用于检测情感障碍的代谢标记物和试剂盒及使用方法
阅读说明：本技术 用于检测情感障碍的代谢标记物和试剂盒及使用方法 (Metabolic markers and kits for detecting affective disorders and methods of use ) 是由 贾伟 谢国祥 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于检测受试体情感障碍的代谢标记物,包括多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素和去甲肾上腺素；所述情感障碍选自抑郁症、精神分裂症和焦虑症,所述抑郁症,选自精神抑郁症、内源性抑郁症、反应性抑郁症、轻度抑郁症、重性抑郁症、精神病性抑郁症、神经性抑郁症、单相抑郁症和双相抑郁。本发明还提供了检测所述代谢标记物组合的试剂盒和使用方法,具有使用便捷、测试结果可靠的优点。(The invention provides a metabolic marker for detecting affective disorder of a subject, comprising dopamine, 5-hydroxytryptamine, gamma-aminobutyric acid, tryptophan, tyramine, kynurenine, 3, 4-dihydroxyphenylacetic acid, epinephrine and norepinephrine; the affective disorder is selected from depression, schizophrenia and anxiety, and the depression is selected from dysthymia, endogenous depression, reactive depression, mild depression, major depression, psychotic depression, nervous depression, unipolar depression and bipolar depression. The invention also provides a kit for detecting the metabolic marker combination and a using method, and the kit has the advantages of convenience in use and reliable test result.)
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，具体涉及通过一组能够检测受试体抑郁症的代谢标记物和包含所述代谢标记物的试剂盒，以及通过检测所述代谢标记物进行感情障碍的诊断。本发明还进一步涉及一种监控情感障碍治疗效果的方法。
背景技术
抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。抑郁症是一个常见的心理疾病，截止至2017年，全球患病人数超过3.22亿，患病率高达4.4％。由于抑郁症患者特殊的心理状态，和有限的临床诊断水平，抑郁症的识别率不足20％。我国每年自杀的人群有40％是因为患有抑郁症。然而，现阶段抑郁症患者的人群在隐性的扩大，并朝着低龄化发展。
目前，对于抑郁症的诊断主要标准为国际疾病分类(ICD-10)和精神疾病的诊断和统计手册(DSM-IV)。国内以ICD-10为标准。抑郁症诊断的难点在于：1、病像不典型化：与其他精神疾病一样，当代抑郁症的临床病像呈不典型趋向。典型的“三低”症状(情绪低落，思维迟钝及动作行为减少)已较少见，这与近代诊断分类的抑郁症范围扩大和涉及患者的应激、人格及生活习惯等因素有关。例如有的抑郁症患者虽称兴趣缺乏，但却可以日以继夜地玩电脑游戏。 2.症状交杂：可以发现，临床上抑郁症诊断困难病例多混杂许多其他精神症状，如情绪激惹或心境恶劣、强迫症状和焦虑症状等。因此出现与精神分裂症、强迫症及焦虑症等疾病的鉴别困难。3.标准化诊断和临床实践的矛盾：突出反映在分裂情感性精神障碍的诊断上，某些病例有多次典型的精神分裂症和抑郁症发作史，发作间歇期恢复良好。由于这些症状出现在不同病期，因此不符合现诊断标准关于分裂情感性精神障碍的诊断条件，还有环性心境和恶劣心境与传统的诊断观念不同，有许多诊断和治疗问题需要探讨。并且，这些诊断手法很大程度依赖于医生的主观判断，诊断过程中也存在患者隐瞒或捏造的情况。这些现状导致了诊断抑郁症十分困难，也使得抑郁症的治疗举步维艰。
