阅读说明：本技术 肝素钠用于新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的新用途 (New use of heparin sodium for infection of novel coronavirus SARS-CoV-2 ) 是由 王升启 王学军 杨扬 杨鹏 吴玉明 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及肝素钠在抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染方面的应用,属于生物医药技术领域。本发明研究了肝素钠对新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的抑制作用,结果显示肝素钠能够抑制SARS-CoV-2假病毒颗粒对宿主细胞的感染。具体是通过构建新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒系统和HEK293的人血管紧张素转换酶2(hACE2)稳转细胞系(HEK293/hACE2),研究了肝素钠对于新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒感染宿主细胞的影响,结果发现随肝素钠浓度的增加,假病毒颗粒对细胞的感染率逐渐降低,肝素钠的50％抑制浓度(IC50)在100μM左右。此研究证明了肝素钠作为新型冠状病毒SARS-CoV-2感染抑制剂和临床治疗药物及制剂的新用途。(The invention relates to application of heparin sodium in inhibiting novel coronavirus SARS-CoV-2 infection, belonging to the technical field of biological medicine. The invention researches the inhibition effect of heparin sodium on SARS-CoV-2 infection of novel coronavirus, and the result shows that the heparin sodium can inhibit the infection of SARS-CoV-2 pseudovirion on host cells. Specifically, by constructing a novel coronavirus SARS-CoV-2 pseudovirus system and a human angiotensin converting enzyme 2(hACE2) stable transfer cell line (HEK293/hACE2) of HEK293, the influence of heparin sodium on a novel coronavirus SARS-CoV-2 pseudovirus infected host cell is researched, and as a result, the infection rate of pseudovirus particles on the cell is gradually reduced along with the increase of the concentration of the heparin sodium, and the 50% inhibition concentration (IC50) of the heparin sodium is about 100 mu M. The research proves the new application of heparin sodium as the novel coronavirus SARS-CoV-2 infection inhibitor and clinical treatment medicine and preparation.)

肝素钠用于新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的新用途

技术领域

本发明涉及药学及新型冠状病毒SARS-CoV-2感染药物领域，具体涉及肝素钠作为一种抑制剂在抗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染中的应用。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的肺炎以发热、干咳、乏力、呼吸困难等为主要表现，严重者快速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。迄今为止，临床上尚无针对性的特效药，多以对症治疗、预防干预为主。有研究表明，在重症新冠肺炎患者中，比较有效的是瑞德西韦和氯喹，但需要更多的临床数据支持。而对于普通新冠肺炎患者，连花清瘟胶囊被证明是有效的。作为一种高传染性病毒，新型冠状病毒SARS-CoV-2具有一定突变性、潜在宿主多、潜伏期长等特点，另外很多特性尚待阐明。因此，目前迫切需要尽快找到更多安全有效的抗新型冠状病毒的候选药物。

病毒感染宿主细胞是一个高度复杂的过程，通常涉及细胞表面的各种分子。第一步通常是病毒与细胞膜表面的低亲和力附着位点结合，随后病毒与其特异性受体结合，进而侵入细胞。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是一种广泛分布于哺乳动物细胞膜上的蛋白多糖，研究表明它可以为许多病毒如SARS冠状病毒、登革热病毒、乙型肝炎病毒等提供初始附着位点，促进病毒颗粒在细胞表面的聚集并促进随后病毒与特异性受体的结合。已有研究表明，血管紧张素转换酶2(ACE2)是新型冠状病毒SARS-CoV-2感染宿主细胞的特异性受体。

肝素是一类由二种多糖交替连接而成的多聚体，平均分子量约为15000D，在体内外都具有抗凝血作用，临床上主要用于治疗血栓栓塞性疾病、弥漫性血管内凝血及心血管手术、心脏导管检查、血液透析等的抗凝，此外还具有降脂、抗炎、抗过敏等多种作用。已有研究表明添加外源性肝素能够降低SARS冠状病毒与细胞表面的结合能力，进而提高细胞对病毒感染的抵抗力。其主要原理在于，肝素与HSPG竞争性结合病毒颗粒，从而阻止了病毒颗粒与细胞的初步接触。但是目前对于肝素是否也能够抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2与细胞的结合，尚未有明确报道。肝素钠是肝素的钠盐形式，与游离的肝素相比，肝素钠更加稳定。

因此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供肝素钠作为新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的抑制剂的应用。本发明采用不同浓度的肝素钠作用于HEK293的人血管紧张素转换酶2(hACE2)稳转细胞系(HEK293/hACE2)，然后利用新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒感染细胞，发现病毒颗粒的感染率随肝素钠浓度的增加而下降，IC₅₀约为100μM。此研究可为抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染提供新的途径。

本发明的具体技术方案如下：

一、构建新型冠状病毒SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系统

利用慢病毒三质粒包装系统构建新型冠状病毒SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系统，该假病毒系统以SARS-CoV-2 spike蛋白为表面膜蛋白，以萤火虫荧光素酶为报告基因。

二、预孵育肝素钠后HEK293/hACE2细胞感染新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒

将HEK293/hACE2细胞与不同浓度的肝素钠在37℃孵育0.5h，同时肝素钠与新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒在37℃孵育0.5h，之后细胞感染新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒。通过检测细胞中荧光素酶的活性来判断假病毒颗粒的感染情况。

附图说明

图1为肝素钠对SARS-CoV-2假病毒感染HEK293/hACE2细胞的抑制效果。

具体实施方式

1)构建新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒系统

利用慢病毒三质粒包装系统构建新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒系统。该假病毒系统以SARS-CoV-2 spike蛋白为表面膜蛋白，以萤火虫荧光素酶为报告基因。利用GenJetVer II转染试剂将spike包膜质粒、包装质粒psPAX2及含荧光素酶报告基因的HIV质粒共转染到HEK293T细胞中，12h后更换新鲜培养基。在转染36、48、60h后收集上清培养基，并将其在800×g下离心5min，然后经过0.45μm的滤膜过滤，除去细胞碎片，得到的假病毒分装保存于-80℃。

2)预孵育肝素钠后HEK293/hACE2细胞感染新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒

将生长于含10％胎牛血清的DMEM培养液的对数生长期HEK293/hACE2细胞按照1×10⁴个/孔的密度均匀接种于96孔板中，过夜贴壁后，将细胞与不同浓度的肝素钠在37℃孵育0.5h，同时肝素钠与SARS-CoV-2假病毒在37℃孵育0.5h，之后细胞感染与肝素钠共孵育的新型冠状病毒SARS-CoV-2假病毒，继续培养6h后更换新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养60h。

3)荧光素酶活性检测

取出细胞培养板在室温平衡10min，每孔加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，室温孵育10min，使用化学发光免疫分析仪进行化学发光检测。