一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法
阅读说明：本技术 一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法 (Method for testing clostridium perfringens in drinking natural mineral water ) 是由 郭蕊静 赵秉谦 高莹 柳兰静 王仕光 李艳蓉 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本申请涉及微生物分析检测领域,具体公开了一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法。检验方法为：a.先采用滤膜对水样进行过滤,然后将滤膜紧贴放置在底层培养基上,再在滤膜上铺设中层培养基,在35-37℃的温度下,厌氧倒置培养24-26h,计数黑色菌落数；b.挑取黑色菌落3-5个,分别接种于液体硫乙醇酸盐培养基上,在35-37℃的温度下,培养18-24h后,取黑色菌落进行确证性试验。本申请的检验方法使得培养后的菌落黑色特征明显,易于辨识,检测结果的准确度较高。(The application relates to the field of microbiological analysis and detection, and particularly discloses a method for detecting clostridium perfringens in drinking natural mineral water. The detection method comprises the following steps: a. firstly, filtering a water sample by adopting a filter membrane, then, closely attaching the filter membrane to a bottom layer culture medium, then, paving a middle layer culture medium on the filter membrane, carrying out anaerobic inverted culture for 24-26h at the temperature of 35-37 ℃, and counting the number of black colonies; b. 3-5 black colonies are selected, inoculated on a liquid thioglycollate medium, cultured at the temperature of 35-37 ℃ for 18-24h, and then taken for a confirmation test. The testing method provided by the application has the advantages that the black characteristics of the cultured bacterial colony are obvious, the identification is easy, and the accuracy of the detection result is higher.)
技术领域
本申请涉及微生物分析检测领域，更具体地说，它涉及一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法。
背景技术
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为厌氧型革兰氏阳性产芽孢的杆状菌，广泛分布于自然界的水源、土壤及人和动物的肠道中。产气荚膜梭菌是一种条件致病菌，会引起人体出现食物中毒和气性坏疽等疾病。根据GB 8537-2018《食品安全国家标准饮用天然矿泉水》中要求，从同一批矿泉水样品中采集5件样品，每件样品的采样量为50mL，均不得检出产气荚膜梭菌。
目前，产气荚膜梭菌的检测方法通常采用GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中的相关检测方法，即将矿泉水水样通过滤膜过滤后，将滤膜紧贴在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）培养基上进行倒置厌氧培养，计数黑色菌落并取黑色菌落做进一步的验证实验。但是，由于产气荚膜梭菌需要在厌氧条件下进行培养，而在实际检验过程中，并不能完全保证厌氧条件，可能会在观察菌落等情况中将氧气引入，因此使得培养后会产生无明显黑色特征的菌落，该菌落按照标准要求会被判定为阴性而不继续进行验证实验，产生假阴性结果，从而出现漏检情况，这并不能真实的反映出矿泉水水样中产气荚膜梭菌的存在情况，大大降低了检测结果的准确度。
发明内容
