一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用 (Preparation method and application of animal cell nucleus suspension ) 是由 周煌凯 高川 陈飞钦 夏昊强 徐毓璇 梁国霞 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用。本发明提供的制备方法包括组织处理破碎、重悬、离心、沉淀、重悬、细胞筛过滤、重悬离心,最后检测核浓度。本发明提供的动物细胞核悬液满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求,有利于其进一步的推广应用。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a preparation method and application of an animal cell nucleus suspension. The preparation method provided by the invention comprises the steps of tissue treatment and crushing, heavy suspension, centrifugation, precipitation, heavy suspension, cell sieve filtration, heavy suspension and centrifugation, and finally nuclear concentration detection. The animal cell nucleus suspension provided by the invention meets the cell suspension quality requirements of various high-throughput single cell sequencing platforms, and is favorable for further popularization and application.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用。
背景技术
细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的控制中心，也是真核细胞区别于原核细胞最显著的标志之一。细胞核在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。尽管细胞核的形状有多种多样，但是它的基本结构却大致相同，主要由核被膜、染色质、核骨架、核仁及核体组成。
现有技术中，尚未发现专门的制备动物细胞核悬液的方法，一般都是直接制备动物细胞悬液，这是由于动物细胞核中包含染色质、核仁、核体等多种结构，还包含遗传物质DNA，在实际的细胞核悬液制备过程中，怎样保证上述物质的完整性，现有技术中并未找到解决方式。然而，在新一代高通量单细胞测序平台中，有些情况只能将组织制备成细胞核悬液才能进行测序，如细胞体积过大的组织，高能耗伴随的多线粒体的组织等。
现有技术中已知的细胞核悬液均是采用植物细胞核制备的，如中国专利CN103776678B公开了一种草莓细胞核悬液的制备方法，中国专利CN103940646B公开了一种红掌细胞核悬液的制备方法，中国专利申请CN103940656B公开了一种松萝凤梨细胞核悬液的制备方法，上述制备过程均是利用细胞提取液提取植物细胞核，并用尼龙网过滤制得，但是对于动物细胞核悬液的制备过程，现有技术中并没有提出。
综上可知，市场上亟需一种可以有效制备动物细胞核悬液的技术。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明创造性的提供了一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用。本发明制备的动物细胞核悬液可以用于单细胞转录组测序文库的构建，有利于其进一步的推广应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种细胞核悬液的制备方法，包含如下过程：
S1、取45～55mg的目的组织，向其中加入450～550μL的裂解液，于冰上静置4～6min，然后将组织剪成1～3mm3大小的碎片，得含裂解液的组织碎片；
S2、将步骤S1制得的含裂解液的组织碎片转移至研磨管，迅速按压1～2次，并于冰上静置3～5min，制得组织液；
S3、将步骤S2制得的组织液按压8～12次，于冰上静置2～3min，再次按压14～16次，并迅速转移至新的离心管中，制得匀浆混合液；