医疗体系的低识别率主要是因为临床上对于抑郁症的诊断，通常依靠问卷量表和问诊完成。这样的诊断手段过于依靠医生的主管判断，对医生的临床经验要求非常高，不利于大规模普及筛查。结合上述提到的抑郁症患者临床就诊率低的普遍现象，对于抑郁症的防治，如果有一种客观的检测项目作为抑郁症在健康管理领域里的筛查工具，不但可以将抑郁症的“防线”提前，主动发现大量抑郁症潜在患者，还可以对于现有抑郁症临床诊断过于主观的判断手段进行有效的补充。只有在健康体检领域里进行主动的精神健康管理，对抑郁症客观生理指标进行检测筛查，才能做到抑郁症进行早期发现和早期干预，才是抑郁症防治的关键。因此开发快速、灵敏和准确的抑郁症预测和早期诊断方法，对于推动我国抑郁症的防治工作具有重要意义。
抑郁症的来源和发病机理并没有一个确切的理论，环境和生理因素都会产生影响。现在较为公认的是抑郁症可能是由脑内5-羟色胺、肾上腺素等神经递质缺乏或功能障碍导致的。因此，生物体内的神经递质的代谢水平可以一定程度上反映是否患有抑郁症，如多巴胺、肾上腺素、血清素和gamma-氨基丁酸(GABA)。这些化合物可以作为诊断生物标记物，根据特定化合物体内代谢水平的高低，进行抑郁症的辅助早期诊断，以便在早期发现轻度患者，或者有抑郁倾向的人群，进行早期干预，降低抑郁症带来的危害。国际国内基于ICD-10的抑郁症诊断方法，很大程度依赖于医生的主观判断，导致了诊断抑郁症十分困难，也使得抑郁症的治疗举步维艰。
专利申请号CN201610105047.3和专利申请号CN201080046087.6的专利申请中，披露了利用血清代谢标记物对抑郁症进行诊断。但血清样本存在样本采集困难,需要专业的医护人员才能进行,患者本人难以在家自行采集。专利申请号CN201480019392.4的专利申请中，披露了利用血清或尿液的生物标记物诊断,所使用的一套生物标记物包括至少cGMP、皮质醇、钙卫蛋白、凝血噁烷、醛固酮、HVEM和P物质。由于所用标记物既有小分子代谢物,又有大分子蛋白质,需要使用多个技术平台检测,例如质谱和免疫学方法,增加了检测难度和成本。以及该发明采用血清和尿液样本,储存和运输成本都很高。
文献(重庆医科大学博士学位论文，作者：郑鹏，基于代谢组学策略筛选抑郁症血浆、尿液的诊断标志物，2013年以及Zheng P,Wang Y,Chen L,et al.Identification andvalidation of urinary metabolite biomarkers for major depressive disorder.MolCell Proteomics.2013；12(1):207-214)披露了采用核磁共振测定了126个抑郁症患者与134个正常对照尿液样本，共鉴定了23个差异性代谢物，逻辑回归分析发现丙二酸(Malonate),甲酸酯(Formate)，N-甲基烟酰胺(N-Methylnicotinamide),M-羟基乙酸苯酯(M-Hydroxyphenylacetate)以及丙氨酸(Alanine) 这五个代谢物质组成生物标志物组具有潜在的临床诊断价值。该生物标志物组可区分训练集的 82个抑郁症与82个正常对照的AUC值为0.812(95％置信区间:0.829–0.961)；区分测试集的 44个抑郁症与52个正常对照的AUC值为0.895(95％置信区间:0.829–0.961)。
传统的分析方法如免疫分析一直是临床诊断中应用最广泛的技术，免疫方法中，放免检测由于存在放射污染，目前已基本被淘汰。ELISA方法手工操作，结果易受人为因素影响。出于对检测便利和检测结果精准性等需求，需要开发新的检测标记物、检测方法和检测工具。
发明内容
本发明的目的之一是提供一组代谢标记物，可用于诊断受试体情感障碍及在治疗过程中辅助监控治疗效果，以及用于治疗情感障碍药物的治疗效果的评估。
本发明进一步目的之一是提供所述代谢标记物在诊断受试体情感障碍、制备检测所述代谢标记物的试剂和试剂盒的用途。
本发明进一步目的之一是提供一种测试受试体尿液样本中代谢标志物种类和含量的检测方法，更具体是经过处理的尿液样本。
本发明中，“情感障碍”选自抑郁症、精神分裂症和焦虑症，优选抑郁症；所述抑郁症选自精神抑郁症、内源性抑郁症、反应性抑郁症、轻度抑郁症、重性抑郁症、精神病性抑郁症、神经性抑郁症、单相抑郁症和双相抑郁。为简洁表达，本发明其他部分表述为“抑郁症”，本领域技术人员能够理解，其所述技术方案的原则和目的，同样适用于情感障碍的其他类型。
本发明中，“代谢标记物”指一种过程、事件或病症的独特的生物或生物来源的指示物。生物标记物可用于诊断，例如临床筛选，和预后评估和监控疗法结果。它们还可用于鉴定出最可能应答于特定治疗的患者，用于药物筛选和用于药物开发。因此，生物标记物及其应用对于鉴定新药物治疗和发现药物治疗的新靶点是有价值的。进一步地，它们对于探究剂量方案和药物组合是有价值的。
本发明中，“受试体”包括所有哺乳动物，本发明的一个实施例选择人类。
