一种凝结芽孢杆菌素的提取方法
阅读说明：本技术 一种凝结芽孢杆菌素的提取方法 (Extraction method of bacillus coagulans ) 是由 樊倩 周盛昌 王丽娜 郑庆礼 张敬学 吴有林 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于细菌培养领域,具体涉及一种凝结芽孢杆菌素的提取方法。本发明提供的培养方法,采用自制培养基进行培养,将成功分离的凝结芽孢杆菌按照1.5～2.5％的接种量接种到培养基中,在36～38℃的温度下发酵培养35～38h,然后经发酵液粗离心、微孔过滤、粗提液浓缩等过程制得。本发明提供的培养方法,可以有效抑制其他细菌生长,制成的凝结芽孢杆菌素的产量大,纯化度高,活性高,适于大规模的生产利用。(The invention belongs to the field of bacterial culture, and particularly relates to a method for extracting coagulans. The culture method provided by the invention adopts a self-made culture medium for culture, inoculates the successfully separated bacillus coagulans into the culture medium according to the inoculation amount of 1.5-2.5%, performs fermentation culture for 35-38 h at the temperature of 36-38 ℃, and then performs the processes of fermentation liquor coarse centrifugation, microfiltration, crude extract concentration and the like to prepare the bacillus coagulans. The culture method provided by the invention can effectively inhibit the growth of other bacteria, and the prepared condensation bacillus element has the advantages of high yield, high purification degree and high activity, and is suitable for large-scale production and utilization.)
技术领域
本发明属于细菌培养领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌素的提取方法。
背景技术
乳酸菌素是由某些乳酸菌细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽或前体多肽。乳酸菌素无毒，无副作用，可作为无抗添加剂应用于动物生产中。但是，乳酸菌素的产量受到很多因素的影响，现有的报道表明，不同的菌株、以及同一菌株在发酵中培养的时间、培养的温度、培养基的pH、菌液的接种量、甚至培养基的成分如碳源、氮源、磷酸盐等等，都会影响乳酸菌素的产量。其中培养基的成分、培养的时间、培养的温度、培养的pH等这些因素影响着菌株的生长和乳酸菌素的合成。因此，如何通过筛选菌株，设置培养条件，使其得到的乳酸菌素产量大，活性高，成为了乳酸菌素的研究热点。
凝结芽孢杆菌在分类学上属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。但是其与其他芽孢杆菌的区别在于，它是唯一可以生产乳酸的芽孢杆菌(经分解糖类生成L-乳酸)，为同型乳酸发酵菌，最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。现有技术中关于凝结芽孢杆菌的研究很多，但多是集中在其应用领域，怎样提高其中的乳酸菌素，现有技术中并未记载。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明创造性的提供了一种凝结芽孢杆菌素的提取方法。本发明提供的培养方法，可以有效抑制其他细菌生长，制成的凝结芽孢杆菌素的产量大，纯化度高，活性高，适于大规模的生产利用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种凝结芽孢杆菌素的提取方法，包括如下步骤：