S4、向步骤S3制得的匀浆混合液中加入450～550μL的重悬Buffer，来回颠倒5～8次，混合均匀，然后离心，将上清液转移至15mL离心管中，制得新的匀浆液；
S5、将步骤S4制得的新的匀浆液离心，去除上清液，加入1～2mL重悬buffer充分重悬沉淀，连续重复2次，然后向其中加入碘克沙醇，吹打混匀，并向其中加入700μL重悬buffer，再次离心，并用移液枪去除杂质及上清液，保留下层液体；
S6、向步骤S5中的下层液体中加入1～2mL重悬buffer，轻柔吹吸混合均匀，然后离心去掉上清液，最后留180～220μL于离心管内，向其中加入450～550μL的重悬buffer，轻柔吹吸重悬，制得细胞悬液；
S7、将步骤S6制得的细胞悬液用细胞筛过滤，并向其中加入450～550μL的重悬buffer，离心，收集沉淀，然后用杀菌液清洗2次，离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS，并检测其浓度，即得。
优选地，步骤S1、S2所述的裂解液包括摩尔质量为250mM的蔗糖，摩尔质量为50mM的Tris-HCl，摩尔质量为50mM的CaCl2，摩尔质量为50mM的MgCl2，摩尔质量为1mM的DTT，质量百分数为0.1％的CA-630，酶活单位为0.4U/μL的RNase Inhibitor，质量浓度为0.04％的BSA，1×protease inhibitor。
优选地，步骤S4、S5、S6及S7中所述的重悬buffer为含质量百分数为0.04％的BSA，终浓度为0.35M的甘露醇，活性为0.2U/μL的RNase Inhibitor的1×PBS。
优选地，步骤S4所述的离心过程为于1600～1700rpm转速下离心8～12s。
优选地，步骤S5所述的离心过程为于2600～2700rpm转速下离心4～6min；所述碘克沙醇的质量百分数为55～65％，加入量为液体总体积的0.6～0.8倍；所述再次离心时转速为10000～12000rpm，离心时间为15～20min。
优选地，步骤S6所述的离心过程为于2600～2700rpm转速下离心5～8min。
优选地，步骤S7所述的离心过程为于2600～2700rpm转速下离心4～7min；所述杀菌液包含如下组分及其重量份数：金银花粉5～10份，大蒜素3～5份，连翘提取物2～3份，双纯水50～60份。
本发明还提供了一种利用所述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。
优选地，将利用所述方法制备的细胞悬液置于冰上，于30min内建库。
本发明中，将组织破碎后，采用自制的裂解液裂解细胞，留下细胞核，裂解液中含有RNase Inhibitor，可以抑制RNase的活性，防止RNA降解，与其他组分相互配合，保证细胞核的完整性。同时，本发明提供的制备方法中，在制成细胞沉淀后，还对细胞沉淀用杀菌液进行清洗，消除在制备悬液过程中可能出现的细菌、真菌污染。
此外，发明人在试验过程中，发现所有组织按照如下方式配制裂解液均可得到良好的效果：4070μL蔗糖+600μL Tris-HCl+120μL CaCl2+180μL MgCl2+5μL DTT+5μL CA-630+5μL RNase Inhibitor+10μL BSA+5μL 1×protease inhibitor；所述重悬buffer共配制5mL的1×PBS，其中还包含终浓度为质量百分数为0.04％的BSA，终浓度为0.35M甘露醇，最终酶活性为0.2U/μL RNase Inhibitor；所述BSA及甘露醇均用1×PBS混合，包含在5mL之内；在用1×PBS缓冲液稀释细胞核沉淀时，根据沉淀的量加入预冷的1×PBS，保证核浓度在800～1500个/μL。
与现有技术相比，本发明提供的动物细胞核悬液的制备方法具有如下优点：
(1)本发明提供的制备方法，首次实现了动物细胞核悬液的制备；
(2)本发明提供的制备方法，采用自制的裂解液进行细胞裂解，有效防止了RNA降解，保证了细胞核的完整性；
(3)本发明提供的制备方法，还对细胞沉淀用杀菌液清洗，进一步保证了细胞悬液不被杂菌污染。
附图说明
图1为用显微镜计数板检测核浓度结果图；
图2为经台盼蓝染色后的细胞核浓度结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
所述金银花粉可购自西安惠邦生物工程有限公司；所述大蒜素可购自上海吉至生化科技有限公司，所述连翘提取物可购自山东萍聚生物科技有限公司；所述RNaseInhibitor可购自南京诺唯赞生物科技有限公司；所述1×protease inhibitor可购自广州鸿康生物科技有限公司；本发明实施例中所选择的动物组织均为小鼠的肝脏组织，加入量均为50mg。
实施例1一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法，包含如下过程：