本发明提供了用于检测受试体情感障碍的代谢标记物组合，包括多巴胺、5-羟色胺、γ- 氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素和去甲肾上腺素，适用于本发明目的的代谢标记物组合还可包括选自以下代谢标记物的一种或多种的组合：5-羟色氨酸、N-乙酰五羟色胺、N-乙酰天冬氨酸、5-羟基吲哚乙酸、色胺、肌酸、乙酰肉碱、肌酐、肌醇、磷酸胆碱、腺苷、焦谷氨酸、色醇、犬尿素、犬尿氨酸、3-羟氨苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、3- 甲氧基色胺、喹啉酸、邻氨基苯甲酸、α-酮戊二酸、谷氨酸、鸟氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、琥珀酸、苯丙氨酸、苯基乙胺、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、对羟基苯乙胺、多巴、香草扁桃酸、 3-羟基丁酸、高香草酸和胆碱。
用于检测本发明代谢标记物的检测样本可以是来源于受试体的血液、尿液和其他体液样本。本发明的实施例之一是将尿液作为生物样本进行检测，一种实施方式是受试体的晨尿。受试体可经专业人员协助取样，或经指导自主取样，包括清洗双手，用集尿杯采集晨尿的中段尿，即弃去始末段尿液，让开始的小便冲洗尿道，留取中间段小便即可，目的是防止尿液污染，将所取新鲜尿液作为检测样本。
本发明提供用于检测如上代谢标记物的处理后的尿液样本作为检测样本及其处理方法；所述处理方法包括将尿液样本附着于滤纸片制备尿滤纸片，将尿滤纸片干燥后作为检测样本。其中，所述来源于受试体的尿液优选为晨尿，更优选为中段尿；所述滤纸片选自定量分析滤纸、定性分析滤纸和慢速定量无灰滤纸或其他具有类似吸附功能的滤纸或类似载体。
作为具体的实施方式之一，所述尿液滤纸片的制备包括：(1)采集者清洗双手，准备好采集物品，用集尿杯采集晨尿的中段尿；(2)取出尿液滤纸片，保持其清洁，将滤纸片浸入尿液中，充分浸润；(3)上提滤纸片，沥干纸面上残留的尿液；(4)将取出的滤纸片在15-30℃的洁净环境中避光阴干。至滤纸片完全干燥后，可直接进行检测，或也可将滤纸片密封；作为密封方案之一，可以将滤纸片装入带密封条的样本袋进行密封；在上述过程中应保持滤纸片清洁。采用上述提供的制备方法制得的尿液滤纸片样本在-80℃的条件下可保存至少1年，-20℃的条件下可保存至少3个月，室温至少可以保存15天。从-80℃或者-20℃条件取出恢复常温后进行检测，样本中代谢标记物含量显示出较好的均一性和稳定性。
本发明代谢标记物组合可用于制备检测受试体情感障碍的试剂或试剂盒。
本发明提供包含检测如上所述代谢标记物的试剂的试剂盒，包括代谢标记物的标准品、同位素内标液、碳酸氢钠溶液、衍生化试剂和代谢标记物提取溶剂。所述代谢标记物提取溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中一种或几种的混合溶液。所述衍生化试剂选自丹磺酰氯、苯异硫氰酸酯和6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯。
所述试剂盒可按照以下方法制备:
(1)制备代谢标记物的标准纯品液；
(2)制备同位素内标液的；
(3)制备代谢标记物提取溶剂；
(4)制备衍生化试剂；
将上述试剂组装为所述试剂盒。
作为本发明方案之一，包含检测如上所述代谢标记物的试剂的试剂盒，包括滤纸、代谢标记物的标准品、同位素内标液、碳酸氢钠溶液、衍生化试剂和代谢标记物提取剂。所述代谢标记物提取溶剂选自水、甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中一种或几种的混合溶液；所述衍生化试剂选自丹磺酰氯、苯异硫氰酸酯和6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯，所述滤纸选自分析滤纸、定性分析滤纸和慢速定量无灰滤纸。
如上所述试剂盒的使用方法，包括：
(1)按照本发明上述方法制备尿滤纸片，干燥后的干尿滤纸片作为检测样本；
(2)以代谢产物提取溶剂和同位素内标液，对(1)中所制得的检测样本干尿滤纸片进行提取，得提取液；
(3)采用LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，对于干尿滤纸片提取液进行测定。
以上测定过程中同时测定检测样本中肌酐含量以校正样本中浓度偏差。
本发明中代谢标记物可用于受试体情感障碍诊断和治疗过程、治疗药物、治疗效果的监控和评估，例如临床筛选，和预后评估和监控疗法结果。它们还可用于鉴定出最可能应答于特定治疗的患者，用于药物筛选和用于药物开发；还可应用对于鉴定新药物治疗和发现药物治疗的新靶点。进一步地，它们可用于探究情感障碍治疗药物的剂量方案和药物组合。