S1、配制培养基：将下列组分按所述重量百分数加入，混合均匀：葡萄糖1.8～2.2％，大豆蛋白胨1.2～1.8％，酵母浸粉0.3～0.7％，硫酸镁0.04～0.08％，硫酸锰0.02～0.06％，吐温-80 0.06～0.1％，乳酸菌素促进剂0.1～0.2％，水94.86～96.48％，调节培养基的pH值至6.8～7.2；
S2、接种：取出实验室已分离的凝结芽孢杆菌，按照体积比为1.5～2.5％的接种量接种至100mL的培养基中，在36～38℃的温度下发酵培养32～40h，得发酵液；
S3、将步骤S2制得的发酵液于7000～9000rpm的转速下离心10～20min，取上清液，将上清液进行微孔过滤除菌，然后调节pH值为7.0，用4℃，质量分数为60～70％饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，收集下层沉淀；
S4、将步骤S3收集的下层沉淀溶于为pH6.5的磷酸钠缓冲液中，然后经透析，得到含有细菌素的粗提液；
S5、将步骤S4制得的粗提液经冷冻干燥浓缩，采用Sephadex-G100进行纯化，干燥，然后利用SDS-PAGE的方法测定其分子量，即得。
优选地，所述提取方法包括如下步骤：
S1、配制培养基：将下列组分按所述重量百分数加入，混合均匀：葡萄糖2.0％，大豆蛋白胨1.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.06％，硫酸锰0.04％，吐温-80 0.08％，乳酸菌素促进剂0.15％，水95.67％，调节培养基的pH值至7.0；
S2、接种：取出实验室已分离的凝结芽孢杆菌，按照2.0％的接种量接种至100mL的培养基中，在36℃的温度下发酵培养36h，得发酵液；
S3、将步骤S2制得的发酵液于8000rpm的转速下离心15min，取上清液，将上清液进行微孔过滤除菌，然后调节pH值为7.0，用4℃，质量分数为65％的饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀，收集下层沉淀；
S4、将步骤S3收集的下层沉淀溶于为pH 6.5的磷酸钠缓冲液中，然后经透析，得到含有细菌素的粗提液；
S5、将步骤S4制得的粗提液经冷冻干燥浓缩，采用葡萄糖凝胶进行纯化，干燥，然后利用SDS(十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法测定其分子量，即得。
优选地，步骤S1中所述的乳酸菌素促进剂由精氨酸与维生素D按重量比10～15：1～4组成。
优选地，步骤S1中所述的乳酸菌素促进剂由精氨酸与维生素D按重量比13：3组成。
优选地，步骤S3中进行微孔过滤除菌时过滤孔径大小为0.45μm。
优选地，步骤S3中所述的沉淀为将过滤除菌后的发酵液与硫酸铵溶液混合后，于8000rpm转速下离心20min，即可。
优选地，步骤S4中所述的透析过程为用分子量为1000Da的透析袋透析。
优选地，步骤S5中所述的冷冻干燥过程为将粗提液置于-50～-40℃，5～10Pa下冷冻处理20～30min即可。
传统的用于培养凝结芽孢杆菌的培养基中含有的成分包含葡萄糖，牛肉膏，酵母浸粉，乙酸钠，磷酸氢二钾，柠檬酸二胺，硫酸镁，硫酸锰，吐温80等，本申请与传统的培养基相比，在保证培养效果的前提下，去掉了某些组分，有效降低了生产成本。
发明人在实际研发过程中，对培养温度、培养时间及接种量等因素均进行了大量筛选，最终筛选出一个最佳组合范围，在所述范围内，可以大大提高凝结芽孢杆菌素的产量，而且发明人选择凝结芽孢杆菌的原因包括可耐高温，易贮藏，且可生存的温度和PH范围广，更易于发酵等，得到产量大的乳酸菌素容易，这样同样可以保证细菌素的产量。
同时，发明人在进一步研发过程中，惊喜发现，将精氨酸与维生素D按一定比例加入，可以为细菌补充足够的氨基酸及其他营养成分，促进了细菌素的生成，有利于提高凝结细胞芽孢杆菌素的产量。
与现有技术相比，本发明提供的凝结芽孢杆菌素的提取方法具有如下优势：
(1)本发明提供的凝结芽孢杆菌素的提取方法，显著提高了产量，且纯度高，生产成本低；
(2)本发明提供的提取方法，采用自制培养基培养菌种，与传统培养基相比，去掉了某些组分，降低了培养基的制作成本，适于凝结芽孢杆菌素的工业化大规模生产；
(3)本发明提供的提取方法，向培养基中加入了乳酸菌素促进剂，可以有效促进凝结芽孢杆菌素的生成，提高了产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
