一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法
阅读说明：本技术 一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法 (Method for purifying puerarin by two-dimensional preparation liquid chromatography ) 是由 刘君 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法,其特征在于,其具体步骤为：1)溶解提取物,上样到第一维色谱系统；2)洗脱第一维色谱,测器见峰切换阀,捕集柱捕集；3)切换阀,开始洗脱捕集柱,流出液上样到第二维色谱系统；4)洗脱第二维色谱柱,检测器确定目标物后收集。本申请的特点在于：生产周期短,节约时间,溶剂消耗少,节约成本,自动化程度高。(The invention relates to a method for purifying puerarin by two-dimensional preparation liquid chromatography, which is characterized by comprising the following specific steps: 1) dissolving the extract, and loading the extract into a first dimension chromatography system; 2) eluting the first dimension chromatogram, detecting the peak switching valve, and trapping by the trapping column; 3) switching a valve to start eluting the trapping column, and loading the effluent liquid to a second-dimensional chromatographic system; 4) eluting the second-dimension chromatographic column, and collecting after the detector determines the target substance. The application is characterized in that: the production period is short, the time is saved, the solvent consumption is low, the cost is saved, and the automation degree is high.)
技术领域
本发明涉及葛雌素纯化技术领域，具体的说，是一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法。
背景技术
葛根，为豆科多年生蝶形花亚科葛属植物的干燥根，其分布广泛，多生长于热带，亚热带地区，我国各地及东南亚，澳大利亚均有生长。大量研究表明在葛根中存在较多的植物雌激素，其中葛根素作为中国葛根特有的成分，受到广泛关注，1993年葛根素注射液批准上市以来，已在临床上广泛应用；同时在泰国野葛根中也发现了一种特有的植物雌激素-葛雌素(miroestrol)，作为第一种从植物体内提取到的非甾体雌激素，其雌激素样作用强于葛根素，具有很大的替代葛根素的潜力。
泰国野葛根(Pueraria mirifica)，同属豆科，广泛分布在泰国各地海拔300-800米的落叶林中，自古以来在泰国北部就作为女性的民间传统秘方食品。从其根茎中提取出来的葛雌素，是目前发现的最强植物雌激素，对心脑血管系统，免疫系统疾病都有较好的治疗作用，常被用来研究治疗骨质疏松症，更年期综合症及美容丰胸。
1931年，P.mirifica等就提出泰国野葛根具有恢复活力和保持健康的功能；1941年，Sukhavachana等研究表明泰国野葛根的块茎提取物对去卵巢大鼠具有雌激素样作用，能够刺激阴道角质化和增加子宫重量；1958年，Pope GS等从泰国野葛根中提取出一种植物雌激素-葛雌素；随后大量研究表明，作为第一种从植物体内提取到的非甾体雌激素，其可以缓解更年期症状，如潮热，沮丧，睡眠障碍及皮肤干燥等，同时能够有效抑制骨质疏松，还具有独特的抗氧化作用，能够减少β-淀粉样肽的沉淀，增强神经递质释放和活性，防止氧化损伤，一般认为抗氧化作用能够预防癌症，具有抗癌特性；葛雌素生物活性仅比17β-雌二醇低4倍，而17β-雌二醇是人体内活性最强的雌激素，对女性生殖系统具有重要调控作用，对全身许多组织器官也有影响，雌激素可刺激乳腺导管和结缔组织的增生，促使脂肪沉积于乳房，臀部等部位，维持第二性征。