许多研究机构对抑郁症的诊断标记物进行了研究，并没有准确、简便、可靠的诊断方法在临床上广泛应用。本发明检测尿滤纸片中的代谢物,能够有效避免对医生主观判断的依赖；样本方便患者在家自行采集,不需要专业的医护人员进行配合；样本存储在滤纸片上,它有着制作收集简便、方便运输、可以常温保存等优势。本发明采用LC-MS/MS方法，对待测生物标记物靶向定量，样本检测准确、方便。
附图说明
图1是本发明制备的尿滤纸片示意图。
图2是代谢标志物在尿液中的液相色谱质谱代表型离子色谱图。
图3是基于尿液样本中物质的主成分分析得分图。
图4是基于尿液中检测到的物质的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)图。
图5是受试者工作特征曲线(ROC)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一组代谢标记物，可用于诊断或辅助诊断受试体情感障碍的用途。所述代谢标记物包括多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素，以及任选地包括以下代谢标记物的一种或多种的组合：5-羟色氨酸、 N-乙酰五羟色胺、N-乙酰天冬氨酸、5-羟基吲哚乙酸、色胺、肌酸、乙酰肉碱、肌酐、肌醇、磷酸胆碱、腺苷、焦谷氨酸、色醇、犬尿素、犬尿氨酸、3-羟氨苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、3- 甲氧基色胺、喹啉酸、邻氨基苯甲酸、α-酮戊二酸、谷氨酸、鸟氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、琥珀酸、苯丙氨酸、苯基乙胺、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、对羟基苯乙胺、多巴、香草扁桃酸、 3-羟基丁酸、高香草酸和胆碱。本发明优选采用靶向质谱技术，其他测定技术如免疫测定技术、化学发光法等也可用于本发明代谢标记物的测定。
本发明代谢标记物是由下述方法筛选得到的：
(1)分别选取抑郁症患者和健康对照组(每组100例)，取晨尿样本，制成尿滤纸片，从中提取代谢产物；
(2)通过代谢组学的方法，运用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的方法对尿液中的主要代谢产物的含量进行测定；
(3)所得的数据通过正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)和变量投影重要性(VIP)分析，找出两组之间具有显著性差异的代谢产物，作为备选代谢标记物；
(4)通过受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)，进一步筛选确定出准确性和特异性都较高的代谢标记物组合。
这些代谢标记物在受试体的尿液样本可能被检测到。本发明优选采用受试体的尿液作为检测样本，特别是优选晨尿作为检测样本，以及进一步优选地，可将尿液样本进行如下处理。
检测本发明代谢标记物可采用尿滤纸片的形式，即将尿液样本附着于滤纸上制备为尿滤纸片。本发明所用滤纸片包括但不限于定量分析滤纸、定性分析滤纸。优选地，采用慢速定量无灰滤纸。具有滤纸类似功能的载体亦适用于本发明。
在测定时首先进行尿滤纸片中代谢物提取。本发明采用但不限于水、甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、以及上述溶剂的混合溶液对尿液中代谢物进行提取，可以包含或不包含各生物标记物对应的同位素内标。优选的，采用5-15％(体积比)的甲醇水溶液对尿滤纸片中代谢物进行提取。优选的，在室温(20-35℃)，振荡20-40分钟进行提取，将尿滤纸片提取液进行后续测定。
在测定中，本发明优选采用衍生的方法对代谢标记物进行检测。衍生的方法包括但不限于丹磺酰氯、苯异硫氰酸酯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯等。优选的，采用丹磺酰氯进行衍生。优选的，取尿滤纸片提取液的上清液，加入碳酸氢钠溶液和衍生化试剂。振荡一段时间以使之充分反应。优选地，对丹磺酰氯衍生后代谢标记物采用乙酸乙酯萃取。将萃取液上层有机相转移至适当容器氮吹干。加入甲醇水溶液复溶后检测。
本发明优选采用液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)的方法对上述诊断标记组合物的检测和分析。所述液相色谱包括高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)和纳升液相色谱 (Nano-LC)，所述串联质谱包括四级杆质谱(Quadrupole,Q)、飞行时间质谱(Timeof Flight, TOF)、离子肼质谱(Ion Trap)和高分辨轨道肼质谱(Orbitrap)。