为了使得菌落的黑色特征明显，易于辨识，从而提高产气荚膜梭菌检测结果的准确度，本申请提供一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法。
本申请提供的一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，采用如下的技术方案：
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，包括以下步骤：
a.先采用滤膜对水样进行过滤，然后将滤膜紧贴放置在底层培养基上，再在滤膜上铺设中层培养基，在35-37℃的温度下，厌氧倒置培养24-26h，计数黑色菌落数；
所述底层培养基和中层培养基均采用亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂培养基或胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基；
b.挑取黑色菌落3-5个，分别接种于液体硫乙醇酸盐培养基上，在35-37℃的温度下，培养18-24h后，取黑色菌落进行确证性试验。
通过采用上述技术方案，本申请的底层培养基选用亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）培养基或胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（TSC）培养基，可以使得滤膜上的产气荚膜梭菌在厌氧条件下把两种培养基中的亚硫酸盐还原为硫化物，再与柠檬酸铁铵反应产生硫化铁，使菌落呈黑色；而滤膜上除了产气荚膜梭菌以外的杂菌则会被添加的抗生素所抑制，因此SPS培养基和TSC培养基使得黑色菌落均有一定的特征性。
本申请在滤膜上再铺设一层SPS培养基或TSC培养基，可以充分保证产气荚膜梭菌在厌氧环境下培养，降低了滤膜与空气中的氧气接触的可能性，从而使得产生的菌落黑色特征明显，易于分辨，降低了由于出现假阴性结果而产生漏检的可能性，提高了产气荚膜梭菌检测结果的准确度。
同时，由于产气荚膜梭菌在培养基上生长的过程中，硫化物的产生和铁离子的直接接触是菌落呈现黑色的关键因素，因此本申请在滤膜上加盖一层SPS培养基或TSC培养基可以使得产气荚膜梭菌与培养基充分接触，充分与铁离子接触并将铁离子传入细胞内，从而使得产生的黑色菌落特征明显，易于分辨，进一步提高了产气荚膜梭菌检测结果的准确度。
优选的，所述底层培养基和中层培养基均优选为胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基。
通过采用上述技术方案， TSC培养基中含有的卵黄乳液可以检测产气荚膜梭菌的卵磷脂酶活性，同时可以促进产气荚膜梭菌的生长，并且TSC培养基中含有的大豆蛋白胨中的营养更为丰富，同时柠檬酸铁胺的含量较高，易于形成黑色菌落。由于滤膜对水样进行过滤时，会出现菌体损害和菌量损失的可能性，因此本申请优选为TSC培养基可以进一步促进菌体的生长，使得培养后的菌落更加清晰，显现黑色更加明显，提高了检测结果的准确度。并且由于TSC培养基中使用的是酵母粉，粘度较小不容易结块，使得TSC培养基在培养产气荚膜梭菌时更加稳定，不容易结块。
优选的，所述中层培养基的用量为3-4mL。
通过采用上述技术方案，由于在选取黑色菌落时需要先刺破滤膜上覆盖的中层培养基再进行挑取，因此本申请通过控制中层培养基的用量进而控制中层培养基的厚度，降低了刺破中层培养基挑取黑色菌落过程的难度。
优选的，所述中层培养基上方再加盖顶层培养基；所述顶层培养基采用亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂培养基或胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基。
当滤膜上的产气荚膜梭菌数量较多时，在滤膜上覆盖中层培养基时可能会把部分滤膜上的产气荚膜梭菌带到中层培养基的表面，使得在中层培养基表面的产气荚膜梭菌不能处于完全厌氧环境中，进而使得培养后的菌落不显黑色或黑色不明显而影响计数结果。因此通过采用上述技术方案，当中层培养基已经凝固后，产气荚膜梭菌已固定在中层培养基里面或者表面，最后再加盖一层顶层培养基，使得所有的产气荚膜梭菌都完全在培养基内，更好的处于厌氧环境中，使得培养后的菌落黑色特征明显，易于分辨，提高了检测结果的准确度。
优选的，所述顶层培养基的用量为2-3mL。
通过采用上述技术方案，本申请通过控制顶层培养基的用量进而控制顶层培养基的厚度，使得在选取黑色菌落时刺破滤膜上覆盖的两层培养基的过程更为容易，降低了刺破中层培养基和顶层培养基后挑取黑色菌落过程的难度。
优选的，所述步骤a中，滤膜的孔径尺寸为0.22μm或0.45μm。
通过采用上述技术方案，本申请控制滤膜的孔径尺寸为0.22μm或0.45μm，使得滤膜的截留产气荚膜梭菌的效果较好，增加了产气荚膜梭菌留在滤膜上的数量，使得培养后的黑色菌落数量更多，更为明显，易于分辨。
优选的，所述滤膜的孔径尺寸优选为0.45μm。
通过采用上述技术方案，本申请进一步将滤膜的孔径尺寸优选为0.45μm，使得滤膜表面的开口较大，滤膜表面吸取的培养基较多，截留在滤膜上的产气荚膜梭菌获得的营养物质较多，使得滤膜在具有良好的截留产气荚膜梭菌效果的同时，利于产气荚膜梭菌的复苏，使得培养后的黑色菌落较多，更为明显，易于分辨。
