阅读说明：本技术 Rna建库方法 (RNA library construction method ) 是由 李新 马玉 李瑞强 赵桂仿 于 2020-12-03 设计创作，主要内容包括：本申请提供了一种RNA建库方法。该建库方法包括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对mRNA进行片段化处理,得到片段化mRNA；对片段化mRNA进行逆转录,得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文库构建,得到降解RNA测序文库。通过利用poly(dT)与ploy(A)结合的方式富集mRNA后,先对富集的mRNA进行片段化处理,然后逆转录合成双链cDNA,之后利用经典的末端修复加A和TA碱基连接方式建库,提高对降解RNA的兼容性,使得该建库方法能够适合任意样本的RNA文库构建。该建库方法对降解RNA文库构建及产出数据质量的提高效果更显著。(The present application provides a method for RNA library construction. The database building method comprises the following steps: capturing the enriched mRNA using poly (dT) in combination with ploy (A); fragmenting mRNA to obtain fragmented mRNA; reverse transcription is carried out on the fragmented mRNA to obtain fragmented double-chain cDNA; and constructing a library of the fragmented double-stranded cDNA to obtain a degraded RNA sequencing library. After mRNA is enriched by combining poly (dT) and ploy (A), the enriched mRNA is firstly fragmented, then is subjected to reverse transcription to synthesize double-stranded cDNA, and then is subjected to library construction by using a classical terminal repair and A and TA base connection mode, so that the compatibility of degraded RNA is improved, and the library construction method can be suitable for RNA library construction of any sample. The database building method has more remarkable effect on the construction of the degraded RNA library and the improvement of the quality of output data.)

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。 下面将结合实施例来详细说明本申请。

针对现有技术所存在的情况，本发明研究了一种适用于降解或低RIN值(比如RIN值在 7以下的降解样本)RNA样本测序的绝对定量建库方法，该方法建库的各项数据结果同正常 或高RIN值样本无差异，适合大规模核酸提取得到的不同质量RNA样本测序建库，符合产业 化测序建库需求。

在该研究结果的基础上，申请人提出了本申请的方案。在一种优选的实施例中，提供了 一种RNA建库方法，该建库方法包括：利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA；对 mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA；对片段化mRNA进行逆转录，得到片段化双链cDNA；对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库。

本申请所提供的RNA建库方法，在利用poly(dT)与ploy(A)结合的方式富集mRNA后， 先对富集的mRNA进行片段化处理，然后逆转录合成双链cDNA，之后利用经典的末端修复 加A和TA碱基连接方式建库，提高对降解RNA的兼容性，使得该建库方法能够适合任意样本的RNA文库构建。该建库方法对降解RNA文库构建及产出数据质量的提高效果更显著。

在一种优选的实施例中，采用带poly(dT)的磁珠对总RNA中的mRNA进行捕获富集，得 到磁珠-mRNA复合物。具体的磁珠种类可以是已有产品，比如ABClonal的试剂盒(RK20302)。

在一种优选的实施例中，利用poly(dT)与ploy(A)的结合捕获富集mRNA包括：在第一 温度下对总RNA进行变性，然后将带poly(dT)的磁珠与总RNA混合，得到混合物；使得poly(dT) 与ploy(A)结合从而对mRNA进行第一次捕获，得到第一捕获产物；在第二温度下使磁珠释放 第一捕获产物，然后对磁珠处理后再次使得poly(dT)与ploy(A)结合从而对mRNA进行第二 次捕获；优选地，第一温度为60～68℃，最佳为65℃；优选地，第二温度为20～27℃，最佳为 25℃；优选地，第三温度为78～95℃，最佳为80℃。

在一种优选的实施例中，对mRNA进行片段化处理，得到片段化mRNA包括：将磁珠 -mRNA复合物与片段化缓冲液在90～95℃下孵育打断，得到片段化mRNA；更优选地，孵育 打断的时间为10～20min。

通过在90～95℃下孵育打断，将mRNA解链开来进行打断，形成片段化的mRNA，从而得到上机测序所需目的片段大小。需要说明的是，此处片段化后的mRNA是指未被磁珠吸附的上清液中的mRNA打断序列。通过取上清液中片段化的mRNA进行后续的逆转录合成。

在一种优选的实施例中，对片段化双链cDNA进行文库构建，得到降解RNA测序文库包括：对片段化双链cDNA进行末端修复加A，得到修复DNA；对修复DNA连接带分子标 记的接头，得到连接产物；对连接产物进行PCR扩增，得到降解RNA测序文库。

