飞行时间质谱多重靶向dna甲基化位点定量检测方法
阅读说明：本技术 飞行时间质谱多重靶向dna甲基化位点定量检测方法 (Flight time mass spectrum multiple target DNA methylation site quantitative detection method ) 是由 张方舟 廉欢欢 张起起 秦胜红 王新新 梁海泳 于 2021-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明属生物技术领域,具体公开了一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法,本发明提供了一种DNA甲基化位点的高通量检测方法,可以针对多重待检测的甲基化位点,设计特异性探针,在同一个反应体系中,得到定量甲基化程度检测结果。具有操作简单、可同时检测在不同区域内的甲基化位点,降低对应的实验成本等特点。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly discloses a flight time mass spectrum multiple-target DNA methylation site quantitative detection method. The method has the characteristics of simple operation, capability of simultaneously detecting methylation sites in different areas, reduction of corresponding experiment cost and the like.)
技术领域
本发明属生物技术领域，具体公开了一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法。
技术背景
DNA的甲基化作为DNA—种重要的化学修饰，能在不改变DNA序列的前提下，影响DNA的遗传表现。在脊椎动物中，绝大多数的DNA甲基化修饰为5甲基胞嘧啶(5mc)，在人类基因组中，大约有70％到80％的CpG二核苷酸参与了这种修饰DNA的甲基化可参与许多的生物学进程，包括基因组印记、转座元件沉默、干细胞分化、胚胎发育等。DNA的甲基化作为一种重要的表观遗传现象，是表观遗传学的重要研究内容之一。
DNA甲基化检测方法飞速发展，高通量测序技术、芯片技术进行全基因组甲基化检测、定量的甲基化质谱检测技术越来越多的技术应用于甲基化研究。随着研究人员在甲基化领域的不断研究，对甲基化位点的定量检测需求也是越来越大。
目前现有的基于MassARRAY平台的甲基化定量检测技术，其原理是利用亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理DNA，使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应从而转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不能发生脱氨基反应，仍保留为胞嘧啶。第一轮扩增时，转化后的U与A配对，在第二轮扩增中进一步转变为T。最终使甲基化C与非甲基化C的区别，变成了C与T的区别。经过CT处理后的DNA样本，经过PCR扩增，得到对应目的片段的扩增产物，对扩增产物进行SAP消化，然后用T7 RNA&DNA Polymerase和RNase A酶对产物同步进行逆转录和酶切，得到含有CpG site的小片段，而甲基化和非甲基化的片段分子量是不同的，通过时间飞行质谱即可区分片段并计算甲基化比例。该检测方法的弊端在于无法在同一个反应well中同时检测不在同一范围内的CpG位点，并且因为技术的限制，并不能保证扩增片段中的CpG位点一定能检出、或是单独的检测结果。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，可以基于MassARRAY核酸质谱平台，实现同时针对多个不同位置的特定的CpG位点甲基化程度的检测，并且可以得到待检测CpG位点单独的甲基化程度结果，减少实验成本。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，包括如下步骤：
(1)针对特定位点设计特异性引物
(2)获取DNA样本
(3)对DNA进行亚硫酸氢盐处理，将序列中非甲基化的C经过亚硫酸盐处理后脱氨基变成U
(4)用步骤1中设计的引物扩增目的片段
(5)将步骤4中的产物经过SAP消化，去除未消耗的dNTP
(6)用ddNTP和UEP引物，对步骤5的产物进行单碱基延伸
(7)产物经脱盐纯化，进行飞行质谱检测
(8)结果分析和判读。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述检测方法用于同时检测多个不同区域内的CpG位点。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤1中的特异性引物包括但不限于：针对待检测的特定CpG位点所在的序列进行设计的特异性正向引物和反向引物或针对待检测的特定CpG位点设计的单碱基延伸引物。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤4具体包括使用特定CpG位点的上游引物-F和下游引物-R进行第一轮PCR，对模板DNA进行扩增，得到含有特定CpG位点的片段。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤4中第一轮PCR的反应条件如下：①预变性:95℃(5min)；②扩增：95℃(20sec)，56℃(30sec)，72℃(1min)，共45个循环；③延伸：72℃(3min)，4℃(∞)。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤5中，对步骤4后得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤5中去磷酸化的反应条件如下：①去磷酸化:37℃(40min)；②SAP酶灭活：85℃(5min)，4℃(∞)。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤6具体包括用特定CpG位点的-UEP对步骤5后得到的脱磷酸片段进行单碱基延伸，从而检测出甲基化程度。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤6中单碱基延伸的反应条件如下：①预变性:94℃(30sec)；②扩增内循环:52℃(5sec)，80℃(5sec)，共5个循环；③扩增外循环:94℃(5sec)，52℃(5sec)，80℃(5sec)，共40个循环；④延伸：72℃(3min)，4℃(∞)。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤7具体包括如下步骤：
S1:在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干分钟；
S2:向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加ddH20，用封口膜密封，进行瞬时离心；