优选的，液相色谱条件为：色谱柱(可以是C8、C18硅胶填料柱)，流动相(可以是乙腈- 水溶液、甲酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-异丙醇、甲醇-异丙醇溶液，醋酸水溶液、醋酸铵水溶液)，洗脱程序为：流动相A和流动相B按一定比例进行梯度洗脱。
本发明的一个具体实施例的液相色谱条件为，液相色谱柱采用BEH C18(1.7μm，2.1*100mm色谱柱)。液相色谱条件为：进样量：5μL；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；流动相A相：0.1％(体积比)甲酸的水溶液；流动相B相：乙腈：异丙醇(体积比7：3)；洗脱程序为0-1min，从10％B相线性变化到40％B；1-1.5min，从40％B相线性变化到50％B相；1.5min-5.5min，从50％B线性变化到100％B相；5.5min-7.5min，平衡在 100％B相；7.5min-8min，从100％B相到10％B相；8min-9min，平衡在10％B相。优选的，采用三重四级杆质谱进行检测。采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，扫描时间为0.5min-7min。脱溶剂气流速1000L/h，锥孔流速150L/h，毛细孔电压3kV，脱溶剂气温度500℃，离子源温度150℃。
数据采集后，每个诊断标记的代谢标记物采用特定离子对定量，采集信号的峰面积和对应标准品的工作曲线对比，并用加入内标溶液进行校正，得到代谢标记物的浓度值。每个代谢标记物在原始尿液中的含量，采用肌酐含量进行校正。
本发明的一个具体实施方式是一种抑郁症检测试剂盒，包含有：5mg/ml代谢标记物的标准品,13C稳定同位素内标液，1mg/mL丹磺酰氯衍生化试剂溶液，浓度为1M的碳酸氢钠溶液，体积比1:9的甲醇-水溶液作为代谢产物提取溶剂，1根分析色谱柱。
优选的，上述抑郁症检测试剂盒，所述代谢标记物包括多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素。
上述抑郁症检测试剂盒，能够准确测定尿液中如下代谢标记物：多巴胺、5-羟色胺、γ- 氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素，进而用于检测、诊断抑郁症，以及在抑郁症治疗过程中监测药物剂量和治疗效果。
上述抑郁症检测试剂盒的制备方法，具体制备步骤如下：
(1)代谢标记物的标准纯品液的制备：取代谢产物标准品溶解于水中，配制成5mg/ml的溶液，为代谢产物标准品液；
(2)13C稳定同位素内标液的制备：取13C稳定同位素内标提取物，准确称量，溶解于甲醇中，配成1mg/ml的溶液，为13C稳定同位素内标液；
(3)代谢产物提取溶剂的制备：将分析纯级甲醇和水按照1:9体积比混合，为代谢产物提取溶剂； (4)衍生化试剂的制备：称取10mg丹磺酰氯固体，溶于10mL乙腈中，配制成1mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液，尽量现用现配，隔天使用避光-20℃保存。
(5)分析色谱柱：为常见色谱耗材(购自美国Waters公司)，色谱柱填料和规格为：BEH C18(1.7 μm，2.1*100mm色谱柱)；
上述抑郁症检测试剂盒的应用方法，具体步骤如下：
(1)制备受试体的干尿滤纸片；
(2)取上述抑郁症检测试剂盒中的甲醇-水溶液作为代谢产物提取溶剂和13C稳定同位素内标液，对干(1)制得的干尿滤纸片上的代谢产物进行提取；
(3)基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，对于(2)制得的干尿滤纸片提取液中的9种代谢产物进行定量测定，包括多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4- 二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素。
优选的，上述抑郁症检测试剂盒的应用方法，所述步骤(3)中基于LC-MS/MS的靶代谢组学分析方法，具体步骤为：
(1)通过自动进样器将代谢提取液注入BEH C18色谱柱中(2.1mm×100mm,1.7μm，Waters, USA)，对尿样中的代谢产物进行分离，具体的色谱条件为：进样量：5μL；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；流动相A相：0.1％(体积比)甲酸的水溶液；流动相B 相：乙腈：异丙醇(体积比7:3)。前述比例均为体积比。洗脱程序：0-1min，从10％B相线性变化到40％B；1min-1.5min，从40％B相线性变化到50％B相；1.5min-5.5min，从50％B线性变化到100％B相；5.5min-7.5min，平衡在100％B相；7.5min-8min，从100％B相到10％B相；8min-9min，平衡在10％B相。
