化合物epz5676及其相关抑制剂在制备抗脑缺血疾病药物中的用途
阅读说明：本技术 化合物epz5676及其相关抑制剂在制备抗脑缺血疾病药物中的用途 (Application of compound EPZ5676 and related inhibitor thereof in preparation of anti-cerebral ischemic disease drugs ) 是由 朱依谆 刘新华 王静欢 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明属制药领域,涉及化合物EPZ5676在制药中的新用途,具体涉及化合物(C-(30)H-(42)N-8O-3)及其相关抑制剂在制备预防或治疗脑缺血疾病药物中的用途,本发明通过建立的小鼠脑缺血模型和OGD/R诱导的原代神经元细胞体外模型实验,结果表明EPZ5676通过改善脑缺血小鼠行为学症状,减少脑梗死体积,抑制炎症蛋白与凋亡蛋白表达,促进链接蛋白表达,对脑缺血疾病具有保护作用。所述的化合物EPZ5676可用于制备抗脑缺血药物,同时也为脑缺血疾病的研究提供了新的方向。(The invention belongs to the field of pharmacy, relates to a new application of a compound EPZ5676 in pharmacy, and particularly relates to a compound (C) 30 H 42 N 8 O 3 ) The invention relates to the use of a related inhibitor in the preparation of a medicament for preventing or treating cerebral ischemia diseases, and the results of the mouse cerebral ischemia model and the OGD/R-induced primary neuron cell in vitro model experiments show that EPZ5676 has the effects of reducing cerebral infarction volume, inhibiting the expression of inflammatory protein and apoptosis protein, promoting the expression of link protein and protecting cerebral ischemia diseases by improving the behavioral symptoms of the cerebral ischemia mouse. The compound EPZ5676 can be used for preparing anti-cerebral ischemia medicaments, and provides a new direction for the research of cerebral ischemia diseases.)
技术领域
本发明属制药领域，涉及化合物EPZ5676在制药中的新用途，具体涉及化合物(C30H42N8O3)及其相关抑制剂在制备预防或治疗脑缺血疾病药物中的用途。
背景技术
现有技术公开了脑缺血(又名脑卒中)是威胁人类健康的三大疾病之一，具有患病率高、复发率高、致残率高、死亡率高的特点。调查显示，缺血性卒中占脑卒中的60％～80％，然而，迄今临床干预中尚缺乏有效治疗缺血性脑卒中的药物；临床实践显示脑缺血后缺血区域会水肿，分泌大量炎性因子；由于神经元细胞为最敏感细胞，故梗死中心及其周围区域神经元细胞会出现大量死亡，因此如何保护神经元，减少神经元的死亡已成为业内研究脑缺血后神经修复的一大重点。
研究公开了化合物EPZ5676为有效的DOT1L组蛋白甲基化转移酶DOT1L抑制剂，具有显著的抗肺纤维化的作用，且可用于治疗白血病。但迄今，尚未见EPZ5676在脑缺血中的作用的相关报道。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供新的有效防治脑缺血疾病的药物，具体涉及化合物EPZ5676在制药中的新用途，尤其涉及化合物(C30H42N8O3)及其相关抑制剂在制备预防或治疗脑缺血疾病药物中的用途。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供新的有效防治脑缺血疾病的药物，具体涉及化合物EPZ5676在制药中的新用途，尤其涉及化合物(C30H42N8O3)及其相关抑制剂在制备预防或治疗脑缺血疾病药物中的用途。
本发明提供了化合物EPZ5676在防治脑缺血疾病的新药理作用和用途，通过建立的小鼠脑缺血模型和OGD/R诱导的原代神经元细胞体外模型实验，结果显示，在体内，EPZ5676能改善脑缺血小鼠行为学症状，减少脑梗死体积，抑制炎症蛋白与凋亡蛋白表达，促进链接蛋白表达；在体外，EPZ5676能降低炎症蛋白与凋亡蛋白表达，促进链接蛋白表达。因此，所述的化合物EPZ5676可用于制备抗脑缺血药物。
本发明所述的EPZ5676的分子式为：C30H42N8O3；其为有效的DOT1L组蛋白甲基化转移酶DOT1L抑制剂。
本发明中，采用C57小鼠线栓法制备脑缺血再灌损伤模型进行实验，Bederson评分检测小鼠脑缺血后行为学损伤，结果表明，EPZ5676可改善脑缺血小鼠行为学症状；TTC法检测小鼠脑缺血后脑梗死体积，结果表明，EPZ5676可减少脑梗死体积；免疫荧光法检测小鼠脑缺血后炎性指标、凋亡指标及链接指标的变化，结果显示，EPZ5676可降低炎性指标及凋亡指标的表达，升高链接指标的表达；Western blot法检测小鼠脑缺血后炎性蛋白、凋亡蛋白及链接蛋白的表达，结果显示，EPZ5676可降低炎性蛋白与凋亡蛋白的表达，升高链接蛋白的表达。
