具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1遗传毒性检测载体构建

以pUC18为出发载体，构建遗传毒性检测载体pUST。具体构建方法如下：

1.合成DNA损伤检测响应元件P_umu(SEQ ID NO.3)和T7终止子序列，在P_umu上游添加XbaI位点，下游添加SpeI酶切位点；在T7终止子上游添加EcoRI位点，下游添加SmaI酶切位点，记为T7t。

2.以lambda噬菌体基因组DNA为模板，扩增SRRz基因(SEQ ID NO.4)。在SRRz基因的上下游分别添加SpeI、EcoRI酶切位点。

3.采用生物积木(Biobricks)方法，采用酶切、连接方法将各元件按照启动子P_umu-裂解基因SRRz-T7终止子顺序连接，插入到pUC18载体中，得到遗传毒性响应载体pUST。

4.合成T7启动子和T7终止子序列，在T7启动子上游添加KpnI酶切位点，下游添加BamHI酶切位点，记为T7-1；在另一个T7启动子上游添加SmaI酶切位点，下游添加PstI酶切位点，记为T7-2；在T7终止子上游添加XhoI酶切位点，在下游添加NdeI酶切位点，记为T7t-1。

5.以SGSC1412鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA为模板，分别扩增nfsB基因(SEQ IDNO.1)和nhoA基因(SEQ ID NO.2)。在nfsB基因的上游添加BamHI酶切位点，下游添加SmaI酶切位点，在nhoA基因的上游添加PstI酶切位点，在下游添加XhoI酶切位点。

6.采用生物积木(Biobricks)方法，采用酶切、连接方法将各元件按照启动子-nfsB-启动子-nhoA-终止子顺序连接，插入到pUST载体中，得到遗传毒性检测载体pUSTBA。载体构建示意图如图1所示。

7.将载体pUSTBA或pUST转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得遗传毒性物质检测用的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pUSTBA或E.coli BL21(DE3)/pUST。

实施例2硝基化合物遗传毒性测试

存活率的计算

大肠杆菌检测液接触待测样品后20min，分别测定各测试菌液在600nm处的光吸收值(OD₆₀₀)。

存活率(％)＝B/A*100％

其中，A-添加二甲基亚砜的菌液OD₆₀₀

B一添加待测样品的菌液OD₆₀₀。

1.重组大肠杆菌的复苏活化

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pUSTBA从-80℃冰箱中取出，并划线于LB平板培养基中，在37℃条件下恢复培养14h。挑取单菌落，接种至LB培养液中，在37℃、250rpm条件下培养12～16h，得到饱和菌液。

2.大肠杆菌检测液制备

将复苏活化的饱和菌液以1∶100体积比例接种至新鲜LB培养基，以190μL体积量加入到96孔培养板中，在35～38℃，600～1000rpm条件下培养至OD₆₀₀到0.1～0.4，加入IPTG至终浓度为0.01～0.2mM，诱导培养用时约1～1.5h，得到大肠杆菌检测液。

3.与待测样品接触

配制一定浓度梯度含有硝基化合物(1-NN、2-NF或5-NA)的溶液作为待测样品；其中，含1-NN的溶液中1-NN的浓度梯度为2、6、20、58、170μmol/L；含2-NF的溶液中2-NF的浓度梯度为0.5、0.75、1、1.5、2、2.5μmol/L；含5-NA的溶液中5-NA的浓度梯度为0.125、0.63、1.25、3.5、15μmol/L。

将待测样品10μL加入到上述96孔板内，在35～38℃，800rpm条件下继续培养20分钟，设置3个平行组。同时设置添加相同体积的纯溶剂(二甲基亚砜)，和相同体积、相同浓度的样品至重组型E.coli BL21(DE3)/pUST菌株和野生型E.coli BL21(DE3)菌株作为阴性对照。

4.实验结果表明，在该饱和浓度(170μmol/L 1-NN、2.5μmol/L 2-NF、15μmol/L 5-NA)条件下，遗传毒性响应载体pUST中缺乏编码硝基还原酶基因(nfsB)和O-乙酰转移酶基因(nhoA)的重组型E.coli BL21(DE3)/pUST菌株以及不含遗传毒性响应载体的野生型E.coli BL21(DE3)菌株生长正常，未发生菌体裂解。然而，E.coli BL21(DE3)/pUSTBA菌株呈现不同程度的裂解。本实施例中检测结果如图2所示，各硝基化合物检测的标准曲线对应为：