(2)将色谱分离的代谢产物导入三重四极杆质谱，采用多反应检测模式对代谢产物进行扫描和检测，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，扫描时间为0.5min～7min。脱溶剂气流速1000L/h，锥孔流速150L/h，毛细孔电压3kV，脱溶剂气温度500℃，离子源温度150℃。
(3)数据采集后，每个诊断标记的代谢标记物采用特定离子对定量，采集信号的峰面积和对应标准品的工作曲线对比，并加入内标溶液进行校正，得到代谢标记物的浓度值。每个代谢标记物在原始尿液中的含量，采用肌酐含量进行校正。
上述测试得到的代谢标记物的定量值，与每一代谢物浓度正常值对照进行相应的抑郁症诊断风险评估。将测得的9种代谢物浓度，与每一代谢物浓度正常值比较，如果9种代谢产物中多巴胺、γ-氨基丁酸、酪胺、浓度显著增加(大于正常值的1.5倍)、而色氨酸、犬尿氨酸、 3,4-二羟基苯乙酸、5-羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素浓度显著降低(<正常值的0.8倍) 则判定为抑郁症。
实施例
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1：抑郁症诊断尿液代谢标记物的筛选
1)样本的纳入
抑郁症样本纳入标准：
1、所有纳入的抑郁症患者符合DSM-Ⅳ诊断标准。
2、汉密尔顿抑郁(HDRS)17项量表评分大于等于18分。
3、首次发作的抑郁症患者，未服用任何抗抑郁药物。
4、年龄大于18岁，小于65岁。
排除标准：
1、现伴有其它精神疾病或既往有其它精神疾病病史者。
2、合并脑器质性疾病及严重脑外伤史；合并心、肝、肾疾病，糖尿病及其他严重躯体性疾病等。
3、实验室常规检查(血常规、肝功能、尿常规)异常者。
4、处于妊娠、哺乳、月经期的女性研究对象。
5、药物及物质滥用史。
健康对照者纳入与排除标准
无神经精神疾病病史，无药物滥用史或依赖史，无系统的躯体疾病；常规实验室检测无明显异常。
2)尿液滤纸片收集尿液样本
将滤纸片裁剪成如图1形状，用尿杯采集新鲜尿液后，手拿着手持区一端，将滤纸片垂直浸入尿液中，保证尿液液面浸润过中部直线，保持滤纸片垂直浸润5到10秒，尽量不要碰到杯壁。浸润完后垂直拿出滤纸片，在没有尿液的上方的杯壁上，将滤纸片正反两面均轻轻靠着杯壁，沥干纸面上多余的残留的尿液。采集完成将尿滤纸片置于密闭且干燥洁净的空间阴干，将尿滤纸片，放入密封袋，常温避光保存或直接用于样本检测。
3)尿滤纸片中生物标记物提取
(1)用1/8RD孔径的打孔器在干尿滤纸片样品上均匀的打20个孔，收集于1.5mL离心管中，打孔尽量避免滤纸片边缘。加入500μL的抑郁症检测试剂盒中的甲醇-水溶液(代谢产物提取溶剂)，20℃，1450rpm振荡45分钟；
(2)取提取液10μL，加入90μL水。再依次加入内标工作液200μL，50μL 1M NaHCO3溶液，100μL 1mg/mL衍生化试剂，30℃，1450rpm振荡30分钟。
4)尿滤纸片中生物标记物的检测
基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，具体步骤为：
(1)通过自动进样器将步骤3)中代谢提取液导入BEH C18色谱柱中(2.1mm×100mm,1.7μm， Waters,USA)，对尿样中的代谢产物进行分离，具体的色谱条件为：进样量：5μL；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；流动相A相：0.1％甲酸的水溶液；流动相B相： 7:3乙腈：异丙醇；强洗液：9:1甲醇：异丙醇；弱洗液：9:1乙腈：水。0-1min，从10％B相线性变化到40％B；1-1.5min，从40％B相线性变化到50％B相；1.5min-5.5min，从50％B线性变化到100％B相；5.5min-7.5min，平衡在100％B相；7.5min-8min，从100％B相到10％B相；8min-9min，平衡在10％B相。
(2)将色谱分离的代谢产物导入三重四极杆质谱，采用多反应检测模式对代谢产物进行扫描和检测，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，扫描时间为0.5min～7min。脱溶剂气流速1000L/h，锥孔流速150L/h，毛细孔电压3kV，脱溶剂气温度500℃，离子源温度150℃。
对于干尿滤纸片提取液中的9种代谢产物进行定量测定，将测得的9种代谢产物——多巴胺、 5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素。