目前，研究者们更关心葛雌素的生理活性，对其提取及纯化的研究并没有十分深入，广泛采用的使用甲醇从泰国野葛根中提取葛雌素，但是其操作步骤十分复杂，基本步骤为甲醇提取后，回收甲醇，浸膏用甲醇-乙醚溶液萃取，回收试剂，浸膏再用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水溶液萃取，回收乙酸乙酯，浸膏过层析柱，得到含有葛雌素的混合物，其纯度较低，并且收率也并不理想(Jones H E H，Pope G S.A METHOD FOR THE ISOLATION OFMIROESTROL FROM PUERARIA MIRIFICA[J].Journal of Endocrinology，1961，22(3)：303-312.)。有研究者使用的提取纯化方法是将泰国野葛根块茎打碎成粉末，再依次用正己烷，氯仿，乙酸乙酯提取，回收提取试剂得到浸膏，甲醇溶解后，通过层析柱，得到葛雌素及去氧葛雌素，虽然相对传统方法有所改进，但依然要重复萃取，试剂用量很大，周期较长(Yusakul G，Putalun W，Udomsin O，et al.Comparative analysis of the chemicalconstituents of two varieties of Pueraria candollei.[J].Fitoterapia，2011，82(2)：203-207.)。
上述两种提取及纯化方法，都存在的问题就是操作复杂，需要经过反复萃取，化学试剂用量较大，时间周期长，而纯化后的产物纯度与收率不能兼得，高纯度就意味者低收率。有学者通过索氏提取器提取，再过层析柱的方法，提取纯化，虽然试剂用量较少，但是索氏提取器提取周期依然很长，而且并不适合大规模生产(刘喜舞，叶惠煊，戴玲，等.泰国葛根化学成分研究[J].西北药学杂志，2015(6)：664-666.)。
二维液相色谱(2D-LC)是将相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维色谱柱分离后进入切换接口中，通过接口的富集、浓缩以及切割后进入第二维色谱柱继续分离。在一维系统中不能完全分离的组分，有可能在二维系统中得到较好的分离，因此整个二维系统的分离能力，系统分辨率、峰容量较一维色谱系统得到了大大提高。相较于传统二步制备分离，二维色谱使用的试剂量更少，用时更短，纯度及收率都有显著提高。目前，还没有人将低、中、高压制备液相色谱系统结合构建在线二维制备液相色谱系统，用于规模化制备生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法，其具体步骤为：
1)溶解提取物，上样到第一维色谱系统；
2)洗脱第一维色谱柱，检测器见峰切换阀，捕集柱捕集；
3)切换阀，开始洗脱捕集柱，流出液上样到第二维色谱系统；
4)洗脱第二维色谱柱，检测器确定目标物后收集。
在所述的步骤1)中，第一维色谱柱为玻璃柱，不锈钢柱，树脂柱中的一种，其直径为20-800mm；装填的填料可以是树脂等，其粒径为20um-200um；运行压力在0.2-10Mpa。
在所述的步骤2)中，第一维色谱系统所用流动相为甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，水种的一种，或几种组合；优选为乙醇和水组合。
在所述的步骤2)中，提取物的试剂为甲醇，乙醇，异丙醇中的一种或几种组合，优选为乙醇。
在所述的步骤2)中，上样量为装填填料量的千分之二至百分之五；优选为千分之八。
洗脱体积为柱体积的1倍到20倍体积之间，优选为11倍体积。
在所述的步骤2)和3)中，切换阀为六通阀，八通阀，十通阀中的一种；优选为六通阀。
在所述的步骤2)中，捕集柱为玻璃柱，不锈钢柱，树脂柱中的一种，其直径为10-200mm。
捕集柱填料为C18，树脂等，其粒径为50um-200um；优选为50um。
在所述的步骤3)中，捕集柱洗脱流动相为甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，水，以及以上溶剂的组合，优选为乙醇水。
在所述的步骤4)中，第二维色谱柱为不锈钢柱或玻璃柱，其直径为20-800mm；其粒径为5um-100um，优选为15um。
在所述的步骤4)中，第二维色谱系统所用流动相为甲醇，乙醇，乙酸乙酯，异丙醇，乙腈，水，以及以上溶剂的组合，优选为乙醇水。
洗脱体积为柱体积的1倍到20倍体积之间；优选为6倍。
在所述的二维制备液相色谱系统，是一种在线二维制备液相色谱系统，恒流泵通过切换阀连接到第一维中压色谱柱/第二维高压色谱柱/捕集柱，第一维中压色谱柱连接到检测器，检测器通过切换阀连接到捕集柱/废液瓶，捕集柱通过切换阀连接到第二维高压色谱柱，第二维高压色谱柱连接到检测器，检测器通过切换阀连接到馏分收集器/废液瓶。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