优选的，所述步骤b中的确证性试验包括以下步骤：
将黑色菌落接种于含铁牛乳培养基的底部，在46-48℃的温度下水浴培养18-20h后，观察是否出现暴烈发酵现象，在24-26h内出现暴烈发酵现象的为阳性。
通过采用上述技术方案，本申请将黑色菌落接种于含铁牛乳培养基的底部，可以排除空气与黑色菌落接触的影响，提高确证性结果的准确度；并且本申请控制在特定的温度下培养特定的时间后，在24-26h内进行观察，可以降低阳性菌由于时间较短活力不足不能发生暴烈发酵现象而出现假阴性的结果的可能性，从而提高检测结果的准确度。
优选的，所述含铁牛乳培养基采用以下方法制得：
将硫酸亚铁溶解于水中，得到浓度为0.02-0.03g/mL的硫酸亚铁溶液，然后将硫酸亚铁溶液与牛奶混合均匀，在115-117℃的温度下煮沸灭菌15-20min，然后冷却至室温，得到含铁牛乳培养基；其中牛奶与水的体积比为（20-20.5）:1。
通过采用上述技术方案，本申请采用煮沸灭菌法并控制反应条件制得的含铁牛乳培养基，可以降低牛奶在高温高压下出现变性而影响牛奶发酵试验的准确性的情况发生，从而提高了检测结果的准确度。
优选的，所述步骤a之前，先采用质量浓度为0.1-0.15%的蛋白胨水将水样稀释100-1000倍。
通过采用上述技术方案，本申请在过滤前先对水样进行稀释处理，降低了由于水样中的产气荚膜梭菌浓度多高而导致无法正确清楚的计算黑色菌落数的可能性，从而提高了检测结果的准确度。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1.本申请的检验方法充分保证了产气荚膜梭菌在培养过程中的厌氧环境，使得培养后的菌落黑色特征明显，易于分辨，检测结果的准确度较高；
2.本申请的检验方法降低了黑色菌落在确证性实验中与氧气接触的可能性，从而降低了阳性菌由于活力不足而出现假阴性的结果的可能性；
3.本申请的检验方法通过控制中层培养基和顶层培养基的用量，降低了刺穿培养基时的困难程度，提高了挑取黑色菌落的便利性。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
以下制备例、实施例和对比例中：
0.22μm的滤膜购自德国默克密理博公司，批号：F8EA35906；
0.45μm的滤膜购自德国默克密理博公司，批号：F8HA73482；
TSC培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，批号：180427；
蛋白胨水购自青岛海博生物有限公司，货号：HB5218-1；
胰酶消化酪蛋白胨购自甘肃华安生物科技集团；
多粘菌素B硫酸盐购自深圳子科生物科技有限公司，货号：0319-100MU；
刃天青购自北京中生瑞泰科技有限公司。
制备例1
SPS培养基采用以下方法制得：
在100℃的温度下，将15g胰酶消化酪蛋白胨、10g酵母膏、0.5g柠檬酸铁铵和15g琼脂溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值为7.0，然后在温度为121℃，压力为103.4KPa的条件下，高压灭菌15min，之后冷却至50℃，加入5mL浓度为100g/L的亚硫酸钠水溶液、10mL浓度为1.2g/L的多粘菌素B硫酸盐水溶液和10mL浓度为12g/L的磺胺嘧啶钠水溶液摇匀，倾注平板。
制备例2
液体硫乙醇酸盐（FT）培养基采用以下方法制得：
在105℃的温度下，将15g胰酶消化酪蛋白胨、0.5g L-胱氨酸、5g葡萄糖、5g酵母膏、2.5g氯化钠、0.5g硫乙醇酸钠、0.001g刃天青、0.75g琼脂溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值为7.1，然后在温度为121℃，压力为103.4KPa的条件下，高压灭菌15min，冷却至室温。
制备例3
含铁牛乳培养基采用以下方法制得：
将1g硫酸亚铁溶解于50mL水中，得到浓度为0.02g/mL的硫酸亚铁溶液，然后将硫酸亚铁溶液与1000mL牛奶混合均匀，在115℃的温度下煮沸灭菌15min，然后冷却至室温，得到含铁牛乳培养基。
制备例4
含铁牛乳培养基采用以下方法制得：
将1.5g硫酸亚铁溶解于50mL水中，得到浓度为0.03g/mL的硫酸亚铁溶液，然后将硫酸亚铁溶液与1025mL牛奶混合均匀，在117℃的温度下煮沸灭菌20min，然后冷却至室温，得到含铁牛乳培养基。
实施例1
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，包括以下步骤：
a0.采用质量浓度为0.1%的蛋白胨水将50mL水样稀释100倍；