S3:打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；
S4:将样本树脂混合物摇勾，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。
进一步的，上述一种飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，所述步骤8中，对步骤7中得到的原始结果进行解读；根据产出的数据表格中的信噪比(SNR-1、SNR-2)，经过计算，得到样本甲基化位点的甲基化程度。计算公式为：SNR-C/(SNR-C+SNR-T)。
本发明与以往技术相比，具有以下优点：通过本发明，可以基于MassARRAY平台，实现同时针对多个不同位置的特定的CpG位点甲基化程度的检测，并且可以得到待检测CpG位点单独的甲基化程度结果，结果更准确，实验成本大大降低。
附图说明
图1：MassARRAY iPLEX检测方法的简要实验流程及原理图；
图2：原始结果的峰图，待检测CpG位点中，C的信噪比较高，结果经计算后甲基化程度偏高；
图3：原始结果的峰图，待检测CpG位点中，T的信噪比较高，结果经计算后甲基化程度偏低；
图4：原始导出结果，其中的信噪比经过计算得出位点相应的甲基化程度。
实施例
1、下述技术流程中，如无特殊说明，均为通用检测方法。为方便说明，我们举例进行阐述。
2、下述技术所使用的的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从正常商业途径得到。
3、实施例中的样本为人源，血液经过百泰克磁珠法全血基因组提取试剂盒(型号AU18016)提取后，获得实验用DNA。
4、待检测的CpG位点选择：cg03915055、cg15989608、cg19226017、cg19554255、cg25114611、cg01616956、cg09994445、cg16779463针对所选位点设计特异性探针：
5、在UCSC网站查到所选CpG位点的基因位置，上游下游各扩展200bp，获取待检测位点对应序列。针对选取的待检测CpG位点，设计特异性PCR引物和单碱基延伸引物，具体序列组成如下表1，序列编号从SEQ ID NO：1开始：
表1引物序列表
具体实施方式
本实验流程见附图1。
方便起见，实验所需要的试剂汇总如下：EZ DNA Methylation Gold kit(ZYMO)、ddH2O、PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq Polymerase、SAP Buffer、Shrimp AlkalinePhosphatase Enzyme、iPLEX Buffer Plus、iPLEX Termination Mix、iPLEX Enzyme。
(1)本发明的检测方法样本类型来源广泛，如血液、组织、细胞等，可以高效进行基因组DNA提取制备，用于定量甲基化检测。
(2)DNA的CT处理：
I、反应体系
Reagent
Volume for CT Conversion Reagent
ddH2O
9mL
M-Dilution Buffer
3mL
M-Dissolving Buffer
500μL
II、反应程序
温度
时间
循环数
98℃
10min
1
64℃
30min
5
4℃
∞
1
(3)扩增目的片段：
I、反应体系引物见引物表1 PCR引物对序列
组分
5ul反应体系加入量(ul)
ddH<sub>2</sub>O
1.8
10×PCR Buffer
0.5
2.5mM MgCl<sub>2</sub>
0.4
10mM dNTPs
0.1
Taq Polymerase(5U/ul)
0.2
引物mix
1
DNA模板
1
II、反应程序
(4)SAP消化
I、反应体系
II、反应程序
温度
时间
循环数
37℃
40min
1
85℃
5min
1
4℃
∞
1
(5)单碱基延伸
I、反应体系引物见引物表1单碱基延伸引物
组分
5ul反应体系加入量(ul)
ddH<sub>2</sub>O
0.5949
10×iPLEX Buffer Plus
0.2
iPLEX Termination Mix
0.22
引物mix
0.94
iPLEX Enzyme
0.0451
II、反应程序
(6)飞行质谱检测
I、在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干分钟；
II、向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加ddH20,用封口膜密封，进行瞬时离心；
III、打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；
IV、将样本树脂混合物摇勾，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。
(7)结果分析和判读
V、根据C位点的信噪比以及T位点的信噪比，经过计算，得出相关位点的定量甲基化结果，如图2-4所示。
上述实施例的结果表明，本发明公布的飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法，可以基于MassARRAY平台，实现同时针对多个不同位置的特定的CpG位点甲基化程度的检测，并且可以得到待检测CpG位点单独的甲基化程度结果，减少实验成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>博淼生物科技（北京）有限公司
<120>飞行时间质谱多重靶向DNA甲基化位点定量检测方法
<160>32
<170>PatentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
acgttggatg gtgatagaga attttgtttg g 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
acgttggatg aaaaaaaa aattcctcccc 29
<210>3
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
acgttggatg ctactttaaa atcattaccc 30
<210>4
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 4
acgttggatg gggtaataaa gggattggg 29
<210>5
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 5
acgttggatg gtgtttgaag atgttggaga 30
<210>6
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<400> 6
acgttggatg aaccttacna tcctcttc 28
<210>7
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 7
acgttggatg ccaaacctat actacctacc 30
<210>8
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 8
acgttggatg gggatgtttt gtgtttggag 30
<210>9