通过采用经典的TA连接方式来进行建库，能够提高不同来源样本的RNA建库通用性和 成功率。

在一种优选的实施例中，带分子标记的接头为双端带有分子标记的Y型接头。

在一种优选的实施例中，Y型接头包括接头1和接头2，接头1的序列如SEQ ID NO：1所示，接头2的序列如SEQ ID NO：2所示。

在一种优选的实施例中，带分子标记的接头中的分子标记为4～8nt的随机核酸序列，任意 2个Y型接头至少一端的分子标记不同；更优选地，分子标记为表2中的任一种。

上述优选实施例，通过采用TA碱基连接的方式在cDNA分子上引入分子标记(UMI)，该分子标记会伴随PCR扩增以及上机测序的整个过程，产生的测序数据可以通过计算UMI来定量基因表达丰度以及校正测序过程随机产生的错误碱基，因而是一种RNA样本的绝对定 量建库方法，尤其适用于降解或低质量RNA的绝对定量建库。

需要说明的是，目前涉及绝对定量转录组的方法中使用的UMI都是随机碱基，例如10-12 个N(A、T、G、C中任一种)组成的UMI，但是在双链接头退火过程中，很难有效合成相互匹配的互补双链，很多都是错配序列，通过切胶回收的方法产率极低，根本无法满足产业化需求，且成本也高。本申请中的分子标记是直接合成的固定已知序列的UMI，然后退火成双链，再把双链UMI混合一起使用，足够上万次的使用量，稳定性好，而且也兼容降解RNA。此外，本申请还对比了采用随机UMI的康测试剂盒，结果表明其性能不稳定，且GC曲线波 动特别大。而且，关于UMI接头，本申请也做过使用酶切的方法制备双链UMI接头，建库结 果和本发明结果一致，但这种方法进行UMI接头制备太繁琐，制备一次仅够5-20次的使用量， 且无修饰，存在降解风险。

采用含有修饰的表2所示的80种不同分子标记的Y型接头，Y型接头双端连接方式共6400 种UMI，可完全覆盖相同cDNA分子的数量，接头序列的修饰也可保证T碱基悬挂的稳定性。

在一种优选的实施例中，在对连接产物进行PCR扩增之前，建库方法还包括对连接产物 进行片段筛选的步骤；优选采用磁珠进行片段筛选。

在一种优选的实施例中，采用USER酶对连接产物中含U的第二链cDNA进行消化降解。 上述cDNA二链的合成时使用了dUTP，PCR前通过USER酶处理可以去除第二链cDNA，达到链特异性扩增和链特异性文库构建的目的。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例 中，mRNA捕获试剂盒为ABClonal的试剂盒(RK20302)，其余文库构建相关试剂为诺禾致 源生产的自配试剂(Novo试剂)。

需要说明的是，以下实施例按照图1所示的流程进行，主要步骤如下，具体详见实施例1。

1)使用ABClonal的试剂盒(RK20302)完成Poly A尾的mRNA捕获，通过Oligo d(T)磁珠捕获含有Poly A尾的mRNA，经反复洗涤后弃除上清，保留核酸在磁珠上并利用片段化缓冲液在94℃条件下孵育15分钟进行打断，随后马上进行逆转录合成双链cDNA；

2)使用自行配制的末端修复体系和PCR扩增体系进行cDNA末端修复加A碱基和PCR扩增，利用提前混合好的UMI接头进行连接；

3)PCR扩增循环数为13-16；待PCR反应结束后立即用全式金的磁珠纯化300-500bp范 围的片段。

实施例1

1.1 mRNA捕获

1.1.1试剂准备

将Poly(A)mRNA Purification Module从4℃取出，静置使其温度平衡至室温。

1.1.2 RNA样品准备

在一个Nuclease-free PCR管中，用Nuclease-free水将0.1～4μg RNA样本稀释至50μl，冰 上放置备用。

1.1.3磁珠制备

(1)将Oligo d(T)25捕获磁珠涡旋混匀，取20μL于1.5ml EP管中，加入200μL mRNA结 合缓冲液，吹打混匀；

(2)将1.5ml EP管置于磁力架上约2min，至溶液变澄清，弃上清；再加入200μLmRNA 结合缓冲液，吹打混匀，磁力架上约2min，至溶液变澄清，弃上清；

