光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用
阅读说明：本技术 光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用 (Preparation of light-controlled spiropyran monolithic column and application of light-controlled spiropyran monolithic column in cell metabolite detection ) 是由 汪夏燕 裴彤 刘珍 邵云龙 李利杰 郭广生 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用,属于分析化学与生物化学领域。该系统包括：光控螺吡喃整体柱的制备、光控单元的搭建及高效液相色谱与质谱联用系统。将丙烯酰基螺吡喃、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、致孔剂按比例配成有机预聚合溶液,然后向活化及烷基化后的毛细管内注入螺吡喃预聚合溶液。在一定水浴温度下引发热聚合制备光控螺吡喃整体柱,该整体柱具有光控极性转换特性；通过将整体柱接入液质联用系统中可实现在可见光与紫外光先后照射下整体柱极性转变进而对A549细胞代谢物分离与检测,最终在可见光条件下实现对A549细胞中能量分子如ATP、ADP的检测,紫外光下三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性检测。(The preparation of light-operated spiropyran monolithic column and its application in cell metabolite detection belong to the field of analytical chemistry and biochemistry. The system comprises: the preparation of the light-operated spiropyran monolithic column, the construction of a light-operated unit and a high performance liquid chromatography and mass spectrometry combined system. Proportionally preparing acryloyl spiropyran, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) and a pore-foaming agent into an organic prepolymerization solution, and then injecting the spiropyran prepolymerization solution into the activated and alkylated capillary. Initiating thermal polymerization at a certain water bath temperature to prepare a light-controlled spiropyran monolithic column, wherein the monolithic column has a light-controlled polarity conversion characteristic; the polarity of the whole column is changed under the sequential irradiation of visible light and ultraviolet light by connecting the whole column into a liquid chromatography-mass spectrometry system, so that the metabolite of the A549 cell is separated and detected, and finally, the detection of energy molecules such as ATP and ADP in the A549 cell and the selective detection of tricarboxylic acid cycle intermediates and pentose phosphate cycle intermediates under the ultraviolet light are realized under the condition of visible light.)
