的离心管置于旋转混匀仪10rpm，然后快速离心15s后静置于磁性分离架上5分钟或者观察溶液澄清；(4)用枪头(1ml枪头200ul枪头真空抽吸的效果能达到最佳效果)小心移去上清，去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。第二步骤的DNA结合效率涉及多个因素，如磁珠的结合效率和分散性；除此之外，DNA有效结合磁珠的概率涉及混合方式；现有技术让磁珠结合的混匀方式主要有涡旋振荡和圆周振荡，这两类混匀方法往往存在死角的问题，如沉淀；这两种方法对于常规量的DNA提取没有问题，但对于痕量DNA提取存在混匀效果不佳的问题，这是因为痕量接触到磁珠的概率下降了。为了解决这个问题，本实施例采用了360度旋转的方式，从而解决DNA结合死角的问题。装有磁珠、DNA样品和结合缓冲液的2ml离心管安装在一个旋转混匀支架上，离心管的底部对准旋转中轴进行上下360度的旋转。由于装有DNA样品和磁珠的试管不断360度上下颠倒混匀，使得离心管内没有死角存在，DNA和磁珠可以得到充分的接触，在离液盐(如胍盐)缓冲液条件下磁珠表面的硅结构可以吸附DNA；这种柔和的混匀方式是目前接触DNA最充分的方式，从而可提高DNA结合的效率。

图1所示，一种生物制品的痕量DNA提取方法，步骤三：DNA洗涤。步骤三分为五个流程：(1)从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入600μl洗涤液A(含乙醇)，振荡10s使磁珠和洗涤液A混匀，快速离心15s后，将离心管重置于磁性分离架上；待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第1次磁珠洗涤；(2)重复上面操作流程(1)一次，完成第2次磁珠洗涤；(3)从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入200μl洗涤液B(去PCR抑制的试剂)，振荡机1档低速振荡使磁珠和洗涤液B(洗涤液B是一种脂肪醇，为无色油状液体，存在于天然柑橘类水果中。它不溶于水，能溶于乙醇和乙醚等有机溶剂，因此可以吸收样品中的一部分有机成分)混匀，快速离心15s后，将离心管重置于磁性分离架上；待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液；(4)为保证液体充分移除，可将离心管再次快速离心15s，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用10μl枪头小心的将残余液体吸除干净；(5)从磁性分离架上取下离心管，无需干燥，立即浸入洗脱步骤。第三步DNA洗涤通常采用乙醇清洗磁珠两次。乙醇清洗结合DNA的磁珠是目前现有主流的方法，通常对于去除盐离子非常有效，但对于结合在磁珠表面的PCR抑制成分是往往去除不了的。未去除的PCR抑制剂会随DNA一起洗脱下来，这会导致后续的PCR扩增效率下降，PCR扩增效率降低的结果是定量减少或假阴性。本实施例通过增加洗涤液B的洗涤步骤，让乙醇清洗后的磁珠和洗涤液B充分混匀，洗涤液B会溶解一部分吸附在磁珠表面的PCR抑制剂成分，然后通过磁力架吸附磁珠到离心管侧壁，再用移液器吸除离心管内液体，剩下的磁珠即为去除PCR抑制剂的磁珠。该步骤去除了乙醇清洗不了的PCR抑制剂，同时支持高浓度蛋白样品的DNA检测，因此主要的PCR抑制的技术障碍被突破了。

图1所示，一种生物制品的痕量DNA提取方法，步骤四：DNA洗脱。步骤四分为两个流程，(1)沿离心管壁加入50μl洗脱液，用漩涡振荡器轻微振荡5s使磁珠和洗脱液混匀，60℃温育5min，温育过程中可再次振荡混匀2-3次；(2)温育完成后，将离心管快速离心15s，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。第四步的DNA洗脱通常需要等待乙醇挥发后再加入洗脱液。乙醇的残留省去了乙醇干燥的步骤，因为第三步DNA清洗步骤里增加了一步洗涤液B的清洗，而洗涤液B的残留成分不会对后续PCR反应产生抑制，这样可以免去乙醇干燥的步骤直接进入DNA洗脱。由于乙醇干燥的步骤受不同的环境温度及湿度的影响，乙醇干燥的效果各有差异，如果乙醇挥发不充分，DNA洗脱液会含有PCR抑制的乙醇残留。如果干燥太久，DNA就会很难从磁珠上洗脱下来。因此，这个步骤很多情况下和实验员的操作有关系，不同的人会做出不同的结果。本实施例免去乙醇干燥后，DNA洗脱液可以在DNA清洗后直接加入，这样的操作可以让不同的人和不同的环境的实验结果趋于一致。

图1所示，本发明其他步骤和现有提取方法一致。本发明在常规操作蛋白酶K消化流程后，采用蛋白促溶剂去除样品中蛋白残留，从而进一步减少残留蛋白导致的PCR抑制。采用旋转混匀的方式实现DNA与磁珠结合，这种混匀是360度上下颠倒的旋转混匀，不会有沉淀产生，可以提高磁珠与DNA的结合效率。在常规乙醇洗涤样品后，增加了不含乙醇的洗涤液B(非乙醇的醇类)的洗涤。洗涤液B可以溶解一些乙醇所不能溶解的PCR抑制成分，从而可以提高DNA的纯度，减少PCR抑制的现象，同时，洗涤液B的残留不会产生PCR抑制的现象，因此洗涤液B清洗后可以立即进入DNA洗脱，无需乙醇干燥的步骤。本发明能从生物制品中快速、高效提取残留DNA，且提取的DNA能有效去除PCR抑制的成分，确保了后续的荧光定量PCR方法对宿主细胞或提取组织细胞残留DNA进行定量准确性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。