1-NN，Y＝54.37+(97.81-54.37)/{1+10^{(17.74-log X)×(-0.1095)}}，R²＝0.99(2≤X≤170)；

2-NF，Y＝66.13+(100.2-66.13)/{1+10^{(1.117-log X)×(-3.676)}}，R²＝0.99(0.5≤X≤2.5)；

5-NA，Y＝65.39+(100.8-65.39)/{1+10^{(2.586-log X)×(-0.5784)}}，R²＝0.99(0.125≤X≤15)。

其中，X表示遗传毒性物质的浓度(μmol/L)，Y表示菌体存活率(％)，R²表示曲线拟合相关系数。

该结果表明，在检测浓度范围内，样品浓度与菌体存活率成剂量相关性。因此，可以用该菌株E.coli BL21(DE3)/pUSTBA对含硝基化合物样品是否具有遗传毒性进行检测。

实施例3常用农药遗传毒性高通量筛查

本实施例拟常用农药进行遗传毒性筛查，以菌体存活率为标准指标。对应的检测农药的遗传毒性程度，可反映为相对存活率大小。

相对存活率(％)＝B/A*100％

其中，A-野生型E.coli BL21(DE3)菌株存活率

B--E.coli BL21(DE3)/pUSTBA存活率

1.按照实施例2步骤1-2制备E.coli BL21(DE3)/pUSTBA检测菌液、E.coli BL21(DE3)/pUST检测菌液、及野生型E.coli BL21(DE3)检测菌液。

2.取待测农药按一定比例分别溶于二甲基亚砜，稀释比例见表1。参照实施例2，在96孔板中，将待测农药与大肠杆菌检测液混合，同时添加同体积纯溶剂(二甲基亚砜)的大肠杆菌检测液做对照；两组样品均继续培养20min。所述农药均采购自东莞某农药店。

3.实验方案如图3所示。

4.将与待测农药混合的大肠杆菌检测液与对照组的大肠杆菌检测液分别测得OD₆₀₀。

5.计算相对存活率，所得结果如表1所示。

表1常用农药的相对存活率

表1结果表明，所筛查的含硝基化合物农药均具有一定的遗传毒性，蚍虫啉、二甲戊灵、联苯-噻虫嗪和复硝酚钠诱导的E.coli BL21(DE3)/pUSTBA相对存活率为53％～89％，均低于缺乏编码硝基还原酶(nfsB)和O-乙酰转移酶(nhoA)的E.coli BL21(DE3)/pUST相对存活率。有机磷酸酯类、苯胺类、酰胺类(异菌脲除外)、甲酸盐类、叔丁硫基类、酚类和微生物类的农药中，均含有一定的遗传毒性，其中敌百虫、草铵膦、腐霉-福美双、哒螨灵、阿维菌素诱导的E.coli BL21(DE3)/pUSTBA相对存活率仅有70％以下，而E.coli BL21(DE3)/pUST相对存活率均在90％以上。

上述检测结果表明，包含有本发明所述含硝基化合物的遗传毒性筛查方法，在响应浓度范围内对待测物进行检测，最终以相对细胞存活率表示待测样品的遗传毒性含量，并在96孔板中可实现高通量筛查。该方法无致病风险，操作简单、检测灵敏度高、省时省力、易于推广。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种遗传毒性物质的高通量筛查方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码硝基还原酶基因nfsB的序列