所述凝结芽孢杆菌可购自北纳生物科技有限公司，产品编号为BNCC136363；所述精氨酸为L-精氨酸，可购自西安旭全生物技术有限公司，CAS号为74-79-3；所述维生素D可购自江苏佰耀生物科技有限公司；所述金黄色葡萄球菌为ATCC6538，所述大肠杆菌为ATCC25312，所述巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌，编号为bio-67665，所述沙门氏菌为乙型副伤寒沙门氏菌，编号为bio-00025，均可购自中国微生物菌种保藏中心；所述葡萄糖凝胶为Sephadex-G100，可购自南京森贝伽生物科技有限公司。
实施例1一种凝结芽孢杆菌素的提取方法
所述凝结芽孢杆菌素的提取方法，包括如下步骤：
S1、配制培养基：将下列组分按所述重量百分数加入，混合均匀：葡萄糖1.8％，大豆蛋白胨1.2％，酵母浸粉0.3％，硫酸镁0.04％，硫酸锰0.02％，吐温-80 0.06％，乳酸菌素促进剂0.1％，水96.48％，调节培养基的pH值至6.8；所述的乳酸菌素促进剂由精氨酸与维生素D按重量比10～15：1～4组成；
S2、接种：取出实验室已分离的凝结芽孢杆菌，按照1.5％的接种量接种至100mL的培养基中，在36℃的温度下发酵培养32h，得发酵液；
S3、将步骤S2制得的发酵液于7000rpm的转速下离心10min，取上清液，将上清液进行微孔过滤除菌(过滤孔径大小为0.45μm)，然后调节pH值为7.0，用4℃，质量分数为60％饱和度的硫酸铵溶液混合后，于8000rpm转速下离心20min，收集下层沉淀；
S4、将步骤S3收集的下层沉淀溶于为pH6.5的磷酸钠缓冲液中，然后经用分子量为1000Da的透析袋透析，得到含有细菌素的粗提液；
S5、将步骤S4制得的粗提液经冷冻干燥浓缩，采用Sephadex-G100进行纯化，干燥，然后利用SDS-PAGE的方法测定其分子量，即得；所述的冷冻干燥过程为将粗提液置于-50℃，5Pa下冷冻处理20min即可。
实施例2一种凝结芽孢杆菌素的提取方法
所述凝结芽孢杆菌的提取方法，包括如下步骤：
S1、配制培养基：将下列组分按所述重量百分数加入，混合均匀：葡萄糖2.2％，大豆蛋白胨1.8％，酵母浸粉0.7％，硫酸镁0.08％，硫酸锰0.06％，吐温-80 0.1％，乳酸菌素促进剂0.2％，水94.86％，调节培养基的pH值至7.2；所述的乳酸菌素促进剂由精氨酸与维生素D按重量比15：4组成；
S2、接种：取出实验室已分离的凝结芽孢杆菌，按照2.5％的接种量接种至100mL的培养基中，在38℃的温度下发酵培养40h，得发酵液；
S3、将步骤S2制得的发酵液于9000rpm的转速下离心20min，取上清液，将上清液进行微孔过滤除菌(过滤孔径大小为0.45μm)，然后调节pH值为7.0，用4℃，质量分数为70％饱和度的硫酸铵溶液混合后，于8000rpm转速下离心20min，进行沉淀，收集下层沉淀；
S4、将步骤S3收集的下层沉淀溶于为pH6.5的磷酸钠缓冲液中，然后经分子量为1000Da的透析袋透析，得到含有细菌素的粗提液；
S5、将步骤S4制得的粗提液经冷冻干燥浓缩，采用Sephadex-G100进行纯化，干燥，然后利用SDS-PAGE的方法测定其分子量，即得；所述的冷冻干燥过程为将粗提液置于-40℃，10Pa下冷冻处理30min即可。
实施例3一种凝结芽孢杆菌素的提取方法
所述凝结芽孢杆菌素的提取方法，包括如下步骤：
S1、配制培养基：将下列组分按所述重量百分数加入，混合均匀：葡萄糖2.0％，大豆蛋白胨1.5％，酵母浸粉0.5％，硫酸镁0.06％，硫酸锰0.04％，吐温-80 0.08％，乳酸菌素促进剂0.15％，水95.67％，调节培养基的pH值至7.0；步骤S1中所述的乳酸菌素促进剂由精氨酸与维生素D按重量比13：3组成；
S2、接种：取出实验室已分离的凝结芽孢杆菌，按照2.0％的接种量接种至100mL的培养基中，在36℃的温度下发酵培养36h，得发酵液；
S3、将步骤S2制得的发酵液于8000rpm的转速下离心15min，取上清液，将上清液进行微孔过滤除菌(过滤孔径大小为0.45μm)，然后调节pH值为7.0，用4℃，质量分数为65％的饱和度的硫酸铵溶液混合后，于8000rpm转速下离心20min，进行沉淀，收集下层沉淀；
S4、将步骤S3收集的下层沉淀溶于为pH 6.5的磷酸钠缓冲液中，然后经分子量为1000Da的透析袋透析，得到含有细菌素的粗提液；
S5、将步骤S4制得的粗提液经冷冻干燥浓缩，采用Sephadex-G100进行纯化，干燥，然后利用SDS-PAGE的方法测定其分子量，即得；所述的冷冻干燥过程为将粗提液置于-45℃，8Pa下冷冻处理25min即可。
对比例1一种凝结芽孢杆菌素的提取方法
所述凝结芽孢杆菌素的提取方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例1在制备培养基时，所述的乳酸菌素促进剂由精氨酸与维生素D按重量比1：1组成。
对比例2一种凝结芽孢杆菌的提取方法
