一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性scar分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用
阅读说明：本技术 一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性scar分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用 (Specific SCAR molecular marker, primer group, kit, identification method and application thereof for sex identification of pedunculate herpetospermum ) 是由 赵琦 谢坤 王宇成 赵锋 詹文瑶 于 2021-01-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用,属于植物分子遗传学技术领域,波棱瓜是以种子为药用材料的雌雄异株植物,波棱瓜雌株的利用价值更大,在开花前采用形态学和生理学方法很难分辨性别,本发明利用RAPD和SCAR分子标记技术研究与波棱瓜性别研究相关的分子标记；在确立波棱瓜RAPD扩增最佳反应体系的基础上,找到了雌性相关的分子鉴定标记,该SCAR分子标记仅在雌性单株稳定扩增一条大小为423bp的特异条带；本发明获得的1个与雌性性别相关的SCAR分子标记实现了对不同性别波棱瓜的快速、准确的鉴定,将用于鉴定苗期性别未知的植株以及大规模种质材料的检测。(The invention discloses a specific SCAR molecular marker, a primer group, a kit, an identification method and application thereof for sex identification of herpetospermum pedunculosum, belonging to the technical field of plant molecular genetics.A herpetospermum pedunculosum is a female and male heterotrophic plant taking seeds as medicinal materials, the utilization value of female herpetospermum pedunculosum is higher, and the sex is difficult to distinguish by adopting morphological and physiological methods before flowering; on the basis of establishing an optimal reaction system for amplification of the herpetospermum pedunculosum RAPD, a molecule identification mark related to females is found, and the SCAR molecule mark only stably amplifies a specific band with the size of 423bp in a female single plant; the 1 SCAR molecular marker related to female sex obtained by the invention realizes the rapid and accurate identification of the herpetospermum pedunculosum of different sexes, and can be used for identifying plants with unknown sex at the seedling stage and detecting large-scale germplasm materials.)
技术领域
本发明属于植物分子遗传学技术领域，具体涉及一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用。
背景技术
波棱瓜(Herpetospermum pedunculosum(Ser.)C.B.Clarke)，藏语称色尔格美多，属葫芦科波棱瓜，属一年生攀援草本植物，主产青藏高原东部的四川、云南、西藏等地海拔2300-3500m高海拔地区，其干燥成熟的种子含丰富的脂肪酸、木脂素、多糖、氨基酸和微量元素，具有清热解毒、柔肝的功能，尤其是所含的木脂素类化合物能够明显降低免疫性肝损伤，在现代医学中主要应用于抗乙型肝炎的治疗中。鉴于波棱瓜在肝病治疗中的独特疗效，国内外对其各方面应用的研究日益增多，以往对有关波棱瓜的研究主要集中在组织培养、栽培技术及具体活性成分的提取、分离纯化及药用功能研究等方面。波棱瓜是以种子为药用材料的雌雄异株植物，在生产实践中，为了提高波棱瓜资源利用率，节约人力、物力、土地等资源，保证种子产量，雌株的经济价值要高于雄株，但开花前其性别难以分辨，关于其苗期性别的鉴定体系仍不成熟，因此，开展波棱瓜性别早期鉴定在生产实践中具有重要意义。