(3)取下1.5ml EP管加入50μL mRNA结合缓冲液，吹打混匀；将50μl磁珠加入到总RNA样品中，用移液器吹打6次以彻底混匀。

1.1.4 RNA变性及捕获

(1)将100μl样品置于PCR仪中，65℃保温5min，使RNA变性。

(2)室温25℃放置5min，使mRNA结合到磁珠上。

(3)将样品置于磁力架2min，使mRNA与总RNA分离；小心移除上清。

(4)将样品从磁力架上取出，用200μl Washing缓冲液吹打6次以彻底混匀，在磁力架 上静置5min，小心移除上清。

(5)将样品从磁力架上取出，取50μl Tris缓冲液重悬磁珠；用移液器吹打6次以彻底混 匀。

(6)将样品置于PCR仪中，80℃保温2min，室温静置2min，将mRNA洗脱下来。

(7)加入50μl mRNA结合缓冲液，用移液器吹打6次以彻底混匀。

(8)室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。

(9)将样品置于磁力架5min，使mRNA与总RNA分离；小心移除上清。

(10)将样品从磁力架上取出，用200μl Washing缓冲液吹打6次以彻底混匀，在磁力架 上静置5min，小心移除全部上清，瞬时离心后再次移除上清。

(11)按照下表配制1x Frag/Elute缓冲液：

表1：

(12)加入10.4μl Frag/Elute缓冲液,吹打混匀后，在94℃条件下孵育15分钟打断RNA (热盖温度105℃)。

(13)当温度降至4℃时，将离心管取出，瞬时离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，取 上清10μl至另一个PCR管中，立即进行下一步First strand cDNA的合成。

1.1.5 cDNA第一链合成

(1)取出RT Reagent室温溶解，冰上配制如下体系：

表2：

(2)使用移液器吹打混匀，瞬时离心，将体系放置PCR仪中：

表3：

1.1.6 cDNA第二链合成

(1)将第二链合成反应缓冲液从冰箱中取出，冰上配制如下反应体系：

表4：

需要说明的是，cDNA二链合成是以dNTP为填充底物，在DNA聚合酶的作用下完成互补链的合成，此处加入了dUTP，合成的二链即含有U碱基，后续的USER酶可针对U碱基 消化二链，实现链特异性扩增和文库构建。

(2)使用移液器吹打混匀，瞬时离心后，将样本置于PCR仪(热盖温度关闭)，

16℃保温1h，4℃hold；

(3)取144μl(1.8×)全式金DNA clean beads(已平衡至室温)于1.5ml EP管中，向其 中加入80μl上述反应体系，充分混匀。室温静置5min，磁力架上静置5min，弃上清。

(4)保持EP管在磁力架上，取200μl新鲜配制的80％乙醇加入EP管中，静置30s，弃上清。

(5)重复步骤(4)，将磁珠用80％乙醇再洗1次后，用10μl枪头将残留液体彻底吸干； 室温晾干磁珠3-5min。

(6)将EP管从磁力架上取下来，加入43μl无核酸酶水，充分混匀，室温放置5min，磁力架上放置5min，取42μl上清液于0.2ml EP管中，进行下一步。

注：双链cDNA产物可在-20℃暂存过夜。

1.2末端修复加A及UMI接头连接：

1.2.1末端修复加A

(1)采用自行配制的修复缓冲液和修复酶(Klenow酶+T4 DNA聚合酶+T4 PNK)从冰箱取出，按照以下体系依次加入试剂：

表5：

(2)使用移液器轻柔混匀，瞬时离心，将体系置于PCR仪：

表6：

(3)反应结束后立即放置冰上，进行下一步接头连接反应。

1.2.2接头连接

Y型接头制备：

在制备Y型接头之前，评估不同物种1ug起始量的总RNA文库中同一reads的分子数。 通过生信分析统计发现人类、兔子、山羊、水稻及烟草等样本文库中分子数排名前5的reads 最多不超过5000(如图2所示)。因此，设计UMI的种类如若超过该数量即可完全覆盖reads 的分子数，达到定量的目的。

在引物合成公司订购以下接头，通过HPLC纯化得到冻干粉，加水溶解后进行退火合成 双链接头；其中，NNNNN实为80种不同的固定序列，分别合成在接头1中，如表8所示，而接头2中的NNNNN为与接头1中NNNNN互补的序列，先确保接头1与接头2的NNNNN 序列为互补序列，然后再进行退火；随后，将以下含有不同NNNNN碱基的80种双链互补接 头等摩尔混合制备成接头混合液，文库双端80乘80，即6400种接头可完全覆盖RNA的分子 数。

表7：

接头名称	序列
		接头1	5'-acactctttccctacacgacg<u>ctcttccgatct</u>nnnnn*-t-3′(SEQ ID NO：1)
接头2	5’-p-nnnnnagatcggaagagcacacgtctgaactccagtc-3’(SEQ ID NO：2)