技术领域
本发明涉及一种光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用，属于分析化学与生物化学领域。
背景技术
代谢组学是继基因组学、转录组学与蛋白质组学后又一新兴领域，主要通过对代谢物的定性与定量分析，实现对生物体体内动态水平的监控。色谱技术因其具有较强的分离能力被广泛的用于代谢物的分离。可以根据代谢物的种类不同，可以选择不同的分离方法。通常情况下，反相液相色谱适用于分离非极性及弱极性代谢物，亲水作用色谱适用于分离极性较强的代谢物。然而到目前为止，还没有一种单一的色谱柱能够实现对样品中全极性的代谢物的分离。因此，由于分离不充分而带来的离子抑制效应将不可避免对微量代谢物的检测产生影响。
螺吡喃化合物是指一个带有SP3碳原子相连接的芳香环，通过SP3碳原子与另一个吡喃环相连接的一类具有光致变色性质的有机化合物的统称。在紫外光照射下，螺吡喃分子发生闭环体与开环体之间的可逆转变，伴随化合物极性、颜色与荧光性质发生改变。利用螺吡喃化合物的这一性质结合荧光显微镜与紫外分光光度计等仪器，可以实现含S、F等亲核性较强的代谢物的高灵敏度、高选择性检测。然而，利用螺吡喃分子制备毛细管整体柱，通过光控快速改变整体柱极性进而实现在一次进样中先后分离检测不同极性的细胞代谢物的技术尚未见报道。
发明内容
本发明制备了光控螺吡喃整体柱并用于A549细胞代谢物的检测。基于螺吡喃化合物在不同波长光照条件下，分子本身发生闭环体与开环体的可逆转变，从而对不同极性的代谢物分子进行选择性的吸附与分离。应用此系统实现在可见光下对A549细胞内能量分子如ATP、ADP等的分离检测，紫外光下实现对三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性分离检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种光控螺吡喃整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以1，4-丁二醇、异丙醇、氯仿为制孔剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)、丙烯酰基螺吡喃为单体，制孔剂、单体并加入引发剂，注入到烷基化后的毛细管中并在50-70℃水浴下引发热聚合，制备光控丙烯酰基螺吡喃整体柱；
使用的丙烯酰基螺吡喃单体的合成过程如下：①取2，3，3-三甲基吲哚(1.0eq)，2-溴乙醇(1.2eq)加入到盛有无水乙腈的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流24h，冷却至室温，旋干剩余溶剂，粗产物在乙醚：三氯甲烷体积比＝1：1的溶液中重结晶，得到粉红色固体产物1；②取产物1(1.0eq)溶于盛有超纯水的圆底烧瓶中，在冰浴条件下，加入KOH(1.6eq)，待溶液变成黄色，在室温下搅拌30min，使用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得黄色油状产物2；③取产物2(1.0eq)于盛有溶解在无水乙醇中的5-硝基水杨醛(1.3eq)的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流4h，冷却至室温，过滤，使用乙醇清洗，干燥，得到紫红色固体产物3；④取产物3(1.0eq)于盛有二氯甲烷的三颈烧瓶中，滴加溶解在二氯甲烷中的丙烯酰氯(1.3eq)室温搅拌6h，反应结束后用水进行洗涤，收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，使用乙酸乙酯：正己烷体积比＝1：5作为流动相过柱，收集Rf值为0.7的组分。
整体柱制备时，其单体与制孔剂的质量比例为1：2；单体EDMA与丙烯酰基螺吡喃的质量比例为1：1，制孔剂1，4-丁二醇，异丙醇、氯仿的质量比例为5：5：10，使用的引发剂为偶氮二异丁腈，聚合时间为5～7h。
使用的毛细管的规格为内径50～100μm，外径160～360μm，外表面有聚乙烯涂层。
所述制备的光控螺吡喃整体柱在细胞代谢物检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、细胞代谢物样品的制备：将培养A549细胞的6孔板置于冰上，加入萃取溶剂后移至冰箱-20℃放置5min对细胞内的代谢物进行萃取，使用细胞刮刀将细胞从壁上刮下，转移细胞悬浮液至离心管中，离心(12000rpm，4℃，10min)，收集上层清液于离心管中待用。