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 9
acgttggatg aatatcccta tcacaacctc 30
<210>10
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 10
acgttggatg tttttttttg atgtttgaaa 30
<210>11
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 11
acgttggatg tgggtaggga gtagagtatg 30
<210>12
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 12
acgttggatg acccactcca aaccaaatcc 30
<210>13
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 13
acgttggatg aaaaaaaaaa ttcctcccc 29
<210>14
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<400> 14
acgttggatg gtgatagaga attttgtttg g 31
<210>15
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<400> 15
acgttggatg caatacaaaa atcaacacac 30
<210>16
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 16
acgttggatg tataaggatt tngagagag 29
<210>17
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> 17
aaaaattcct ccccttcccc 20
<210>18
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> 18
gtttgggaag gttggatgtt 20
<210>19
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<400> 19
accttacaat cctcttcttc ctc 23
<210>20
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 20
gtttggagag tgttaggata gg 29
<210>21
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<400> 21
tttttttgat gtttgaaatt tgtt 24
<210>22
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<400> 22
tccataataa cacaaaccca tatac 25
<210>23
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<400> 23
tatagttttt tgtagaagga ttttg 25
<210>24
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<400> 24
aggatttaga gagagaatat tatgat 26
<210>25
<211>85
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (59)..(25)
<223> k为g或a
<400> 25
gtgatagaga attttgtttg gttgtttaaa tatagttttt tgtagaagga ttttgcgttk 60
ggggaagggg aggaattttt ttttt 85
<210>26
<211> 83
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (50)..(32)
<223> k为c或t
<400> 26
gggtaataaa gggattgggg taggggaggc gtttgggaag gttggatgtt kgtttttttt 60
atagggtaat gattttaaag tag 83
<210>27
<211> 100
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (75)..(24)
<223> k为g或a
<400> 27
atgtttgaag atgttggaga ttatttaggt tttagacgat aatgatacgg aggttattat 60
ggtcgatggc ggggtkgagg aagaagagga tcgtaaggtt 100
<210>28
<211> 83
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (34)..(48)
<223> k为c或t
<400> 28
gggatgtttt gtgtttggag agtgttagga taggkgggga ggagtggttt cgggaaaggt 60
tttggtaggt agtataggtt tgg 83
<210>29
<211> 71
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (26)..(44)
<223> k为c或t
<400> 29
tttttttttg atgtttgaaa tttgttkgtg attttaggtt agtgattgtt cgaggttgtg 60
atagggatat t 71
<210>30
<211> 93
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (50)..(42)
<223> k为g或a
<400> 30
tgggtaggga gtagagtatg gtaagatttt agacggtttt aagtattcgg kgtatatggg 60
ttcgcgttat tatggatttg gtttggagtg ggt 93
<210>31
<211> 85
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (55)..(29)
<223> k为c或t
<400> 31
gtgatagaga attttgtttg gttgtttaaa tatagttttt tgtagaagga ttttgkgttc 60
ggggaagggg aggaattttt ttttt 85
<210>32
<211> 96
<212> DNA
<213> artificial
<221> misc_feature
<222> (30)..(65)
<223> k为c或t
<400> 32
tataaggatt tcgagagaga atattatgat kggtatttgt aatttttgtt tatatttata 60
agaattgaat gttttcgtgt gttgattttt gtattg 96