具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；木香烃内酯(纯度﹥98％)、去氢木香内酯(纯度﹥98％)、苍术素(纯度﹥98％)，均购自成都曼思特生物科技有限公司；超纯水(Milli-Q纯水仪自制)。

正气片，由上海和黄药业有限公司提供，共10批次正气片，批号见下表2。

表2正气片批号

单味药材：广藿香油、紫苏叶油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜由上海和黄药业有限公司提供，均为常规使用的中药材，可从市场上购买获得

2、仪器

7890A气相色谱仪(USA Agilent Co.ltd)；Milli-Q纯水仪(美国MilliporeCo.ltd)；AL204 型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo Co.ltd)；SB-5200-DTD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

本发明所提供的一种正气片的气相指纹图谱的检测方法的过程如下：

1、样品前处理

供试品溶液的制备：精密称取正气片粉末10g，置于50mL的EP管中，精密加入无水乙醇15-25ml，称定重量，密塞封闭后用超声波仪超声提取20-40min，再次称重，用无水乙醇补足减失的重量，在2000-4000r/min下离心15-25min，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素对照品，置于容量瓶中进行逐级稀释。即先加入无水乙醇溶解并在容量瓶中定容摇匀，得到对照品储备溶液，对照品储备溶液中各成分的浓度均为0.5mg/mL，对照品储备溶液的储存温度为0-5℃。再将对照品储备溶液加入无水乙醇稀释并定容，配成所需对照品溶液，对照品溶液中各成分的浓度均为50-200μg/mL。

2、色谱条件

所述气相色谱法的色谱检测条件为：色谱柱为Agilent HP-5色谱柱(30m×0.32mm, 0.25μm)；检测器为火焰离子化检测器(FID)；样口温度为260-300℃；进样量为1-5μL；载气为高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速为0.5-2.0mL/min；进样方式为分流进样，分流比为20-40:1；采用的升温程序为：初始温度为118-122℃保持1-3min，以1-3℃/min的速率升温至128-132℃，保持1-3min；以1-3℃/min的速率升温至158-162℃，保持1-3min；以 1-3℃/min的速率升温至198-202℃，保持1-3min；以1-3℃/min的速率升温至218-222℃，保持1-3min；以1-3℃/min的速率升温至238-242℃，保持4-6min。

3、测定

采用上述步骤2中的色谱条件的气相色谱法分别测定上述步骤1中供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的气相指纹图谱和对照品溶液的气相指纹图谱。其中，所述供试品溶液的气相指纹图谱，要与对照品溶液的气相指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的气相指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的气相指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液的气相指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得正气片的气相指纹图谱。

本发明所提供的一种正气片的质量检测方法的过程如下：

包括采用前述正气片的气相指纹图谱的检测方法获得正气片的气相指纹图谱，将得到的正气片的气相指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准气相指纹图谱进行相似度比较。

具体来说，本发明将测得的正气片的气相指纹图谱与正气片的标准气相指纹图谱进行相似度的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件进行比较。本发明测得的正气片的气相指纹图谱与正气片的标准气相指纹图谱的相似度≥ 0.95。

正气片的标准气相指纹图谱包括15个共有指纹峰，以8号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.000)，其他14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.243±0.002)、2号峰(0.532±0.003)、3号峰(0.559±0.003)、4号峰(0.790±0.004)、5号峰(0.801±0.004)、6号峰(0.812±0.004)、7号峰(0.931±0.005)、9号峰(1.115±0.005)、10号峰(1.295±0.006)、 11号峰(1.391±0.006)、12号峰(1.448±0.007)、13号峰(1.753±0.008)、14号峰(2.045±0.010)、 15号峰(2.146±0.010)。

其中，如图1所示，所述正气片的标准气相指纹图谱与对照品溶液的气相指纹图谱进行比较，定位确定所述8号峰为苍术素的指纹峰，所述9号峰为木香烃内酯的指纹峰，所述11 号峰为去氢木香内酯的指纹峰。