针对波棱瓜雌雄价值分化大、营养期间形态极其相似这一现象，为了能尽早给予人工栽培提供实践依据和技术指导，性别鉴定方法的选用显得尤为重要。目前植物性别鉴定的方法大多是以雌雄株外部形态、生理生化差异、染色体组型、同工酶图谱、特异蛋白质含量及核苷酸的差异为依据，而这些方法大多是对已成熟的个体进行性别差异研究，开花前则难以采用形态学或细胞学方法鉴定其性别。随着分子生物学的发展，基于分子标记方法不受外界环境因素影响的优点，越来越多的分子标记(如RAPD、SSR、ISSR、SRAP、AFLP等)被应用于植物的早期性别鉴定研究，尤其是特征序列扩增区域(sequence characterizedamplified regions,SCAR)标记技术，该技术衍生于RAPD分子标记，具有对反应条件不敏感、特异性高、重复性好、鉴定结果稳定可靠等优点。
因此，在人工栽培过程中，若利用与波棱瓜性别决定基因紧密连锁的分子标记(如SCAR标记)进行辅助选择，在苗期就能快速准确地分辨雌雄，这对于生产实践具有十分重要的应用价值。
发明内容
本发明旨在提供一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用，本方案的RAPD-SCAR-PCR扩增体系，最大程度确保了RAPD-SCAR-PCR扩增的稳定性，可以获得更加稳定可靠的鉴定结果，在苗期就能快速准确地分辨雌雄，提高鉴定效率。
为了达到上述的目的，本发明所采用的技术方案是：
一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记，为核苷酸序列如SEQ.ID.NO1所示的DNA分子。
一种用于扩增分子标记的鉴定波棱瓜性别的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ.ID.NO2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ.ID.NO3所示的反向引物。
一种用于波棱瓜性别鉴定的试剂盒，包括所述引物组。
一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记的鉴定方法，包括以下步骤：
1)取被测波棱瓜，提取波棱瓜叶片基因组DNA；
2)以波棱瓜叶片基因组DNA为模板，用核苷酸序列如SEQ.ID.NO2和SEQ.ID.NO3所示的引物组进行RAPD-SCAR-PCR扩增反应，得到扩增产物；
3)对扩增产物进行凝胶电泳检测；
4)观察电泳结果，如果存在423bp的目标条带，则被测波棱瓜为雌性植株；如果不存在423bp的目标条带，则被测波棱瓜为雄性植株。
进一步的，RAPD-SCAR-PCR扩增反应的反应体系每20μL包括：10×buffer2μL，浓度为10μmol/L的正向引物0.75μl，浓度为10μmol/L的反向引物0.75μl，浓度为1.25～20ng/μl的模板DNA 2μl，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶4μl，浓度为2.5mmol/L的dNTPs 1.6μl，ddH2O余量。
进一步的，RAPD-SCAR-PCR扩增程序为：预变性95℃3min；然后重复35次下述循环：95℃变性30s，35℃复性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，得到扩增产物。
进一步的，被测波棱瓜叶片选自西藏林芝地区国家级藏药材种植示范基地的新鲜、无虫斑和病斑的波棱瓜幼嫩叶片。
进一步的，步骤3)包括以下步骤：将步骤2)得到的扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后经凝胶成像分析仪观察并照相留存。
用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记或引物组或试剂盒或鉴定方法在波棱瓜性别鉴定或育种中的应用。
基于RAPD技术操作简便的优点，该分子标记技术已经成为一种常用的雌雄异株植物分子鉴定技术。但是RAPD对反应条件敏感，重复性和稳定性较差，因此建立稳定、最优的RAPD反应体系是利用RAPD分子标记进行雌雄鉴定研究的基础，本发明就波棱瓜RAPD分析的多个主要影响因素进行了优化，获得了其雌雄鉴定分析较为理想的RAPD扩增体系，最大程度确保了RAPD扩增的稳定性。
由于SCAR标记对反应条件不敏感，重复性好，不受外界环境因素影响，相较RAPD提供了更多的信息位点。将RAPD标记转化成SCAR标记进行植物早期的性别鉴定可以获得更加稳定可靠准确的鉴定结果。因此本发明首先明确了波棱瓜RAPD-SCAR-PCR反应的最佳反应体系，并在此基础成功转化了一条能稳定用于波棱瓜雌雄鉴定的与雌性相关的SCAR分子标记，该标记扩增条带仅在雌性单株中稳定出现。此外，本发明获得的SCAR分子标记后期还将广泛用于鉴定苗期性别未知的植株，并结合形态、光合生理试验进行辅助鉴定(雄株具有比雌株更高的光合效率)，确保所开发分子标记的准确可靠性。
本发明的有益效果：
本发明的分子标记、引物和反应体系可以稳定快速鉴定波棱瓜性别，在波棱瓜开花前即可分辨雌雄，对于波棱瓜早期性别鉴定、杂交育种等具有重要的意义，对波棱瓜的实践生产具有较高的指导价值。
