水杨酸甲酯在制备沙门氏菌ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 水杨酸甲酯在制备沙门氏菌ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用 (Application of methyl salicylate in preparation of salmonella III type secretion system inhibitor ) 是由 吕强华 王建锋 邓旭明 李淑芳 韩伟 张蕊 冯海华 王琳 于 2021-01-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及水杨酸甲酯在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用,以人宫颈癌细胞(HeLa)为感染载体,证实水杨酸甲酯通过抑制Ⅲ型分泌系统的功能,从而对沙门氏菌感染具有显著的抑制作用。相比传统抗生素在直接杀死沙门氏菌的作用机制,中药化合物水杨酸甲酯以T3SS为靶标的治疗策略可以解除病原细菌的武装,但不直接杀死它们,给予细菌的选择压力小,从而降低了产生耐药性的风险。此外,天然的水杨酸甲酯最初发现于自然界的柳树皮、白珠树叶及甜桦树中；之后实现了可以人工制备,具有来源广泛、成本低廉和治愈率高的特点。(The invention relates to an application of methyl salicylate in preparation of a salmonella III type secretion system inhibitor, which takes human cervical carcinoma cells (HeLa) as an infection carrier to prove that the methyl salicylate has a remarkable inhibiting effect on salmonella infection by inhibiting the function of a III type secretion system. Compared with the action mechanism of the traditional antibiotics for directly killing salmonella, the treatment strategy of the traditional Chinese medicine compound methyl salicylate taking T3SS as the target can relieve the armed state of pathogenic bacteria, but does not directly kill the pathogenic bacteria, and the selection pressure given to the bacteria is small, so that the risk of drug resistance is reduced. In addition, natural methyl salicylate was originally found in willow bark, beautyberry leaves and betula in nature; the preparation method realizes the artificial preparation, and has the characteristics of wide sources, low cost and high cure rate.)
技术领域
本发明涉及水杨酸甲酯在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用，属于医学制药技术领域。
背景技术
抗生素耐药性细菌正在威胁全球公共卫生，并且正在威胁我们治疗常见传染病的能力。随着抗生素功效的下降，感染(如肺炎，肺结核，败血症，淋病和食源性疾病)的治疗正变得越来越具有挑战性。迫切需要单独或与传统抗生素结合使用的新型抗感染疗法，以预防或治疗细菌病原体。III型分泌系统(T3SS)将效应蛋白转运到真核宿主细胞中以诱导感染，这对于某些细菌性病原体的毒力至关重要。以T3SS为靶标的治疗策略可以解除病原细菌的武装，但不直接杀死它们，从而降低了产生耐药性的风险。因此，T3SS似乎是开发针对细菌感染药物的新靶标。
沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，可感染包括人类在内的多种动物，人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死性疾病，沙门氏菌可加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力，不仅给公共卫生带来沉重的负担，同时给社会造成经济损失。沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌利用沙门氏菌致病岛1(SPI-1)上编码的T3SS诱导炎性腹泻并侵袭非吞噬上皮细胞，T3SS装置是一种针状结构，可将细菌效应蛋白注入宿主细胞以建立感染，且该机制广泛分布于革兰氏阴性细菌中，因此沙门氏菌T3SS可以作为开发抗毒力药物的新策略。
传统上用于抗感染的药用植物，是发现药物的宝库。一些类黄酮，如黄芩素和槲皮素，通过阻断T3SS效应和鼠伤寒沙门氏菌易位到上皮细胞而抑制入侵。百里酚，伞花烃的天然单萜酚衍生物，可抑制伤寒沙门氏菌SipA由易位到HeLa细胞。目前，国内外未见水杨酸甲酯通过抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的功能来抵抗沙门氏菌感染的报道。