5)稳定性实验：
尿液滤纸片晾干后，分别保存在-80℃，-20℃，室温条件下。采用液相色谱-质谱测定尿液滤纸片中物质的含量，保存在-80℃的样本每月测定一次，保存在-20℃的样本每半月测定一次，保存在室温的样本每隔一天测定一次，计算RSD，以初始测定均值为初始值，计算回收率；结果表明精密度均在在10％以内，回收率均在80％-110％之间，表明尿液滤纸片保存在-80℃条件下，可稳定保存至少一年，在-20℃条件下，可稳定保存至少3，在室温条件下可稳定保存15 天。
6)检测结果
采集了200个正常人晨尿样本，进行了尿液样本中包含神经递质类物质的定量，确定了标志物的正常参考范围。代谢标志物的色谱图如图2所示。在尿液样本分析过程中，每10个研究样本穿插一个QC样本以评估衍生过程和仪器分析的可变性。QC样本对于确保代谢物定量分析的可重复性、可靠性、准确性和鲁棒性(robustness)至关重要。图3为主成分分析(PCA) 得分图。如其所示，QC样本相对于尿液的其他样本紧密聚类，表明本实施例方法具有良好的可重复性。此处QC样本指采集的所有样本包括正常人和病人尿液样本的混合尿液。
同时采集并检测了200例正常人以及200例抑郁症病人样本，样本测试结果表明，包括神经递质在内的代谢物水平的不同能够很好的区分正常人与抑郁症病人。所测定的代谢物包括：多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素和去甲肾上腺素、5-羟色氨酸、N-乙酰五羟色胺、N-乙酰天冬氨酸、5-羟基吲哚乙酸、色胺、肌酸、乙酰肉碱、肌酐、肌醇、磷酸胆碱、腺苷、焦谷氨酸、色醇、犬尿素、犬尿氨酸、3-羟氨苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、3-甲氧基色胺、喹啉酸、邻氨基苯甲酸、α-酮戊二酸、谷氨酸、鸟氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、琥珀酸、苯丙氨酸、苯基乙胺、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、对羟基苯乙胺、多巴、香草扁桃酸、3-羟基丁酸、高香草酸和胆碱。基于所测定的尿液代谢物，进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)分析，如图4所示，正常和抑郁症样本能很好的区分开，表明抑郁症病人和正常人在代谢上有显著差异。
进一步采用显著变化的代谢物做受试者工作特征曲线(ROC)，曲线下的面积(AUC)表明测定标志物对于训练集样本的值为0.928，灵敏度为93.2％，特异性为96.7％。验证集数据AUC 为0.865，灵敏度为83.6％，特异性为89.7％。见图5。表明模型具有很好的预测价值。代谢物多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素的组合表现出优异的特异性和灵敏度。
实施例2：抑郁症检测试剂盒
抑郁症检测试剂盒中含有：代谢标记物的标准纯品液(5mg/ml,1毫升)；13C稳定同位素内标液(1mg/ml，100微升)；代谢产物提取溶剂(10ml)；衍生化试剂粉末(10mg)，分析色谱柱 (1根)。代谢标记物包括：多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4- 二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素。
所述试剂盒的制备方法如下：
(1)代谢标记物的标准纯品液：取代谢产物标准品粉末，准确称量5毫克，溶解于1毫升的水中，制备成5mg/ml的代谢标记物纯品液；
(2)13C稳定同位素内标液：取13C稳定同位素提取粉末，准确称量1毫克，溶解于1毫升甲醇中，制备成1mg/ml的13C稳定同位素内标液；
(3)代谢产物提取溶剂：准确量取分析纯甲醇1ml，加入9ml色谱纯水，混匀为代谢产物提取液；
(4)分析色谱柱：为常用色谱耗材，购自于美国Waters公司，色谱柱填料和规格为：BEH C18 (1.7μm，2.1*100mm色谱柱)。
上述组装为试剂盒。
实施例3：抑郁症检测试剂盒诊断抑郁症的临床实例
随机采取某门诊100名就诊的人员的尿液，收集到干尿滤纸片上，使用实施例2所述抑郁症检测试剂盒进行抑郁症诊断。取抑郁症检测试剂盒中的代谢产物提取溶剂(甲醇-水溶液)和13C 稳定同位素内标液，对干尿滤纸片上的代谢产物进行提取。基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析方法，对于干尿滤纸片代谢提取液中的实施例1筛选的9种代谢产物进行定量测定，具体步骤为：
(1)尿滤纸片的制备