<400> 1

atggatatcg tttctgtcgc cttacagcgc tactccacta aggcgttcga tcccagcaaa 60

aaactgaccg ccgaagaagc ggataaaata aaaacactac tacagtacag cccctccagc 120

accaattccc agccgtggca ctttattgtc gccagtacgg aagaaggcaa agcgcgcgta 180

gcaaaatccg ctgccggaaa ctacacgttc aacgaacgca aaatgctgga cgcctcccat 240

gtggtggtct tctgcgccaa aaccgcaatg gatgacgcat ggcttgagcg cgtcgtcgat 300

caggaagatg ctgatggccg tttcgctacg ccggaagcta aagcggcaaa tgataaaggt 360

cgccgctttt tcgccgatat gcaccgcgtc tcgctgaaag atgaccacca gtggatggcg 420

aagcaggttt atctgaacgt cggcaacttt ctgctgggcg tcgccgcgat gggtctcgac 480

gccgtcccca ttgaaggttt cgacgccgag gtgctcgacg ctgaatttgg tctgaaagaa 540

aaaggctata ccagtctggt cgtggtgccg gtcggccatc atagcgtcga ggatttcaac 600

gccgggctgc cgaaatcacg tctgccgctt gaaaccacac tgacggaagt ttaa 654

<210> 2

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码O-乙酰转移酶基因nhoA的序列

<400> 2

atgacctctt ttttacatgc ttattttacg cgattacatt gtcagccgtt gggggttcct 60

acggttgaag cgctcagaac gcttcactta gcgcacaact gcgcgattcc ttttgaaaat 120

ctggatgtgc tactgcctcg tgaaatacag ctcgatgaga cggcattaga ggagaaactg 180

ctttatgccc gacgcggtgg atactgtttt gaactgaatg gcctgtttga acgcgcgtta 240

cgcgacatcg gttttaacgt ccgaagctta ttggggcggg tcattctgtc tcatcccgcc 300

agtttaccgc cgcgcacgca ccgtttgctg ctggttgatg ttgaggatga gcagtggatc 360

gcggacgtgg ggtttggcgg ccaaacgcta accgcaccgc ttcgtctgca ggctgaaatt 420

gcccagcaaa cgccgcatgg cgaataccgc ctgatgcagg agggaagcac atggatttta 480

caattccgcc accatgagca ctggcagtcg atgtactgtt ttgatctggg ggtgcagcag 540

cagagcgatc atgtgatggg caatttctgg tcggctcact ggccgcaatc ccattttcgt 600

catcatttgt tgatgtgccg ccatttgcct gatggcggca agctgacatt aacgaatttc 660

cacttcacgc gttaccacca gggacatgcc gttgaacagg tcaatgtacc ggatgtaccg 720

tcgttgtatc agttacttca gcagcagttt ggtctcggcg taaatgatgt aaagcacggt 780

tttaccgagg cggagctggc cgcggtaatg gctgcatttg atacccatcc agaggcggga 840

aaataa 846

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNA损伤检测响应元件的核苷酸序列

<400> 3

tactgtatat aaaaacagta 20

<210> 4

<211> 1549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 裂解基因SRRz的序列

<400> 4

gccactgtct gtcctgaatt cattagtaat agttacgctg cggcctttta cacatgacct 60

tcgtgaaagc gggtggcagg aggtcgcgct aacaacctcc tgccgttttg cccgtgcata 120

tcggtcacga acaaatctga ttactaaaca cagtagcctg gatttgttct atcagtaatc 180

gaccttattc ctaattaaat agagcaaatc cccttattgg gggtaagaca tgaagatgcc 240

agaaaaacat gacctgttgg ccgccattct cgcggcaaag gaacaaggca tcggggcaat 300

ccttgcgttt gcaatggcgt accttcgcgg cagatataat ggcggtgcgt ttacaaaaac 360

agtaatcgac gcaacgatgt gcgccattat cgcctggttc attcgtgacc ttctcgactt 420

cgccggacta agtagcaatc tcgcttatat aacgagcgtg tttatcggct acatcggtac 480

tgactcgatt ggttcgctta tcaaacgctt cgctgctaaa aaagccggag tagaagatgg 540

tagaaatcaa taatcaacgt aaggcgttcc tcgatatgct ggcgtggtcg gagggaactg 600

ataacggacg tcagaaaacc agaaatcatg gttatgacgt cattgtaggc ggagagctat 660

ttactgatta ctccgatcac cctcgcaaac ttgtcacgct aaacccaaaa ctcaaatcaa 720

caggcgccgg acgctaccag cttctttccc gttggtggga tgcctaccgc aagcagcttg 780

gcctgaaaga cttctctccg aaaagtcagg acgctgtggc attgcagcag attaaggagc 840

gtggcgcttt acctatgatt gatcgtggtg atatccgtca ggcaatcgac cgttgcagca 900

atatctgggc ttcactgccg ggcgctggtt atggtcagtt cgagcataag gctgacagcc 960

tgattgcaaa attcaaagaa gcgggcggaa cggtcagaga gattgatgta tgagcagagt 1020