发明内容
本发明所述水杨酸甲酯CAS登录号为119-36-8，分子式为C8H8O3，分子量为152.15。
水杨酸甲酯的化学结构式如下：
本研究以沙门氏菌T3SS效应蛋白为药物靶标筛选得到的天然化合物水杨酸甲酯为沙门氏菌致病岛1(SPI-1)抑制剂，该抑制剂可阻断几种SPI-1相关效应蛋白的分泌且不影响细菌生长，因此对SPI-1介导的HeLa细胞侵袭具有很强的抑制作用。进一步的研究表明，水杨酸甲酯显着降低了某些SPI-1基因的转录，例如SipA，SipB和HilA。在动物感染模型中，水杨酸甲酯可有效保护鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠引的死亡和病理损伤。总之，本研究提出了一种有效的SPI-1抑制剂水杨酸，它通过调节主要调节基因的转录来降低SPI-1效应蛋白的表达。
附图说明
图1：水杨酸甲酯抑制效应蛋白SipA的易位进而抑制T3SS的功能(蓝色表示沙门氏菌T3SS效应蛋白SipA的转运功能正常；绿色沙门氏菌T3SS效应蛋白SipA不能正常转运)
图2：水杨酸甲酯不影响鼠伤寒沙门氏菌的生长(横轴表示时间，纵轴表示OD600nm测定值)
图3水杨酸甲酯对HeLa细胞无细胞毒性(横轴表示水杨酸甲酯的浓度，纵轴表示HeLa细胞LDH释放量)
图4：水杨酸甲酯对沙门氏菌介导HeLa细胞损伤的保护作用(横轴表示不同浓度水杨酸甲酯处理组，纵轴为LDH释放量)
具体实施方式
通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
水杨酸甲酯作为沙门氏菌T3SS抑制剂及在制备治疗沙门氏菌感染药物中的作用，用于药学上可接受的任何载体。
实施例2
水杨酸甲酯作为沙门氏菌T3SS抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。
实施例3
水杨酸甲酯作为沙门氏菌T3SS抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病，特别是由沙门氏菌引起的人畜感染，包括伤寒、副伤寒、胃肠炎和鸡白痢等疾病。
1.沙门氏菌III型分泌系统抑制剂的筛选
本研究通过构建TEM报告基因质粒使目的蛋白SipA以融合TEM的形式表达，将构建好的质粒电转到鼠伤寒沙门氏菌中，通过天然化合物与鼠伤寒沙门氏菌提前共孵育后，感染Hela细胞2h，加入CCF4-AM底物，当融合β-内酰胺酶的SipA蛋白进入宿主细胞时，底物CCF2在β-内酰胺酶的作用下被分解，干扰FRET现象，在409nm处波长的光激发下发出447nm的蓝光，若天然化合物抑制SipA蛋白易位至宿主细胞，则在409nm波长的光激发下产生FRET现象发出520nm的绿光，因此在激光共聚焦显微镜下通过不同颜色的荧光信号进行抑制剂筛选。
结论：β-内酰胺酶-SipA感染HeLa细胞呈现蓝色，说明T3SS效应蛋白SipA能够正常转运至细胞内，而当敲除T3SS系统效应蛋白转运的关键基因invA后使其失去正常的功能，感染的HeLa细胞呈现绿色，水杨酸甲酯与β-内酰胺酶-SipA共孵育后，感染的HeLa细胞呈现部分蓝色，说明水杨酸抑制沙门氏菌T3SS效应蛋白SipA的易位而影响沙门氏菌T3SS的功能(见附图1)。
2.水杨酸甲酯对沙门氏菌生长的影响
沙门氏菌接种至LB液体培养基(0.3M NaCl)中过夜培养(37℃，200rpm)，次日1:100扩培至OD600nm为0.3左右，分装于5个锥形瓶(20ml/瓶)中，设定不加药物组和不同浓度水杨酸甲酯处理组。37℃，200rpm继续培养，每隔0.5h测定并记录每组样品的OD600nm，直至细菌生长至平台期。
结论：在7h的培养时间内，水杨酸甲酯处理组(0～32μg/ml)与未加药物处理组相比，细菌生长至平台期OD600nm值无显著差异，表明水杨酸甲酯在有效浓度范围内不影响细菌正常生长(见附图2)。
3水杨酸甲酯对沙门氏菌入侵宿主细胞的影响
3.1水杨酸甲酯对宿主细胞无细胞毒性
将HeLa细胞系维持在含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，细胞的浓度调整为每毫升2×104个细胞，接种到96孔板中(2×104个/孔)孵育过夜。次日将不同浓度水杨酸甲酯、DMEM和0.1％TritonX-100分别加入，每组设定三个重复，于37℃温箱培养8h后取细胞培养上清，按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒使用说明测定492nm处吸光度，计算各组LDH释放率。
公式如下：LDH释放率(％)＝(待测组-DMEM对照组)/(0.1％TritonX组-DMEM对照组)
结论：与未加水杨酸甲酯处理组相比，在2～64μg/ml浓度范围内水杨酸甲酯对HeLa细胞几乎无毒性(见附图3)。
3.2水杨酸甲酯对沙门氏菌介导的HeLa细胞损伤的保护作用
将HeLa细胞悬浮在补充有10％胎牛血清的DMEM中，于96孔板中以2×104个/孔密度培养过夜。野生型菌株SL1344和ΔinvA-SL1344在含0.3M NaCl LB肉汤中稀释20倍，以不同浓度水杨酸甲酯预处理4h后，MOI＝100感染细胞，每组三个重复，感染5h后，1000rpm离心10min取细胞培养上清于新的96孔板，按照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒使用说明测定492nm处吸光度，计算各组LDH释放率。
结论：LDH在培养上清液中的释放量是细胞死亡的指标，与用SL1344感染但未用水杨酸甲酯治疗的对照组相比，16μg/ml水杨酸甲酯处理组的LDH释放量显著降低，表明水杨酸甲酯可有效缓解沙门氏菌介导的HeLa细胞的损伤(见附图4)。