*：硫代磷酸键修饰

P：磷酸化修饰

NNNNN为以下序列信息

表8：

TACGT

TGAGT

TAACC

CTCAA

CGACG

ACCCC

TCATC

TCGTC

GATTA

GGATC

GCGAG

ATGTG

CCCAA

AGGAA

CGTGT

ACGGA

TTCTA

GTCAT

AGTGA

CTTAC

TTCCT

CAGCC

AATGG

ATTTC

GTCAA

GTCGG

CGCAA

ACTCA

TCAGT

AATCG

AACAG

CGTGG

TGATC

TACCA

GGTTT

CCCGA

CACTC

CACTT

GGGCG

GAATT

GTAAG

CCTAC

GATAC

ACGAA

CCCTG

CCAGT

GACGA

TGCAT

GGCGA

AGGTG

TGGAC

TCTAT

CAGGG

CGTAT

TTGCT

TTATG

GGATG

GTTTT

TCTGA

TTAGA

AAGCT

GCTCA

CTTGC

GACCC

CAGTC

ACAAG

CATCA

TTAGC

GAGCG

TCACC

ACGTT

AGACC

CTATT

AGAGA

TGGCT

GTTCT

ATGAG

GAGGC

ATACG

ACGAG

(1)按照下表加入连接体系：

表9：

(2)使用移液器吹打混匀，瞬时离心后，将样本置于PCR仪(热盖温度关闭)， 20℃保温30min，4℃hold；

1.2.3连接产物片段筛选

(1)向连接产物中加入20.3μl无核酸酶水，补足至100μl体系。

(2)取30μl(0.3×)全式金DNA clean beads(已平衡至室温)于1.5ml EP管中，向其 中加入100μl上述反应体系，充分混匀。室温静置5min，磁力架上静置5min，直至溶液变澄 清(切记保留上清)。

(3)将上清液转移至另一个1.5ml EP管中，加入30μl(0.3×)全式金DNA cleanbeads (已平衡至室温)，吹打混匀；室温静置5min，磁力架上静置5min，丢弃上清。

(4)保持EP管在磁力架上，取200μl新鲜配制的80％乙醇加入EP管中，静置30s，弃上清。

(5)重复步骤(4)，将磁珠用80％乙醇再洗1次后，用10μl枪头将残留液体彻底吸干； 室温晾干磁珠3-5min。

(6)将EP管从磁力架上取下来，加入23μl无核酸酶水，充分混匀，室温放置5min，磁力架上放置5min，取22μl上清液于0.2ml EP管中，进行下一步。

1.3文库扩增及片段筛选

(1)将PCR mix、F引物和R引物及USER酶从-20℃冰箱中取出，冰上配制PCR体系。

表10：

(2)吹打混匀后，瞬时离心，置于PCR仪中。

表11：

注：样本质量满足要求时，100ng及以上样本均可使用13个循环进行扩增。样本质量浓 度和RIN值不满足要求时，增加2～15个循环。

(3)向PCR产物中加入50.3μl无核酸酶水，补足至100μl体系。

(4)取60μl(0.6×)全式金DNA clean beads(已平衡至室温)于1.5ml EP管中，向其中 加入100μl上述反应体系，充分混匀。室温静置5min，磁力架上静置5min，直至溶液变澄清 (切记保留上清)。

(5)将上清液转移至另一个1.5ml EP管中，加入15μl(0.15×)全式金DNA cleanbeads (已平衡至室温)，吹打混匀；室温静置5min，磁力架上静置5min，丢弃上清。

(6)保持EP管在磁力架上，取200μl新鲜配制的80％乙醇加入EP管中，静置30s，弃上清。

(7)重复步骤(4)，将磁珠用80％乙醇再洗1次后，用10μl枪头将残留液体彻底吸干； 室温晾干磁珠3-5min。

(8)将EP管从磁力架上取下来，加入12μl无核酸酶水，充分混匀，室温放置5min，磁力架上放置5min，取11μl上清液于0.5ml EP文库原液管中。

(9)取1μl测试文库原液Qubit值，稀释至1ng/μl(至少10μl)进行文库检测。

实施例2

分别使用本发明方法和康测试剂盒对提取的不同RIN值或降解程度的人源RNA样本(如图 3所示)进行测序建库，结果如表12所示：本发明方法对RNA样本展示了很好的兼容性，不同 RIN值或降解程度的RNA展示了近乎相同的数据质量(如表12所示)及库检峰图(如图4至图7 所示)；相反，康测试剂盒对低RIN值或降解RNA的兼容性较差，降解RNA的数据中Dup率较 高且接头含量占比极高(如表12所示)。