1)生产周期短，节约时间，传统的葛雌素分离纯化的方法均采用反复萃取，过层析柱的方法，周期长，本方法采用的二维制备液相色谱系统可克服其不足，第一维和第二维色谱柱为中/高压色谱柱，柱效高，流速大，分离快，传统层析柱需要几天的分离时间，二维制备液相系统数小时就能完成同样的分离工作，生产周期极大缩短；
2)溶剂消耗少，节约成本，传统化学分离提纯的方法操作过程繁琐，反复萃取溶剂消耗量大，本方法采用的二维制备液相色谱系统不需要反复萃取，提取液直接上样到色谱系统，经第一维分离被捕集柱富集后进入第二维分离系统进一步分离纯化，一次进样即可拿到纯品，只需使用相对很少的试剂就能制备出纯品，大大减少了生产成本；
3)自动化程度高，在线二维分析，计算机实时监控整个二维制备液相色谱系统，从上样，纯化到收集馏分，都在计算机控制下自动完成，减少人力成本；
4)产品纯度高，相较于传统方法二维制备液相色谱系统能够制得纯度很高的产品，HPLC纯度达到98％以上。
附图说明
图1、提取液LCMS谱图；
图2、第一维色谱系统分离谱图；
图3、第二维色谱系统分离谱图
图4、纯品LCMS谱图。
图5、纯品高分辨质谱图。
具体实施方式
以下提供本发明一种二维制备液相色谱纯化葛雌素的方法的具体实施方式。
实施例1
二维制备液相色谱系统制备葛雌素：
称取泰国野葛根粉末50g置于1L烧瓶中；量取500ml正己烷(10倍量)加入烧瓶中；烧瓶接上球形冷凝管，放入水浴锅中，70℃水浴冷凝回流2小时；烧瓶中的混合物抽滤，过滤得到的正己烷溶液舍弃，滤渣加500ml(10倍量)乙酸乙酯倒入烧瓶；烧瓶接上球形冷凝管，放入水浴锅中，70℃水浴冷凝回流2小时，重复提取2次；烧瓶中的混合物抽滤，合并过滤得到的乙酸乙酯溶液即为葛雌素提取液；乙酸乙酯提取液减压浓缩至浸膏；量取100ml 10％乙腈-水溶解浸膏，得到上样液，上样液HPLC分析谱图如图1所示；
第一维色谱柱为15*310mm中压玻璃柱，捕集柱为30*30mmC18静态柱，乙腈-0.16％TFA水溶液(1∶9)15ml/min流速，平衡10min，上样液通过上样泵泵入第一维色谱系统，上样体积20ml，上样结束，设置洗脱参数：乙腈-0.16％TFA水(1∶9)15ml/min流速洗脱5min，接着5min-35min以1％乙腈/min的梯度变化速率，上升到45％乙腈，35min-40min以乙腈-0.16％TFA水(95∶5)15ml/min流速冲洗5min，设置切换阀参数：在18.2min-19.0min且斜率大于0.1且信号强度阈值大于100mAu即切换阀，捕集柱开始捕集样品，第一维色谱系统制备谱图如图2所示；
第二维色谱柱为10*250mm C18静态柱，乙腈-0.16％TFA水(15∶85)4ml/min流速，平衡10min，以乙腈-0.16％TFA水(15∶85)4ml/min流速等度洗脱，捕集柱上样到第二维色谱柱，上样结束后，以乙腈-0.16％TFA水(15∶85)4ml/min流速等度洗脱，制备谱图如图三所示，设置馏分收集器收集34.7min的峰，即为葛雌素纯品；
图3、第二维色谱系统分离谱图
将上述收集到的葛雌素纯品，放到-80℃冰箱结冰，上冻干机，冻干即得葛雌素纯品粉末，纯度分析谱图如图4、图5所示：
上述冻干粉末为白色无定形粉末，LCMS确定其分子(M-H)-＝357.1344，(M-Cl)-＝393.111；1H-NMR(C3D6O，400MHz)δ：7.05(d，J＝8.6Hz，H-1，6.58(dd，T＝8.4，2.4Hz，H-2，6.36(d，J＝2.5Hz，H-4，6.23(s，H-7)，3.32(s，H-9)，2.74(m，H-12，2.79(m，H-13)，2.56(1H，d，J＝18.6Hz，H-16)，2.83(1H，d，J＝18.4Hz，H-16)，3.66(s，H-18)，1.97(2H，m，H-19)，0.55(s，H-20)，1.23(s，H-21)；13C-NMR(C3D6O，100MHz)δ131.0(C-1)，111.8(C-2)，157.2(C-3)，103.4(C-4)，153.6(C-5)，138.4(C-7)，117.3(C-8)，40.9(C-9)，113.5(C-10)，38.0(C-11)，45.1(C-12)，45.1(C-13)，79.0(C-14)，210.2(C-15)，54.7(C-16)，77.8(C-17)，79.0(C-18)，40.9(C-19)，32.2(C-21)。由δ7.05和δ6.58，δ6.58和δ6.36有相近的耦合常数，并通过COSY谱可知它们相互耦合，结合DEPT谱推断为CH。其余的δ6.23，δ3.32，δ3.66，δ0.55和δ1.23均为单一峰，结合COSY谱确认无任何耦合情况。δ2.74出现多重峰，推测是H-12和H-19耦合的结果，并结合COSY谱验证了这种情况。以上数据通过与文献(Identification ofDeoxymiroestrol as theActual Rejuvenating Principle of“KwaoKeur”，Puerariamirifica.The KnownMiroestrol May Be an Artifact[J].Journal of NaturalProducts，2000，63(2)：173-175.)比较基本一致，故确定其为葛雌素。