本发明所提供的一种知柏地黄丸中多味药材指纹图谱的筛选方法的过程如下：

A)药材样品溶液的制备：将正气片中广藿香油、紫苏叶油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜10味药材样品中任一种或多种，按正气片的气相指纹图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得至少一种单味药材样品溶液；

B)缺样阴性样品混合溶液的制备：将广藿香油、紫苏叶油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、半夏、厚朴、生姜10味药材样品去除其中任一1味药材，加入对应质量的辅料填补，按正气片的气相指纹图谱的检测方法的步骤1)进行制备，分别获得10种缺样阴性样品混合溶液；

C)测定：采用与正气片的气相指纹图谱的检测方法的步骤3)中相同色谱条件的气相色谱法(GC)分别测定单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液，分别获得单味药材样品溶液和10种缺样阴性样品混合溶液的气相指纹图谱；

D)标准气相指纹图谱的取得：采用与正气片的气相指纹图谱的检测方法相同的步骤，得到正气片的标准气相指纹图谱；

E)质量检测：将单味药材样品溶液的气相指纹图谱、10种缺样阴性样品混合溶液的气相指纹图谱，分别与正气片的标准气相指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出单味药材样品溶液在正气片的标准气相指纹图谱中的相应特征峰，从而对单味药材样品溶液的气相指纹图谱中的特征峰进行归属定位。

步骤A)中，广藿香油与无水乙醇加入的体积之比为40：1500-2500；紫苏叶油与无水乙醇加入的体积之比为20：1500-2500；木香加入的重量(g)与无水乙醇加入的体积(mL)之比为4.5：15-25；茯苓加入的重量(g)与无水乙醇加入的体积(mL)之比为4.5：15-25；苍术加入的重量(g)与无水乙醇加入的体积(mL)之比为3.0：15-25；陈皮加入的重量(g) 与无水乙醇加入的体积(mL)之比为3.0：15-25；半夏加入的重量(g)与无水乙醇加入的体积(mL)之比为3.0：15-25；厚朴加入的重量(g)与所述无水乙醇加入的体积(mL)之比为3.0：15-25；生姜加入的重量(g)与无水乙醇加入的体积(mL)之比为3.0：15-25；甘草加入的重量(g)与所述无水乙醇加入的体积(mL)之比为1.5：15-25。

步骤E)中，见表1，广藿香油样品溶液的指纹图谱包括2个共有指纹峰，2个共有指纹峰为3号峰、5号峰；紫苏叶油样品溶液的指纹图谱包括1个共有指纹峰，1个共有指纹峰为1号峰；木香样品溶液的指纹图谱包括7个共有指纹峰，7个共有指纹峰为1号峰、2号峰、 5号峰、6号峰、9号峰、10号峰、11号峰；苍术样品溶液的指纹图谱包括11个共有指纹峰， 11个共有指纹峰为1号峰、2号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、12号峰、13 号峰、14号峰、15号峰；厚朴样品溶液的指纹图谱包括3个共有指纹峰，3个共有指纹峰为 2号峰、4号峰、13号峰；生姜样品溶液的指纹图谱包括1个共有指纹峰，1个共有指纹峰为2号峰；甘草样品溶液、茯苓样品溶液、陈皮样品溶液、半夏样品溶液的指纹图谱不包括共有指纹峰。

实施例1

1、样品前处理

供试品溶液的制备：精密称取正气片粉末10g，置于50mL的EP管中，精密加入无水乙醇20ml，称定重量，密塞封闭后用超声波仪超声提取30min，再次称重，用无水乙醇补足减失的重量，在3000r/min下离心20min，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯、苍术素对照品，进行逐级稀释。即先将对照品各5mg置于10mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解并在容量瓶中定容摇匀，得到对照品储备溶液，对照品储备溶液中各成分的浓度均为0.5mg/mL，对照品储备溶液的储存温度为4℃。再将对照品储备溶液加入无水乙醇稀释并定容，配成所需对照品溶液，对照品溶液中各成分的浓度均为100μg/mL。