S1、取50mg的目的组织，向其中加入450μL的裂解液，于冰上静置4min，然后将组织剪成1mm3大小的碎片，得含裂解液的组织碎片；所述的裂解液包括摩尔质量为250mM的蔗糖，摩尔质量为50mM的Tris-HCl，摩尔质量为50mM的CaCl2，摩尔质量为50mM的MgCl2，摩尔质量为1mM的DTT，质量百分数为0.1％的CA-630，酶活单位为0.4U/μL的RNase Inhibitor，质量浓度为0.04％的BSA，1×protease inhibitor；
S2、将步骤S1制得的含所述裂解液的组织碎片转移至研磨管，迅速按压1次，并于冰上静置3min，制得组织液；
S3、将步骤S2制得的组织液按压8次，于冰上静置2min，再次按压14次，并迅速转移至新的离心管中，制得匀浆混合液；
S4、向步骤S3制得的匀浆混合液中加入450μL的重悬Buffer，来回颠倒5次，混合均匀，然后于1600rpm转速下离心8s，将上清液转移至15mL离心管中，制得新的匀浆液；所述重悬Buffer含质量百分数为0.04％的BSA，摩尔质量为0.35M的甘露醇，活性为0.2U/μL的RNase Inhibitor的1×PBS；
S5、将步骤S4制得的新的匀浆液于2600rpm转速下离心4min，去除上清液，加入1mL所述重悬buffer充分重悬沉淀，连续重复2次，然后向其中加入质量百分数为55％的碘克沙醇，添加量为总体积的0.6倍，吹打混匀，并向其中加入700μL重悬buffer，再次于10000rpm，离心时间为15min，并用移液枪去除杂质及上清液，保留下层液体；
S6、向步骤S5中的下层液体中加入1mL重悬buffer，轻柔吹吸混合均匀，然后于2600rpm转速下离心5min，去掉上清液，最后留180μL于离心管内，向其中加入450μL的所述重悬buffer，轻柔吹吸重悬，制得细胞悬液；
S7、将步骤S6制得的细胞悬液用40μm的细胞筛过滤，并向其中加入450μL的重悬buffer，于2600rpm转速下离心4min，收集沉淀，然后用杀菌液清洗2次，离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS，并检测其浓度，即得；所述杀菌液包含如下组分及其重量份数：金银花粉5份，大蒜素3份，连翘提取物2份，双纯水50份。
实施例2一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法，包含如下过程：
S1、取50mg的目的组织，向其中加入550μL的裂解液，于冰上静置6min，然后将组织剪成3mm3大小的碎片，得含裂解液的组织碎片；所述的裂解液包括摩尔质量为250mM的蔗糖，摩尔质量为50mM的Tris-HCl，摩尔质量为50mM的CaCl2，摩尔质量为50mM的MgCl2，摩尔质量为1mM的DTT，质量百分数为0.1％的CA-630，酶活单位为0.4U/μL的RNase Inhibitor，质量浓度为0.04％的BSA，1×protease inhibitor；
S2、将步骤S1制得的含所述裂解液的组织碎片转移至研磨管，迅速按压2次，并于冰上静置5min，制得组织液；
S3、将步骤S2制得的组织液按压12次，于冰上静置3min，再次按压16次，并迅速转移至新的离心管中，制得匀浆混合液；
S4、向步骤S3制得的匀浆混合液中加入550μL的重悬Buffer，来回颠倒8次，混合均匀，然后于1700rpm转速下离心12s，将上清液转移至15mL离心管中，制得新的匀浆液；所述重悬Buffer含质量百分数为0.04％的BSA，摩尔质量为0.35M的甘露醇，活性为0.2U/μL的RNase Inhibitor的1×PBS；
S5、将步骤S4制得的新的匀浆液于2700rpm转速下离心6min，去除上清液，加入2mL所述重悬buffer充分重悬沉淀，连续重复2次，然后向其中加入质量百分数为65％的碘克沙醇，添加量为总体积的0.8倍，吹打混匀，并向其中加入700μL重悬buffer，再次于12000rpm，离心时间为20min，并用移液枪去除杂质及上清液，保留下层液体；
S6、向步骤S5中的下层液体中加入2mL所述重悬buffer，轻柔吹吸混合均匀，然后于2700rpm转速下离心8min，去掉上清液，最后留220μL于离心管内，向其中加入550μL的所述重悬buffer，轻柔吹吸重悬，制得细胞悬液；
S7、将步骤S6制得的细胞悬液用40μm的细胞筛过滤，并向其中加入550μL的重悬buffer，于2700rpm转速下离心7min，收集沉淀，然后用杀菌液清洗2次，离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS，并检测其浓度，即得；所述杀菌液包含如下组分及其重量份数：金银花粉10份，大蒜素5份，连翘提取物3份，双纯水60份。