caccgcgatt atctccgctc tggttatctg catcatcgtc tgcctgtcat gggctgttaa 1080

tcattaccgt gataacgcca ttacctacaa agcccagcgc gacaaaaatg ccagagaact 1140

gaagctggcg aacgcggcaa ttactgacat gcagatgcgt cagcgtgatg ttgctgcgct 1200

cgatgcaaaa tacacgaagg agttagctga tgctaaagct gaaaatgatg ctctgcgtga 1260

tgatgttgcc gctggtcgtc gtcggttgca catcaaagca gtctgtcagt cagtgcgtga 1320

agccaccacc gcctccggcg tggataatgc agcctccccc cgactggcag acaccgctga 1380

acgggattat ttcaccctca gagagaggct gatcactatg caaaaacaac tggaaggaac 1440

ccagaagtat attaatgagc agtgcagata gagttgccca tatcgatggg caactcatgc 1500

aattattgtg agcaatacac acgcgcttcc agcggagtat aaatgccta 1549

<210> 5

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 硝基还原酶的氨基酸序列

<400> 5

Met Asp Ile Val Ser Val Ala Leu Gln Arg Tyr Ser Thr Lys Ala Phe

1 5 10 15

Asp Pro Ser Lys Lys Leu Thr Ala Glu Glu Ala Asp Lys Ile Lys Thr

20 25 30

Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe

35 40 45

Ile Val Ala Ser Thr Glu Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ser Ala

50 55 60

Ala Gly Asn Tyr Thr Phe Asn Glu Arg Lys Met Leu Asp Ala Ser His

65 70 75 80

Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Ala Trp Leu Glu

85 90 95

Arg Val Val Asp Gln Glu Asp Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Glu

100 105 110

Ala Lys Ala Ala Asn Asp Lys Gly Arg Arg Phe Phe Ala Asp Met His

115 120 125

Arg Val Ser Leu Lys Asp Asp His Gln Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr

130 135 140

Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Met Gly Leu Asp

145 150 155 160

Ala Val Pro Ile Glu Gly Phe Asp Ala Glu Val Leu Asp Ala Glu Phe

165 170 175

Gly Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly

180 185 190

His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Arg Leu

195 200 205

Pro Leu Glu Thr Thr Leu Thr Glu Val

210 215

<210> 6

<211> 281

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> O-乙酰转移酶的氨基酸序列

<400> 6

Met Thr Ser Phe Leu His Ala Tyr Phe Thr Arg Leu His Cys Gln Pro

1 5 10 15

Leu Gly Val Pro Thr Val Glu Ala Leu Arg Thr Leu His Leu Ala His

20 25 30

Asn Cys Ala Ile Pro Phe Glu Asn Leu Asp Val Leu Leu Pro Arg Glu

35 40 45

Ile Gln Leu Asp Glu Thr Ala Leu Glu Glu Lys Leu Leu Tyr Ala Arg

50 55 60

Arg Gly Gly Tyr Cys Phe Glu Leu Asn Gly Leu Phe Glu Arg Ala Leu

65 70 75 80

Arg Asp Ile Gly Phe Asn Val Arg Ser Leu Leu Gly Arg Val Ile Leu

85 90 95

Ser His Pro Ala Ser Leu Pro Pro Arg Thr His Arg Leu Leu Leu Val

100 105 110

Asp Val Glu Asp Glu Gln Trp Ile Ala Asp Val Gly Phe Gly Gly Gln

115 120 125

Thr Leu Thr Ala Pro Leu Arg Leu Gln Ala Glu Ile Ala Gln Gln Thr

130 135 140

Pro His Gly Glu Tyr Arg Leu Met Gln Glu Gly Ser Thr Trp Ile Leu

145 150 155 160

Gln Phe Arg His His Glu His Trp Gln Ser Met Tyr Cys Phe Asp Leu

165 170 175

Gly Val Gln Gln Gln Ser Asp His Val Met Gly Asn Phe Trp Ser Ala

180 185 190

His Trp Pro Gln Ser His Phe Arg His His Leu Leu Met Cys Arg His

195 200 205

Leu Pro Asp Gly Gly Lys Leu Thr Leu Thr Asn Phe His Phe Thr Arg

210 215 220

Tyr His Gln Gly His Ala Val Glu Gln Val Asn Val Pro Asp Val Pro

225 230 235 240

Ser Leu Tyr Gln Leu Leu Gln Gln Gln Phe Gly Leu Gly Val Asn Asp

245 250 255

Val Lys His Gly Phe Thr Glu Ala Glu Leu Ala Ala Val Met Ala Ala

260 265 270

Phe Asp Thr His Pro Glu Ala Gly Lys

275 280