步骤二、细胞代谢物的可见光分离检测：将制备的光控螺吡喃整体柱，搭建高效液相色谱质谱系统，利用光控螺吡喃整体柱在可见光照射300s后进行可见光下A 549细胞代谢物的分离与检测；
步骤三、细胞代谢物的紫外光分离检测：对进行过步骤二的光控螺吡喃整体柱进行紫外光照240s(λ＝365nm,2x 6W)后，进行A 549细胞代谢物的分离与检测。
步骤一中A 549细胞接种于6孔板时，细胞密度为3×105/孔。
步骤一中接种后的细胞要在37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养48h。
步骤一中进行A549细胞萃取时，萃取溶剂为异丙醇。
步骤二与步骤三中，使用的光控螺吡喃整体柱与液质联用系统联用：包括进样系统、压力系统、分离系统与检测系统等4部分组成；将盛有代谢物的进样瓶置于4℃的样品台上，进样体积为1μL，在流动相的驱动下将样品引入光控螺吡喃整体柱中进行代谢物的分离，在整体柱出口端连接弹性石英毛细管等内径喷针，实现纳升流速样品的电喷雾电离，在质谱正离子模式下进行检测。
步骤二与步骤三中，使用的流动相为体积比为1:1的甲醇/水溶液。
步骤二与步骤三中使用的流速为0.15μL/min。
步骤二中的可见光采用白炽灯(2x 6W)，步骤三中的紫外光采用365nm紫外灯(2x6W)。
采用双光源对向辐照设计，保证整体柱全方位均匀受光。
本发明可以获得如下效果：
本发明制备了光控螺吡喃整体柱，并用于A549细胞代谢物的分离检测。该系统中，采用该方法在可见光下实现了对A549细胞中能量分子的检测，紫外光下可以选择性的检测到三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体。将分离不同种类的代谢物，有效的降低了离子抑制效应对检测微量代谢物的影响，是一种分离与检测代谢物中微量物质的良好方法。与传统液质联用方法相比在实现小体积进样的同时利用切换整体柱的极性实现对更多种类代谢物的检测。
本发明中使用丙烯酰基螺吡喃整体柱在紫外光下螺吡喃化合物由闭环体经C-O键异裂，电子组态发生异构化或重排变成开环体部花菁，形成一个大的共轭平面的过程，使得极性发生改变从而实现对细胞中氨基酸、脂质、核酸的选择性和特异性吸附，达到分离检测的目的。
利用本发明中的光控螺吡喃整体柱-液质联用系统对A549细胞代谢物进行分离、检测，分析检测数据得，利用该系统在可见光下根据颜色不同实现对A549细胞中能量分子的分离检测，紫外光下根据颜色不同实现三羧酸循环中间体、戊糖磷酸循环中间体的选择性分离检测。
附图说明
图1是光控螺吡喃整体柱-液质联用系统联用示意图。
图2是可见光与紫外光照射后丙烯酰基螺吡喃的接触角变化情况。
图3是异丙醇：1，4-丁二醇：氯仿在5：5：10的比例下聚合不同时间的毛细管整体柱端面的扫描电镜图。
图4不同条件下，光控螺吡喃整体柱-液质联用系统检测到代谢物的种类。
1.高效液相色谱，2.光控单元，3.弹性石英毛细管等内径喷针，4.质谱，5、8.365nm紫外灯(2x6 W)，6、9.白炽灯(2x6 W)，7.光控螺吡喃整体柱。
具体实施方式
为了使本领域人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供的一种光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用，具体实施步骤如下：
S1.制备整体柱使用的丙烯酰基螺吡喃合成过程如下：①取2，3，3-三甲基吲哚(1.0eq)，2-溴乙醇(1.2eq)加入到盛有10mL无水乙腈的三颈烧瓶中，氮气保护下，回流24h，冷却至室温，旋干剩余溶剂，粗产物在5mL的乙醚：三氯甲烷(v:v)＝1：1的溶液中重结晶，得到粉红色固体产物1；②取产物1(1.0eq)加入盛有适量的超纯水的圆底烧瓶中，在冰浴条件下，加入KOH(1.6eq)，待溶液变成黄色，在室温下搅拌30min，使用乙酸乙酯进行萃取，无水硫酸钠干燥，有机相浓缩得黄色油状产物2；③取产物2(1.0eq)于盛有溶解在无水乙醇中的5-硝基水杨醛(1.3eq)的三颈烧瓶中，氮气保护下回流4h，冷却至室温，过滤，使用乙醇清洗，干燥，得到紫红色固体产物3；④取产物3(1.0eq)于盛有5mL二氯甲烷的三颈烧瓶中，使用恒压滴液漏斗缓慢滴加溶解在二氯甲烷中的丙烯酰氯(1.3eq)室温搅拌6h，反应结束后用水进行洗涤，收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，使用乙酸乙酯：正己烷＝1：5(v:v)作为流动相过柱，收集Rf值为0.7的组分。