所述凝结芽孢杆菌素的提取方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2在制备培养基时，所述的乳酸菌素促进剂仅为精氨酸。
对比例3一种凝结芽孢杆菌的提取方法
所述凝结芽孢杆菌素的提取方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2在制备培养基时，所述的乳酸菌素促进剂仅为维生素D。
试验例1接种量的筛选
1.试验样品：凝结芽孢杆菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；沙门氏菌；巴氏杆菌；2.试验方法：本发明实施例3所述的提取方法，分别将接种量修改为1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％，利用牛津杯抑菌试验对所制备得到的细菌素的纯度进行检测。
牛津杯抑菌试验：
具体操作步骤如下：
1、取出实验室已分离的凝结芽孢杆菌，按照1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的接种量接种到100mL的培养基中，在温度为37℃的环境里，培养36h，得到发酵液，最后通过硫酸铵沉淀、透析袋进行透析，Sephadex-G100进行纯化，干燥，得到纯化干品。
2、指示菌的复苏：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌按1:100的比例加入到高压好的LB Broth中。其中，巴氏杆菌培养基需加入5％的血清。
3、加热LB Broth Agar培养基，然后倒入约20mL的固体培养基至无菌的平板中，待平板凝固后，加入200μL的指示菌液。
4、待指示菌液吹干，将无菌的牛津杯放入含有指示菌的平板，在牛津杯中各加入50μL的样品。试验设计如下：第1组为1％接种量组；第2组为1.5％接种量组；第3组为2.0％接种量组；第4组为2.5％接种量组；第5组为3.0％接种量组。
(4)将固体平板放入37℃恒温培养箱，培养至24h，游标卡尺用于测量抑菌圈的大小，并做好记录。
3.试验结果：具体试验结果见表1。
表1不同接种量对指示菌抑菌圈直径的大小
由表1可知，当接种量为2％时，这四种菌的抑菌圈直径均最大，因此，接种量2％为最佳接种量。
试验例2培养时间筛选
1.试验样品：凝结芽孢杆菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；沙门氏菌；巴氏杆菌；2.试验方法：本发明实施例3所述的提取方法，分别将培养时间修改为24h，32h，36h，40h，48h，利用牛津杯抑菌试验对所制备得到的细菌素的纯度进行检测。3.试验结果：具体试验结果见表2。
表2不同培养时间对指示菌抑菌圈直径的大小
由表2可知，当培养时间为36h时，对各种细菌的抑菌圈直径最大，因此，培养时间36h为最佳培养时间。
试验例3培养温度的筛选
1.试验样品：凝结芽孢杆菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；沙门氏菌；巴氏杆菌；2.试验方法：本发明实施例3所述的提取方法，分别将培养温度修改为25℃，36℃，37℃，38℃，40℃，利用牛津杯抑菌试验对所制备得到的细菌素的纯度进行检测。
3.试验结果：具体试验结果见表3。
表3不同培养时间对指示菌抑菌圈的大小
由表3可知，当培养温度为37℃时，对各菌种的抑菌圈直径达到最大值，因此，37℃的培养温度为最佳培养温度。
试验例4凝结芽孢杆菌素产量测定(可以)
1.试验样品：实施例1-3及对比例1-3提取的凝结芽孢杆菌素；
2.试验方法：将上述凝结芽孢杆菌素采用牛津杯法，以大肠杆菌及巴氏杆菌作为指示菌，检测其抑菌圈直径大小，抑菌圈直径越大，对应的试验方法提取的凝结芽孢杆菌素的产量越多。
3.试验结果：具体试验结果见表4。
表4不同试验样品的抑菌圈直径大小对比
试验样品
大肠杆菌(mm)
巴氏杆菌(mm)
实施例1
26.56
27.35
实施例2
25.88
28.52
实施例3
28.52
30.38
对比例1
21.06
22.32
对比例2
19.96
20.56
对比例3
18.75
19.46
由表4可知，采用本发明实施例1-3所述方法提取的凝结芽孢杆菌素的含量显著高于对比例1、对比例2及对比例3组，尤其是实施例3组，对大肠杆菌、巴氏杆菌的抑菌圈直径分别达到28.52、30.38，产量极高，因此，实施例3为本发明的最佳实施例，而对比例1及对比例2由于破坏了乳酸促进剂中各组分之间的相互协同作用，导致产量明显降低。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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