将滤纸片裁剪成如图1形状，用尿杯采集新鲜尿液后，手拿着手持区一端，将滤纸片垂直浸入尿液中，保证尿液液面浸润过中部直线，保持滤纸片垂直浸润5到10秒，尽量不要碰到杯壁。浸润完后垂直拿出滤纸片，在没有尿液的上方的杯壁上，将滤纸片正反两面均轻轻靠着杯壁，沥干纸面上多余的残留的尿液。采集完成将尿滤纸片置于密闭且干燥洁净的空间阴干，将尿滤纸片，放入密封袋，常温避光保存或直接用于检测。
(2)尿滤纸片代谢标记物的提取
用1/8RD孔径的打孔器在干尿滤纸片样品上均匀的打20个孔，收集于1.5mL离心管中，打孔尽量避免滤纸片边缘。加入500μL的抑郁症检测试剂盒中的甲醇-水溶液(代谢产物提取溶剂)， 20℃，1450rpm振荡45分钟；得尿滤纸片提取液。
(3)衍生化处理
取(2)中得到的尿滤纸片提取液10μL，加入90微升水。再依次加入内标液200微升，50微升1M的NaHCO3溶液和100微升的衍生化试剂，30℃，1450rpm振荡30分钟反应；向反应后的离心管中加入500微升乙酸乙酯，20℃，1450rpm振荡20分钟。取400微升上层有机相，转移至1mL 96孔板中，氮吹吹干。加入100微升50％甲醇水溶液复溶，10℃，650rpm 振荡20分钟。离心后取上清液检测。
(4)样本中代谢产物的测定
通过自动进样器将步骤(3)得到的上清液注入BEH C18色谱柱中(2.1mm×100mm,1.7μm， Waters,USA)，对尿样中的代谢产物进行分离，具体的色谱条件为：进样量：5μL；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；流动相A相：0.1％甲酸的水溶液；流动相B相： 7:3乙腈：异丙醇；强洗液：9:1甲醇：异丙醇；弱洗液：9:1乙腈：水。0-1min，从10％B相线性变化到40％B；1-1.5min，从40％B相线性变化到50％B相；1.5min-5.5min，从50％B线性变化到100％B相；5.5min-7.5min，平衡在100％B相；7.5min-8min，从100％B相到10％B相；8min-9min，平衡在10％B相。
将色谱分离的代谢产物导入三重四极杆质谱，采用多反应检测模式对代谢产物进行扫描和检测，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，扫描时间为0.5min～7min。脱溶剂气流速1000L/h，锥孔流速150L/h，毛细孔电压3kV，脱溶剂气温度500℃，离子源温度150℃。
将测得的9种代谢物浓度，与代谢物浓度正常值比较，如果9种代谢产物中多巴胺、γ-氨基丁酸、酪胺、浓度显著增加(大于正常值的1.5倍)、而色氨酸、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、5-羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素浓度显著降低(<正常值的0.8倍)则判定为抑郁症。
本实验进行的同时，由专业医生对100名就诊的人员通过问卷调查量表进行抑郁症诊断，作为诊断的金标准，与本发明提供的试剂盒检测法进行比较，结果如表1所示。由表1计算代谢组学标记物试剂盒诊断抑郁症的准确度达93.0％((47+46)/100)*100％，特异性为92.0％(46/ (46+4))*100％，敏感度为94.0％(47/(47+3))*100％。
表1代谢标记物试剂盒诊断抑郁症效果评估
实施例4：抑郁症检测试剂盒
抑郁症检测试剂盒中含有：代谢标记物的标准纯品液(5mg/ml,1毫升)；13C稳定同位素内标液(1mg/ml，100微升)；代谢产物提取溶剂(10ml)；衍生化试剂粉末(10mg)，分析色谱柱(1 根)以及滤纸。所述代谢标记物包括：多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、色氨酸、酪胺、犬尿氨酸、3,4-二羟基苯乙酸、肾上腺素、去甲肾上腺素。所述滤纸为密封状态。
所述试剂盒的制备方法如下：
(1)代谢标记物的标准纯品液：取代谢产物标准品粉末，准确称量5毫克，溶解于1毫升的水中，制备成5mg/ml的代谢标记物纯品液；
(2)13C稳定同位素内标液：取13C稳定同位素提取粉末，准确称量1毫克，溶解于1毫升甲醇中，制备成1mg/ml的13C稳定同位素内标液；
(3)代谢产物提取溶剂：准确量取分析纯甲醇1ml，加入9ml色谱纯水，混匀为代谢产物提取液；
(4)分析色谱柱：为常用色谱耗材，购自于美国Waters公司，色谱柱填料和规格为：BEH C18 (1.7μm，2.1*100mm色谱柱)；
(5)滤纸：采用无灰滤纸，裁剪为附图1形状，以密封袋密封。
上述组装为试剂盒。
上述参照实施例对该尿液代谢标记物的用途及抑郁症检测试剂盒进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。