a.先用无菌镊子夹取灭菌的孔径尺寸为0.22μm的滤膜的边缘部分，将粗糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL经过步骤a0稀释后的水样注入滤器中，打开滤器阀门进行过滤。水样过滤完后，关上滤器阀门，取下滤器，然后用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，将滤膜移放在底层培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与底层培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。再在滤膜上倾倒3mL的中层培养基并覆盖平板表面，待凝固后倒置于厌氧培养装置内，在35℃的温度下，培养24h，计数黑色菌落数；
b.挑取步骤a中平板生长的黑色菌落3个，分别接种于制备例2制备的FT培养基上，在35℃的温度下，培养18h后，取黑色菌落进行确证性试验；
确证性试验包括以下步骤：
将黑色菌落接种于制备例3制备的含铁牛乳培养基的底部，在46℃的温度下水浴培养18h后，观察是否出现暴烈发酵现象，在24h内出现暴烈发酵现象的为阳性。
实施例2
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，包括以下步骤：
a0.采用质量浓度为0.125%的蛋白胨水将50mL水样稀释1000倍；
a.先用无菌镊子夹取灭菌的孔径尺寸为0.22μm的滤膜的边缘部分，将粗糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL经过步骤a0稀释后的水样注入滤器中，打开滤器阀门进行过滤。水样过滤完后，关上滤器阀门，取下滤器，然后用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，将滤膜移放在底层培养基，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与底层培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。再在滤膜上倾倒3.5mL的中层培养基并覆盖平板表面，待凝固后倒置于厌氧培养装置内，在36℃的温度下，培养25h，计数黑色菌落数；
b.挑取步骤a中平板生长的黑色菌落4个，分别接种于制备例2制备的FT培养基上，在36℃的温度下，培养21h后，取黑色菌落进行确证性试验；
确证性试验包括以下步骤：
将黑色菌落接种于制备例4制备的含铁牛乳培养基的底部，在47℃的温度下水浴培养19h后，观察是否出现暴烈发酵现象，在25h内出现暴烈发酵现象的为阳性。
实施例3
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，包括以下步骤：
a0.采用质量浓度为0.15%的蛋白胨水将50mL水样稀释100倍；
a.先用无菌镊子夹取灭菌的孔径尺寸为0.22μm的滤膜的边缘部分，将粗糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL经过步骤a0稀释后的水样注入滤器中，打开滤器阀门进行过滤。水样过滤完后，关上滤器阀门，取下滤器，然后用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，将滤膜移放在底层培养基，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与底层培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。再在滤膜上倾倒4mL的中层培养基并覆盖平板表面，待凝固后倒置于厌氧培养装置内，在37℃的温度下，培养26h，计数黑色菌落数；
b.挑取步骤a中平板生长的黑色菌落5个，分别接种于制备例2制备的FT培养基上，在37℃的温度下，培养24h后，取黑色菌落进行确证性试验；
确证性试验包括以下步骤：
将黑色菌落接种于制备例3制备的含铁牛乳培养基的底部，在48℃的温度下水浴培养20h后，观察是否出现暴烈发酵现象，在26h内出现暴烈发酵现象的为阳性。
实施例4
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，包括以下步骤：
a0.采用质量浓度为0.12%的蛋白胨水将50mL水样稀释1000倍；
a.先用无菌镊子夹取灭菌的孔径尺寸为0.22μm的滤膜的边缘部分，将粗糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL经过步骤a0稀释后的水样注入滤器中，打开滤器阀门进行过滤。水样过滤完后，关上滤器阀门，取下滤器，然后用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，将滤膜移放在底层培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与底层培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。再在滤膜上倾倒3.3mL的中层培养基并覆盖平板表面，待凝固后倒置于厌氧培养装置内，在35.5℃的温度下，培养24.5h，计数黑色菌落数；
b.挑取步骤a中平板生长的黑色菌落3个，分别接种于制备例2制备的FT培养基上，在35.5℃的温度下，培养19h后，取黑色菌落进行确证性试验；
确证性试验包括以下步骤：