附图说明
图1为Taq酶用量(A)，dNTPs(B)，模板DNA(C)，引物浓度(D)，循环次数(E)和退火温度(F)分别对PCR的影响(M:AL2000 DNA ladder)；
图2为RAPD引物扩增波棱瓜DNA雌雄池的扩增结果(M:AL2000 DNAladder)；
图3为RAPD引物S15(A)和S94(B)波棱瓜雌雄单株间的扩增结果(M:AL2000DNAladder)；
图4为SCAR引物HP-94在波棱瓜雌雄混样池和雌雄单样间的扩增结果(M:AL2000DNAladder；1,雌性混样池；12,雄性混样池；2-11,雌性单样；13-22,雄性单样)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。下述实施例中所述的423bp的雌性SCAR分子标记的序列为SEQ.ID.NO1。
SEQ.ID.NO1：
5'-ggatgagaccacgaattaaaaatgtctggaaaagctcgattgcgatttcgcgaggcaatcacatcgatgtaatgaaagtgagggacctacaacaatcacagaacgtcctgaataatcgacccgtttgccaagcagagtctcacgaaatcttccctctttgccttcaattacatcggaaaacgacttgtaaaccttattatggccatccctcattggttgtccgcggattccattatcaagaagtgtatccacggcttcttgtaccaatttctcctgacacattactaattctcctggcgtagatctactggttgttaatagatcaataagagtattgttccgatagataactcttctatagagttcattaatatccgagctcattagcctacccccatctatctgaatgatcggtctcatcca-3'
实施例1
1材料与方法
1.1供试材料
在西藏林芝地区国家级藏药材种植示范基地收集新鲜、无虫斑和病斑的波棱瓜幼嫩叶片作为供试材料，注明性别，采集后放入装有硅胶的自封袋中，带回实验室置冰箱中-20℃保存备用。
1.2试剂
植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-02)和Taq DNAPolymerase购自天根生化(北京)科技有限公司，聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(D1250)购自索莱宝生物科技有限公司，pBLUE-T快速克隆试剂盒(ZC204)购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，PCR引物合成和基因测序由北京擎科生物科技有限公司完成。
1.3试验方法
1.3.1DNA的提取及雌雄DNA池的构建
采用天根公司植物基因组DNA提取试剂盒提取波棱瓜叶片基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，浓度则通过NanoVue超微量分光光度计进行测定。基于混合分离群体分析法(BSA)原理，分别等量混合雌/雄种质材料的单样各10份DNA，完成雌性或雄性DNA样品池的构建。
1.3.2 RAPD反应体系的优化
以成年已知性别波棱瓜DNA为模板，依次对Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA浓度、引物浓度、循环次数以及退火温度进行波棱瓜RAPD体系的PCR优化，从而保证RAPD扩增的稳定性。RAPD引物(表1)合成自北京六合华大基因有限公司，RAPD体系优化参数见表2。
1.3.3波棱瓜雌雄DNA多态性检测及分子鉴定标记的筛选
以上述构建的雌雄两个DNA反应池为模板，根据优化后的RAPD最佳反应条件(表3)，逐一使用103条随机引物进行RAPD扩增，扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后经凝胶成像分析仪观察并照相留存。
1.3.4波棱瓜雌雄株SCAR分子标记开发与鉴定
利用索莱宝生物科技有限公司的聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(D1250)回收1.3.3的RAPD雌雄特异片段，随后该片段用pBLUE-T快速克隆试剂盒进行T克隆，经北京擎科生物科技有限公司DNA测序后设计特异性引物。以明确性别的波棱瓜雌雄植株DNA为模板，进行特异性引物PCR扩增(表4)，验证该特异条带扩增引物是否能成功转化为波棱瓜雌雄鉴定的SCAR分子标记。
表1 RAPD引物序列
表2 RAPD反应体系优化实验影响因素
表3优化后RAPD反应体系
表4 RAPD-SCAR反应体系
2结果与分析
2.1 RAPD反应体系的优化