2、色谱条件

所述气相色谱法的色谱检测条件为：色谱柱为Agilent HP-5色谱柱(30m×0.32mm, 0.25μm)；检测器为火焰离子化检测器(FID)；样口温度为280℃；进样量为2μL；载气为高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速为1.0mL/min；进样方式为分流进样，分流比为30:1；采用的升温程序为：初始温度为120℃保持2min，以2℃/min的速率升温至130℃，保持2min；以2℃/min的速率升温至160℃，保持2min；以2℃/min的速率升温至200℃，保持2min；以2℃/min的速率升温至220℃，保持2min；以2℃/min的速率升温至240℃，保持5min。

3、测定

采用上述步骤2中的色谱条件的气相色谱法分别测定上述步骤1中供试品溶液和对照品溶液，获得供试品溶液的气相指纹图谱和对照品溶液的气相指纹图谱。其中，所述供试品溶液的气相指纹图谱，要与对照品溶液的气相指纹图谱进行比较，根据对照品溶液的气相指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出供试品溶液的气相指纹图谱中的相应特征峰，从而对供试品溶液的气相指纹图谱中的指标成分进行归属定位，获得正气片的气相指纹图谱。

实施例2

采用上述实施例1中建立的正气片的气相指纹图谱的检测方法对10批次正气片进行检测，获得供试品溶液的气相指纹图谱和对照品溶液的气相指纹图谱，10批次正气片的批号见表2。得到的供试品的气相指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中，与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准气相指纹图谱进行相似度比较，以正气片的气相指纹图谱与正气片的标准气相指纹图谱的相似度≥0.95 为标准，并以8号峰为参照峰(S峰，保留时间为1.000)，确定正气片的标准指纹图谱包括 15个共有指纹峰，其他14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰(0.243±0.001)、2号峰(0.532±0.001)、3号峰(0.559±0.001)、4号峰(0.790±0.002)、5号峰(0.801±0.002)、6 号峰(0.812±0.003)、7号峰(0.931±0.003)、9号峰(1.115±0.003)、10号峰(1.295±0.004)、 11号峰(1.391±0.004)、12号峰(1.448±0.004)、13号峰(1.753±0.005)、14号峰(2.045±0.006)、 15号峰(2.146±0.006)。

将上述的正气片的标准气相指纹图谱，与对照品溶液的气相指纹图谱进行比较，根据图 1中的对照品溶液的气相指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出正气片的标准气相指纹图谱中的相应特征峰，定位确定所述8号峰为苍术素的指纹峰，所述9号峰为木香烃内酯的指纹峰，所述11号峰为去氢木香内酯的指纹峰。

实施例3

采用上述实施例1中建立的正气片的气相指纹图谱的检测方法对10批次正气片进行检测，获得供试品溶液的气相指纹图谱和对照品溶液的气相指纹图谱，10批次正气片的批号见表2。得到的供试品的指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中，与相同指纹图谱检测条件下获得的正气片的标准气相指纹图谱进行相似度比较，以正气片的气相指纹图谱与正气片标准气相指纹图谱的相似度≥0.95为标准，并以S1样品为参照图谱，平均数法生成对照图谱见图1，叠加图谱见图2，确定指纹图谱中 15个共有指纹峰。其中8号峰出峰时间较为稳定适中，故选取8号为定位峰(S峰)。

通过10批次正气片获得的气相指纹图谱，计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积的比值，得到的相对保留时间和相对峰面积见表3。由表3可知，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.2％，相对峰面积的RSD在2-42％之间，说明10批次正气片样品的成分比较稳定。

表3共有峰的相对保留时间和相对峰面积

具体的正气片的标准气相指纹图谱见图1，将具体的正气片的标准气相指纹图谱，与对照品溶液的气相指纹图谱进行比较，根据图1中的对照品溶液的气相指纹图谱中的已知特征峰，通过相对保留时间，指认出正气片的标准气相指纹图谱中的相应特征峰，定位确定所述 8号峰为苍术素的指纹峰，所述9号峰为木香烃内酯的指纹峰，所述11号峰为去氢木香内酯的指纹峰。