将黑色菌落接种于制备例4制备的含铁牛乳培养基的底部，在46.5℃的温度下水浴培养18.5h后，观察是否出现暴烈发酵现象，在24.5h内出现暴烈发酵现象的为阳性。
实施例5
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，包括以下步骤：
a0.采用质量浓度为0.14%的蛋白胨水将50mL水样稀释100倍；
a.先用无菌镊子夹取灭菌的孔径尺寸为0.45μm的滤膜的边缘部分，将粗糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将50mL经过步骤a0稀释后的水样注入滤器中，打开滤器阀门进行过滤。水样过滤完后，关上滤器阀门，取下滤器，然后用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，将滤膜移放在底层培养基，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与底层培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。再在滤膜上倾倒3.8mL的中层培养基并覆盖平板表面，待凝固后倒置于厌氧培养装置内，在36.5℃的温度下，培养25.5h，计数黑色菌落数；
b.挑取步骤a中平板生长的黑色菌落4个，分别接种于制备例2制备的FT培养基上，在36.5℃的温度下，培养22h后，取黑色菌落进行确证性试验；
确证性试验包括以下步骤：
将黑色菌落接种于制备例3制备的含铁牛乳培养基的底部，在47.5℃的温度下水浴培养19.5h后，观察是否出现暴烈发酵现象，在25.5h内出现暴烈发酵现象的为阳性。
实施例1-5的底层培养基和中层培养基的选取如表1所示：
表1
项目
底层培养基
中层培养基
实施例1
制备例1制备的SPS培养基
制备例1制备的SPS培养基
实施例2
制备例1制备的SPS培养基
TSC培养基
实施例3
TSC培养基
制备例1制备的SPS培养基
实施例4
TSC培养基
TSC培养基
实施例5
TSC培养基
TSC培养基
实施例6
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，与实施例1的不同之处在于：步骤a中，在凝固后的中层培养基上方再倒入2mL的顶层培养基并覆盖平板表面；顶层培养基采用制备例1制备的SPS培养基。
实施例7
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，与实施例1的不同之处在于：步骤a中，在凝固后的中层培养基上方再倒入3mL的顶层培养基并覆盖平板表面；顶层培养基采用TSC培养基。
实施例8
一种饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验方法，与实施例1的不同之处在于：步骤b的确证性试验中，将黑色菌落接种于含铁牛乳培养基的顶部。
对比例1
按照GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中的58.5的方法进行检测，计数黑色菌落数。
性能检测
按照实施例1-8和对比例1的检验方法对矿泉水水样中的产气荚膜梭菌进行检测，观察菌落形态并进行菌落计算，结果如表2所示。
表2 性能检测结果表
项目
菌落形态
菌落数
确证性试验结果
实施例1
黑色菌落
14
有暴烈发酵现象
实施例2
黑色菌落
16
有暴烈发酵现象
实施例3
黑色菌落
16
有暴烈发酵现象
实施例4
黑色菌落
23
有暴烈发酵现象
实施例5
黑色菌落
28
有暴烈发酵现象
实施例6
黑色菌落
32
有暴烈发酵现象
实施例7
黑色菌落
38
有暴烈发酵现象
实施例8
黑色菌落
15
无暴烈发酵现象
对比例1
灰色菌落
16
无暴烈发酵现象
从表1可以看出，本申请实施例1-5的检验方法培养后的菌落具有明显的黑色特征，易于分辨，并且菌落数较多，经确证性试验后均有暴烈发酵现象发生，说明本申请在滤膜上覆盖一层中层培养基可以充分保证产气荚膜梭菌在培养过程中的厌氧环境，提高了检测结果的准确度；其中实施例5的菌落数多于实施例1-4，说明将底层培养基和中层培养基均优选为TSC培养基可以促进产气荚膜梭菌的生长，从而进一步提高检测结果的准确度。
实施例6-7的菌落数大于实施例1，说明再在中层培养基上加盖一层顶层培养基可以进一步保证产气荚膜梭菌在培养过程中处于厌氧环境，进一步提高了检测结果的准确度。
实施例8与实施例1相比菌落数基本相同，但是实施例8在确证性试验中无暴烈发酵现象发生，说明将黑色菌落接种于含铁牛乳培养基的顶部会使得黑色菌落与氧气接触，在相同的时间内不能发生暴烈发酵现象，从而出现假阴性的结果，降低了检测结果的准确度。
对比例1的检测方法培养后的菌落颜色为灰色，不具有明显的黑色特征，且无暴烈发酵现象发生，说明按照国标中只将滤膜放置在底层培养基上进行培养的方法不能使得产气荚膜梭菌完全处于厌氧环境中，从而降低了检测结果的准确度。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
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