经预实验研究发现以波棱瓜基因组DNA为模板，S15为引物的RAPD图谱条带较丰富且清晰，而同一引物、同一模板，由于反应体系的不同，会造成扩增带型上的极大差异，因此以此反应为研究对象进行RAPD优化实验(图1)。Taq DNA聚合酶的浓度直接影响扩增的结果，过高会有小片段产生，过低则产物少，条带弱，图1A中所示4μl，6μl，8μl的Taq酶(5U/μl)扩增产物明显，因此从节约成本角度出发选择酶浓度4μl。dNTPs作为PCR反应中的底物，终浓度过高会增加与Taq DNA聚合酶错配的机率，从图1B可以看出，当体积为1.6μl时条带清晰且可重复，因此1.6μl的dNTPs(2.5mmol/L)浓度最佳。模板DNA浓度过低时，扩增的条带不稳定甚至扩增不出条带。图1C所示稀释10倍的模板DNA(浓度为1.25～20ng/μl的模板DNA 2μl)开始能扩增出稳定的条带。引物浓度作为影响PCR反应的重要因素之一，浓度过低会无法扩增出条带，过高则会非特异扩增出模糊小片段和引物二聚体。在引物(10μmol/L)为1.5μl时即可扩增出稳定清晰的条带(图1D)，所以初步将1.5μl作为波棱瓜RAPD反应体系引物最佳体积。在RAPD反应中，PCR扩增循环次数过少，则反应生成产物少，条带不明显。图1E结果显示，当只进行25次循环时，反应合成产物明显低于其他4个条件，而35次循环开始，条带亮度及数量无明显差异，为提高机器利用率，选择35次循环。RAPD所用的引物长度通常为10bp，因此退火温度不高于40℃，图1F中32℃，35℃更为清晰，而高温可减少引物与模板间的非特异性结合，因此35℃优于32℃。
综合以上分析结果，确定波棱瓜RAPD-SCAR-PCR扩增反应的反应体系每20μL包括：10×buffer 2μL，浓度为10μmol/L的正向引物0.75μl，浓度为10μmol/L的反向引物0.75μl，浓度为1.25～20ng/μl的模板DNA2μl，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶4μl，浓度为2.5mmol/L的dNTPs 1.6μl，ddH2O余量。最佳的RAPD扩增程序为：预变性95℃3min；然后重复35次下述循环：95℃变性30s，35℃复性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。
2.2波棱瓜雌雄DNA多态性检测及分子鉴定标记的筛选
以波棱瓜雌雄混合池基因组DNA为模板，以上述优化后的RAPD最佳反应条件逐一使用103条随机引物进行RAPD扩增，进行雌雄株分子鉴定标记的筛选。通过RAPD扩增图谱分析，共筛选到了2条潜在的分子鉴定标记(图2)。从图2可以看出引物S15和S94结合下的RAPD结果所指的条带有可能是雌雄分子鉴定标记的序列，而且经雌雄单样PCR验证发现分子标记鉴定结果与雌雄混合池PCR结果一致(图3)，说明了引物S15和S94扩增稳定性高。
2.3波棱瓜性别的SCAR分子标记开发与鉴定
采用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒回收上述引物S15和S94扩增的雌雄特异条带，经T载体克隆、测序后分别得到相关序列并进行分析(由于S15扩增条带后续SCAR标记转化失败，故主要针对S94分子标记进行分析)。将S94雌性特异条带核酸序列通过NCBI核酸数据库应用BLASTn检索未见同源序列。为了将S94标记转化为更加稳定的SCAR分子标记，利用Primer5引物设计软件设计了该特异条带的特异性扩增引物，正向引物序列为ggatgagaccgcgcatg；反向引物序列为gatgagacctgttgcacgag。用这对引物对波棱瓜雌雄植株的DNA进行PCR扩增，得到了一条423bp的雌性SCAR分子标记，而在所有10株雄性个体中无此相应的条带(图4)。因此，本发明得到的S94 SCAR分子标记(SEQ.ID.NO1)可以完成对波棱瓜雌雄株的鉴别，显示了所开发的SCAR标记具有良好的雌雄区分能力。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
序列表
<110> 成都大学
<120> 一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性SCAR分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatgagacc acgaattaaa aatgtctgga aaagctcgat tgcgatttcg cgaggcaatc 60
acatcgatgt aatgaaagtg agggacctac aacaatcaca gaacgtcctg aataatcgac 120
ccgtttgcca agcagagtct cacgaaatct tccctctttg ccttcaatta catcggaaaa 180
cgacttgtaa accttattat ggccatccct cattggttgt ccgcggattc cattatcaag 240
aagtgtatcc acggcttctt gtaccaattt ctcctgacac attactaatt ctcctggcgt 300
agatctactg gttgttaata gatcaataag agtattgttc cgatagataa ctcttctata 360
gagttcatta atatccgagc tcattagcct acccccatct atctgaatga tcggtctcat 420
cca 423
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatgagacc gcgcatg 17
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgagacct gttgcacgag 20