人源样本RNA降解情况如图3所示，除H7617样本外，其余三个样本均存在不同程度降解， 其中H7667样本降解最为严重，几乎无法观察到18S和28S条带。

表12：

实施例3：

利用本发明方法对山羊和梭梭样本进行测序建库，RNA起始量分别为50ng和100ng，数据 分析结果如表13所示，在该起始量下的数据结果同样有很好的产出和质量。

表13：

实施例4：

以100ng山羊睾丸样本RNA为例，分别使用本发明方法中的接头和酶切法制备的接头(具 体序列见表14)进行建库，接头使用量均为10ng，数据结果如表17所示，各项数据结果无 明显差异，但酶切法接头制备过程较为繁琐，需要通过退火、延伸、酶切及切胶回收等过程 得到UMI接头，且制备的接头含量无法满足大规模产业化建库的需求。

表14：

Y型接头制备流程：

1.退火：将10ul 100uM的接头E1和E2混合，置于95℃孵育5min，关闭机器，冷却1h后取出，保证两条链缓慢冷却，提高准确退火的效率；

2.延伸补齐：使用如下试剂配比，37℃反应1h，延伸补齐双链序列。

表15：

实际	体积(μL)
		DNA	10
10×NEB缓冲液2	5
		25mM dNTP mix	2
无核酸酶水	31
		Klenow exo-(5U/μL)	3
总计	50

3.乙醇沉淀法提取延伸补齐的Y型接头

(1)向50ul延伸体系中加水补足至250ul，然后加入1.5μL Glycogen(20μg/μL)、13μL 3M NaAc、600μL-20℃100％乙醇。混匀后-80℃至少沉淀30min，4℃14000rpm离心30min。小心吸去上清液，留下离心管底部沉淀；

(2)加入1000μL-20℃保存的70％乙醇洗涤(现用现配)，14000rpm离心3min后去上清；

(3)重复用70％乙醇洗一次，14000rpm离心3min后去上清，干燥沉淀(干燥之后沉淀由白色变为无色)之后，加入20μL无核酸酶水溶解沉淀，37℃温育5min；

(4)取1μL进行Qubit定量，准备干净的0.5mL离心管，确认摩尔浓度，进行接头连接。

4.酶切制备用于建库连接的Y型接头：按照如下试剂配比，37℃反应1h，完成酶切反应。

表16：

试剂	体积(μL)
		DNA	5.22
无核酸酶水	16.28
		10×NEB cutsmart缓冲液	2.5
HpyCH4III	1
		总计	25

5.使用PAGE胶电泳对目标条带进行切胶回收，通过乙醇沉淀法得到最终使用的Y型接 头，所得接头质量范围：56ng～100ng。

表17：

从以上的描述中，可以看出，本发明的方法是一种应用广泛且对RNA质量要求宽泛的测 序建库方法，起始量可低至50ng，适用于各种生命科学及医学领域的真核生物转录组研究。

与相比现有技术，本申请的方案至少具有以下优点：

1)它是一种适用于降解或低RIN值RNA样本的绝对定量建库方法，对比正常或高RIN 值RNA样本，可得到相同质量的数据，包括Q20，Q30，Mapping率和Dup率等，适用于大 规模核酸提取的不同质量RNA样本在产业化测序过程中的文库构建。

2)使用的接头是直接通过寡核苷酸退火制备的，无需其他复杂工序且单次建库的接头使 用量仅为2.5uM，退火合成一次足够上万次使用量，符合产业化测序建库对接头使用的需求；

3)建库流程的简易化，仅三部主要操作即可完成建库；其中，各环节操作完全可用自动 化机械臂完成，有望实现自动产业化生产规模；另外，成本核算至单次反应的价格极低，与 普通转录组建库近似。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员 来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 天津诺禾致源生物信息科技有限公司

<120> RNA建库方法

<130> PN141679TJNH

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> 接头1

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(38)

<223> nnnnn表示UMI

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> 硫代磷酸键修饰

<400> 1

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnt 39

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223> 接头2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> nnnnn表示UMI

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化修饰

<400> 2

nnnnnagatc ggaagagcac acgtctgaac tccagtc 37

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(70)

<223> 接头E1

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(33)

<223> UMI

<400> 3

gttacaattc ttctacagtc annnnnnnnn nnncaggaga tcggaagagc gtcgtgtagg 60

gaaagagtgt 70

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223> 接头E2

<400> 4

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34