实施例4

对本发明中的正气片的气相指纹图谱的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。

1、精密度

取170810批次的正气片样品1份，按上述实施例1中正气片的气相指纹图谱的检测方法进行检测，连续进样6次，以8号峰(苍术素)为参照峰，结果15个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积的RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。

2、重复性

取170810批次的正气片样品6份，按上述实施例1中正气片的气相指纹图谱的检测方法进行检测，以8号峰(苍术素)为参照峰，结果15个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积的RSD均小于3％，表明实验重复性良好，准确度较高。

3、稳定性

取170810批次的正气片样品1份，按上述实施例1中正气片的气相指纹图谱的检测方法，制备供试品溶液后分别放置0h、4h、8h、12h、16h、24h进行检测，以8号峰(苍术素)为参照峰，结果15个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积的RSD均小于 2％，表明样品在24h内稳定性良好。

实施例5

采用上述实施例1中正气片的气相指纹图谱的检测方法，对10批次正气片进行气相指纹图谱分析，10批次正气片的批号见表2，检测结果见图1。同时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件，进行10批次正气片样品的整体相似度评价，整体相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度，结果见表4。由表4结果显示，10批次正气片的相似度均≥0.95，表明10批次正气片的相似度良好，批间差异较小，此气相指纹图谱适用于正气片质量控制。

表4 10批次正气片相似度评价结果

实施例6

采用上述实施例1中样品前处理步骤，制备获得供试品溶液。

分别取广藿香油40μL、紫苏叶油20μL、木香4.5g、茯苓4.5g、苍术3g、陈皮3g、半夏3g、厚朴3g、鲜生姜3g、甘草1.5g，采用上述实施例1中样品前处理步骤，分别制备获得 10种单味药材样品溶液。

根据正气片处方和工艺制备缺样阴性样品，缺样阴性样品即将10味药材样品去除1味药材，各缺样阴性样品中缺少的药材由对应量的辅料如硬脂酸镁或滑石粉填补，最后重量满足正气片要求重量，从而配制10种缺样阴性样品。取10种缺样阴性样品粉末各10.0g，采用上述实施例1中样品前处理步骤，分别制备获得10种缺样阴性样品混合溶液。

采用实施例1的正气片的气相指纹图谱的检测方法中步骤2、3，分别测定供试品溶液、 10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液，分别获得供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液的气相指纹图谱。将得到的供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液的气相指纹图谱导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中进行分析处理，同时采用实施例1的正气片的气相指纹图谱的检测方法得到正气片的标准气相指纹图谱。将供试品溶液、10种单味药材样品溶液、10种缺样阴性样品混合溶液的气相指纹图谱，分别与正气片的标准气相指纹图谱进行比较，通过相对保留时间，指认出10种单味药材样品溶液在正气片的标准气相指纹图谱中的相应特征峰，从而对10种单味药材样品溶液的气相指纹图谱中的特征峰进行归属定位，具体结果见图3，表1。所述10种缺样阴性样品混合溶液的气相指纹图谱能够用于对比，确认特征峰来源。

由图3、表1可知，峰3仅来源于广藿香油；峰7、峰8、峰12、峰14、峰15等5个共有峰仅来源于苍术；峰9、峰10、11等3个共有峰来源于木香；峰1来源于紫苏叶油、木香和苍术；峰2来源于木香、苍术、厚朴和生姜；峰4和峰13来源于苍术和厚朴；峰5来源于广藿香油、木香和苍术；峰6来源于木香和苍术。正气片中10味药材，甘草、茯苓、陈皮、半夏不包括共有峰，其它6味药材的化学特征峰在该指纹图谱中均有较好的体现，并得到归属确证。同时，通过与对照品色谱图对比后，确定峰8为苍术素，峰9为木香烃内酯，峰11为去氢木香内酯。

综上所述，本发明提供的一种正气片的气相指纹图谱的检测方法及其应用，建立了正气片的气相指纹图谱，并对正气片中各单味药材色谱峰进行了归属确证，能够从原料源头进行有效监测，严格控制原药材的质量，保证正气片成分中有效成分的量相对稳定，从而保证临床用药的安全有效。所以，本发明克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。