本发明中，体外通过OGD/R诱导大鼠原代皮质神经元细胞建立脑缺血模型，进行EPZ5676对脑缺血后神经元细胞的作用试验，免疫荧光结果显示，EPZ5676其能显著降低炎症指标与凋亡指标的表达；同时，Western blot结果显示，EPZ5676其能显著降低炎性蛋白与凋亡蛋白的表达，升高链接蛋白的表达；实验结果证实所述化合物EPZ5676对脑缺血疾病具有保护作用。
本发明属提供了化合物EPZ5676(C30H42N8O3)及其相关抑制剂在制备预防或治疗脑缺血疾病药物中的用途，本发明通过建立的小鼠脑缺血模型和OGD/R诱导的原代神经元细胞体外模型实验，表明EPZ5676通过改善脑缺血小鼠行为学症状，减少脑梗死体积，抑制炎症蛋白与凋亡蛋白表达，促进链接蛋白表达，对脑缺血疾病具有保护作用；所述的化合物EPZ5676可用于制备抗脑缺血药物。
附图说明
图1是诱导小鼠脑缺血模型，显示了EPZ5676明显减少脑梗死体积。
图2是诱导小鼠脑缺血模型，显示了EPZ5676明显降低凋亡指标的定位，降低凋亡相关蛋白表达。
图3是诱导小鼠脑缺血模型，显示了EPZ5676明显降低炎症指标的定位，降低炎症相关蛋白表达。
图4是诱导小鼠脑缺血模型，显示了EPZ5676明显促进链接指标的定位，促进链接相关蛋白表达。
图5是Western blot方法检测OGD/R损伤的原代神经元细胞的凋亡相关蛋白表达水平。
图6是Westernblot方法检测OGD/R损伤的原代神经元细胞的炎症相关蛋白表达水平。
图7是Westernblot方法检测OGD/R损伤的原代神经元细胞的链接相关蛋白表达水平。
图8是Immunofluorescence方法检测OGD/R损伤的原代神经元细胞的凋亡相关指标的表达。
图9是Immunofluorescence方法检测OGD/R损伤的原代神经元细胞的炎症相关指标的表达。
具体实施方式
实施例1EPZ5676对体外OGD/R损伤的原代神经元细胞的保护作用试验
分组：将原代培养的皮质神经元细胞随机分成5组，即：1)Sham组；2)I/R组；3)抑制剂10μM组；4)抑制剂20μM组；5)抑制剂40μM组。抑制剂提前给予4h，然后缺氧缺糖2h，在复氧4h，制备体外脑缺血模型。收集蛋白，用Westernblot法检测p53、PARP1、caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、iNOS、COX-2、VCAM-1、ZO-1、Claudin-1蛋白表达；爬片，用免疫荧光染色tunnel、caspase3、iNOS、VCAM-1指标。结果显示，EPZ5676能显著降低凋亡指标与炎症指标的表达；同时，降低炎性蛋白与凋亡蛋白的表达，升高链接蛋白的表达。
实验结果证明，所述的EPZ5676对OGD/R诱导的体外脑缺血模型有显著的保护作用，可制备抗脑缺血相关疾病的药物。
表1是诱导小鼠脑缺血再灌模型，EPZ5676明显改善行为学结果，
其中，Sham:假手术组；I/R:线栓制备的脑缺血再灌组；inhibitor:20mg/kg/dayEPZ5676，*:I/R和inhibitor组与Sham组相比，p<0.05；#:inhibitor组与I/R组相比，p<0.05。
表1.Bederson score.
实施例2EPZ5676对体内小鼠脑缺血模型的治疗作用
分组：体重21-24g雄性C57小鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后仰卧固定，开颈部正中皮肤，切口长约2cm。钝性分离皮下组织，暴露左侧颈总动脉(CCA)，向上依次分离暴露颈外动脉(ECA)与颈内动脉(ICA)，分别在颈总动脉，颈外动脉远心端挂线，活结结扎颈总动脉，死结结扎颈外动脉，然后在颈内动脉远心端挂线，用拉钩拉住。再在颈外动脉近心端挂线，打活结。然后在颈外动脉与颈内动脉“Y形”分叉处，用显微剪在偏颈外动脉处剪一小口，将线栓从切口处导入颈外动脉，顺势插入颈总动脉，然后拉紧结扎口，剪断一侧颈外动脉，在轻微牵拉颈外动脉残端，使得颈外动脉与颈内动脉在一条直线上，调整线栓角度，与颈前正中呈45°角水平向外的夹角。待线栓插入颈内动脉，移去颈内动脉的挂线，轻柔的将线栓导入颅内，遇阻力即停止，然后固定结扎线栓。剪去多余线栓，仅留1mm左右长的残端。移去颈总动脉的挂线，观察有无出血情况后，缝合切口。待梗塞1.5h后，打开切口，拔出线栓至颈外动脉与颈总动脉分支处。缝合皮肤，碘伏消毒后放置在笼中，全程注意保温，术后提供充足的水和食物。假手术组除不插线栓，其他操作与模型组相同。EPZ5676以2％DMSO+30％PEG300+5％吐温80+ddH2O溶解，将小鼠随机分为假手术组(Sham,ip.n＝10)，模型组(I/R,溶剂对照，ip.n＝10)，模型+EPZ5676组(inhibitor,20mg/kg/day,n＝10)。预给药7天后，造模。造模24小时后，行为学评价；TTC检测脑梗死体积；取材脑组织，4％多聚甲醛固定，包埋做石蜡切片，荧光染色tunnel、caspase3、iNOS、VCAM-1和ZO-1指标。收集脑组织，裂解蛋白，用Western blot法检测p53、PARP1、caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、iNOS、COX-2、VCAM-1、ZO-1、Claudin-1蛋白表达。结果显示，EPZ5676能改善脑缺血小鼠行为学症状，减少脑梗死体积，降低炎性指标及凋亡指标的表达，促进链接指标的表达；同时，抑制炎症蛋白与凋亡蛋白表达，促进链接蛋白表达。实验结果证明，所述的EPZ5676对线栓法制备的体内脑缺血模型有显著的保护作用。