经过LCMS，NMR分析确定产物为葛雌素，纯度≥98％，收率83％。
一般两步纯化方法制备葛雌素：
称取泰国野葛根粉末50g置于1L烧瓶中；量取500ml正己烷(10倍量)加入烧瓶中；烧瓶接上球形冷凝管，放入水浴锅中，70℃水浴冷凝回流2小时；烧瓶中的混合物抽滤，过滤得到的正己烷溶液舍弃，滤渣加500ml(10倍量)乙酸乙酯倒入烧瓶；烧瓶接上球形冷凝管，放入水浴锅中，70℃水浴冷凝回流2小时，重复提取2次；烧瓶中的混合物抽滤，合并过滤得到的乙酸乙酯溶液即为葛雌素提取液；乙酸乙酯提取液减压浓缩至浸膏；量取100ml 10％乙腈-水溶解浸膏，得到上样液。
葛雌素第一次纯化，用15*310mm中压玻璃珠柱，10％乙腈-0.16％TFA水15ml/min流速，平衡10min，.量取葛雌素上样液20ml，通过六通阀进样；.以10％乙腈-0.16％TFA水15ml/min流速洗脱5min，接着5min-35min以1％乙腈/min的梯度变化速率，上升到45％乙腈，收集19.5min的峰，以95％乙腈-0.16％TFA水15ml/min流速冲洗5min.
收集的馏分旋蒸除去乙腈，加等体积乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，减压干燥，除去乙酸乙酯，加入乙酸乙酯等体积的水溶解，即得葛雌素浓缩液。
葛雌素第二次纯化，用10*250mm C18静态柱，15％乙腈-0.16％TFA水4ml/min流速，平衡10min，备用，量取葛雌素浓缩液100ml，通过六通阀进样，以15％乙腈-0.16％TFA水4ml/min流速等度洗脱，收集33.6min的峰，以95％乙腈-0.16％TFA水4ml/min流速冲洗5min。
将上述收集到的葛雌素纯品，放到-80℃冰箱结冰，上冻干机，冻干即得葛雌素纯品粉末，
经过LCMS，NMR分析确定产物为葛雌素，纯度≥98％，收率75％。
相对于普通两步纯化制备葛雌素，利用二维制备液相色谱系统，制得的葛雌素收率更高，避免了浪费。
实施例2
二维制备液相色谱系统制备葛雌素：
称取泰国野葛根粉末500g置于1L烧瓶中；量取5000ml正己烷(10倍量)加入烧瓶中；烧瓶接上球形冷凝管，放入水浴锅中，70℃水浴冷凝回流2小时；烧瓶中的混合物抽滤，过滤得到的正己烷溶液舍弃，滤渣加5000ml(10倍量)乙酸乙酯倒入烧瓶；烧瓶接上球形冷凝管，放入水浴锅中，70℃水浴冷凝回流2小时，重复提取2次；烧瓶中的混合物抽滤，合并过滤得到的乙酸乙酯溶液即为葛雌素提取液；乙酸乙酯提取液减压浓缩至浸膏；量取100ml10％乙腈-水溶解浸膏，得到上样液；
第一维色谱柱为36*460mm中压玻璃柱，捕集柱为30*30mmC18静态柱，乙腈-0.16％TFA水溶液(1∶9)100ml/min流速，平衡10min，上样液通过上样泵泵入第一维色谱系统，上样体积200ml，上样结束，设置洗脱参数：乙腈-0.16％TFA水(1∶9)15ml/min流速洗脱5min，接着5min-35min以1％乙腈/min的梯度变化速率，上升到45％乙腈，35min-40min以乙腈-0.16％TFA水(95∶5)15ml/min流速冲洗5min，设置切换阀参数：在18.2min-19.0min且斜率大于0.1且信号强度阈值大于100mAu即切换阀，捕集柱开始捕集样品；
第二维色谱柱为30*250mm C18静态柱，乙腈-0.16％TFA水(15∶85)4ml/min流速，平衡10min，以乙腈-0.16％TFA水(15∶85)36ml/min流速等度洗脱，捕集柱上样到第二维色谱柱，上样结束后，以乙腈-0.16％TFA水(15∶85)4ml/min流速等度洗脱，制备谱图如图4所示，设置馏分收集器收集34.7min的峰，即为葛雌素纯品；
将上述收集到的葛雌素纯品，放到-80℃冰箱结冰，上冻干机，冻干即得葛雌素纯品粉末；经过LCMS，NMR分析确定产物为葛雌素，纯度≥98％，收率85％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
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