实施例3一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法，包含如下过程：
S1、取50mg的目的组织，向其中加入500μL的裂解液，于冰上静置5min，然后将组织剪成2mm3大小的碎片，得含裂解液的组织碎片；所述的裂解液包括摩尔质量为250mM的蔗糖，摩尔质量为50mM的Tris-HCl，摩尔质量为50mM的CaCl2，摩尔质量为50mM的MgCl2，摩尔质量为1mM的DTT，质量百分数为0.1％的CA-630，酶活单位为0.4U/μL的RNase Inhibitor，质量浓度为0.04％的BSA，1×protease inhibitor；
S2、将步骤S1制得的含所述裂解液的组织碎片转移至研磨管，迅速按压2次，并于冰上静置4min，制得组织液；
S3、将步骤S2制得的组织液按压10次，于冰上静置2.5min，再次按压15次，并迅速转移至新的离心管中，制得匀浆混合液；
S4、向步骤S3制得的匀浆混合液中加入500μL的重悬Buffer，来回颠倒6次，混合均匀，然后于1650rpm转速下离心10s，将上清液转移至15mL离心管中，制得新的匀浆液；所述重悬Buffer含质量百分数为0.04％的BSA，摩尔质量为0.35M的甘露醇，活性为0.2U/μL的RNase Inhibitor的1×PBS；
S5、将步骤S4制得的新的匀浆液于2650rpm转速下离心5min，去除上清液，加入1.5mL所述重悬buffer充分重悬沉淀，连续重复2次，然后向其中加入质量百分数为60％的碘克沙醇，添加量为总体积的0.7倍，吹打混匀，并向其中加入700μL重悬buffer，再次于10658rpm，离心时间为18min，并用移液枪去除杂质及上清液，保留下层液体；
S6、向步骤S5中的下层液体中加入1.5mL重悬buffer，轻柔吹吸混合均匀，然后于2650rpm转速下离心7min，去掉上清液，最后留200μL于离心管内，向其中加入500μL的所述重悬buffer，轻柔吹吸重悬，制得细胞悬液；
S7、将步骤S6制得的细胞悬液用40μm的细胞筛过滤，并向其中加入500μL的重悬buffer，于2650rpm转速下离心5min，收集沉淀，然后用杀菌液清洗2次，离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1×PBS，并检测其浓度，即得；所述杀菌液包含如下组分及其重量份数：金银花粉8份，大蒜素4份，连翘提取物2.5份，双纯水55份。
对比例1一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例1中的裂解液不包含酶活单位为0.4U/μL的RNaseInhibitor。
对比例2一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2中的裂解液不包含1×protease inhibitor。
对比例3一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例3中的重悬Buffer不包含活性为0.2U/μL的RNaseInhibitor。
对比例4一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例4中的杀菌液中不包含连翘提取物。
对比例5一种动物细胞核悬液的制备方法
所述动物细胞核悬液的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例5中的杀菌液中不包含大蒜素。
试验例细胞核数对比试验
1.试验样品：实施例1-3及对比例1-5所述方法步骤S7经杀菌液清洗、离心后收集的细胞核沉淀；
2.试验方法：取上述各细胞沉淀，分别加入500μL预冷的1×PBS，各取300μL加入试管中，然后向试管中加入300μL，4％的台盼蓝染液，染色3min，并吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖玻片，于显微镜下任取几个视野，计数细胞核数。
3.试验结果：具体试验结果见表1。
表1不同试验样品的细胞核数对比
试验样品
细胞核数/个
实施例1组
2862
实施例2组
2785
实施例3组
2979
对比例1组
1970
对比例2组
2026
对比例3组
2049
对比例4组
2163
对比例5组
2169
由表1可知，采用本发明实施例1-3所述方法制得的细胞悬液中，细胞死亡数量较少，而改变裂解液、重悬Buffer的组成，均使得细胞核数大大降低，同时，改变杀菌液的组成，也使得细胞核数目下降，这进一步体现了本发明中各组分之间的相互协同作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。