S2.毛细管的修饰：取内径75μm、外径360μm，15cm长的熔融石英毛细管，分别用1.0mol/L NaOH冲洗内壁1h，超纯水冲洗至末端流出液体pH接近7，然后用使用CH3OH冲洗毛细管30min，再用氮气吹干。处理后的毛细管注入γ-MAPS：CH3OH(v/v＝3：7)的混合溶液在40℃下反应14h。反应结束后用甲醇冲洗毛细管内剩余的γ-MAPS，使用N2吹干毛细管，得到修饰后的毛细管。
S3.热聚合的方法制备光控螺吡喃整体柱
准确称量0.0302g 1,4-丁二醇、0.0298g异丙醇、0.0603g三氯甲烷配置三元致孔剂溶液，质量比为1:1:2，加入0.0453g丙烯酰基螺吡喃单体、0.0451g EDMA、0.0013g偶氮二异丁腈对有机预聚合溶液进行充分震荡、超声脱气后将其注入到烷基化的毛细管内，使用硅胶将两端封堵；再将注入有机预聚合溶液的毛细管放入水浴锅内通过升高温度引发偶氮二异丁腈(2,2'-Azobis(2-methylpropionitrile),AIBN)发生自由基反应进行热聚，热聚合时间为7h。在热聚合反应结束后，使用甲醇冲洗毛细管终止反应并除去未反应的溶液。在每次使用前，均需要用甲醇冲洗活化该光控螺吡喃整体柱。本实施例制备的光控丙烯酰基螺吡喃整体柱的异丙醇：1，4-丁二醇：氯仿质量比为5：5：10比例下的毛细管整体柱端面的扫描电镜图如图3所示
S4.A549细胞代谢物的提取实验：
取指数生长期的A549细胞以1×105个/孔，3×105个/孔，5×105个/孔的细胞密度接种于6孔板上，每个孔内加入2mL的细胞悬浮液，0.5mL的细胞培养基，培养48h。使用生物显微镜对培养48h后的细胞生长状态进行表征。当细胞密度为1×105个/孔，培养48h后，6孔板内的细胞较为稀疏，贴壁率仅为60％；当细胞密度为3×105个/孔，培养48h后，6孔板内的细胞生长状态良好，贴壁率较高可达90％；当细胞密度为5×105个/孔，培养48h后，6孔板内的细胞贴壁率较高，出现双层现象，细胞形态较差，故将6孔板上细胞接种密度定为3×105个/孔。使用PVC细胞计数管计数当接种密度为3×105个/孔、培养48h后，细胞体积为8μL，因此，加入130μL的异丙醇进行A549细胞内代谢物的萃取。
在6孔板上接种细胞，培养24h后，将6孔板置于冰上，使用PBS清洗细胞3次，加入130μL的异丙醇进行细胞内代谢物的萃取，使用刮刀将细胞从6孔板中刮下，转移至离心管中，在4℃下，离心15min，取上清液进行光控螺吡喃整体柱-液质联用分离检测。
S5.A549细胞代谢物可见光分离检测实验
将盛有代谢物的进样小瓶置于4℃的样品台上，通过进样针吸取1μL的样品，使用甲醇：水(v/v)＝50:50为流动相，对萃取得到的细胞内代谢物进行分离，在可见光照射300s后，整体柱为无色的状态，在ESI正离子模式下进行代谢物检测，在可见光状态下检测到57种代谢物。
S6.A549细胞代谢物紫外光分离检测实验
同上述相同条件：甲醇：水(v/v)＝50:50为流动相，流速为0.15μL/min，对萃取得到的细胞内代谢物进行分离，整体柱进行紫外光照240s(λ＝365nm,2x6 W)后，整体柱呈现紫色状态，对进行A 549细胞代谢物的分离与检测；紫外状态下检测到代谢物的种类最多为83种。
利用上述搭建的光控螺吡喃整体柱-液质联用系统检测A549细胞代谢物发现在紫外状态下检测到代谢物的种类最多为83种，其中有33种代谢物仅在紫外光光照射下被检测，可见光状态下检测到的代谢物的种类为57种，其中，有8种化合物只在可见光状态下被检测到，采用直接进样检测到的代谢物种类最少，为46种；(2)多数氨基酸在三种状态下均能被检测，使用可见光照射整体柱检测到的氨基酸种类最多；(3)氨基酸衍生物、胺类、碱类、有机酸与糖类代谢物在适合在紫外照射下进行分离检测；(4)三羧酸循环中间体、戊糖磷酸途径中间体、葡萄糖相关代谢物以及杂环代谢物都只能在紫外照射条件下被检测到；(5)能量分子如ATP、ADP等只能在可见光条件下被检测到。结果说明，螺吡喃整体柱在紫外与可见光照射下，分别与不同的代谢物选择性作用，进而实现在紫外与可见光照射下对不同代谢物的分离检测。
以上对本发明实施例所提供的一种光控螺吡喃整体柱的制备及在细胞代谢物检测中的应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的实施方式及所得产品的应用进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，均属于本发明的保护范围；综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
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