一种人体内血液中dha浓度的检测方法
阅读说明：本技术 一种人体内血液中dha浓度的检测方法 (Method for detecting concentration of DHA in blood of human body ) 是由 蒙晋宁 邹皓月 王贯宇 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人体内血液中DHA浓度的检测方法,包括如下步骤：S1、血液样品前处理；S2、标准储备液和标准溶液的配制；S3、LC-MS/MS分析检测,步骤S1的具体操作方法为：准确称取0.3g血液,置于10mL离心管中,依次加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液、1.5mL蒸馏水、400μL含有0.05％抗氧化剂(BHT)的甲醇溶液、2mL氯仿,振荡均匀,以2500r/min的转速离心10min,取氯仿层,重复以上提取过程,合并氯仿层至20mL顶空进样瓶中,氮气吹干备用。本发明采用杂环衍生化结合下对DHA进行分析,并将该方法应用到人血液中DHA的检测,采用内标法定量,而不是归一化法确定其相对含量,该方法操作简便,准确度、灵敏度、精密度均达到满意效果,实用性高,适用于人血液中DHA含量的分析检测。(The invention discloses a method for detecting the concentration of DHA in blood of a human body, which comprises the following steps: s1, preprocessing a blood sample; s2, preparing a standard stock solution and a standard solution; s3, LC-MS/MS analysis and detection, wherein the specific operation method in the step S1 is as follows: accurately weighing 0.3g of blood, placing the blood into a10 mL centrifuge tube, sequentially adding 40 μ L of C23: 0 internal standard solution with the mass concentration of 40 μ g/mL, 1.5mL of distilled water, 400 μ L of methanol solution containing 0.05% of antioxidant (BHT) and 2mL of chloroform, oscillating uniformly, centrifuging at the rotating speed of 2500r/min for 10min, taking a chloroform layer, repeating the extraction process, combining the chloroform layers to a 20mL headspace sampling bottle, and blowing the headspace sampling bottle with nitrogen for later use. The invention adopts the heterocyclic derivatization to analyze the DHA under the combination, applies the method to the detection of the DHA in human blood, adopts the internal standard method for quantification instead of the normalization method to determine the relative content of the DHA, has simple and convenient operation, achieves satisfactory effects on accuracy, sensitivity and precision, has high practicability, and is suitable for the analysis and detection of the DHA content in the human blood.)
技术领域
本发明涉及不饱和脂肪酸检测技术领域，具体为一种人体内血液中DHA浓度的检测方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)，俗称脑黄金，属n-3系多不饱和脂肪酸，是人脑神经细胞膜中主要的脂质成分，DHA能促进婴幼儿的中枢神经系统发育，可保护视力。DHA还有预防心脑血管疾病、抑制肿瘤生长、抗炎及抑制过敏反应等作用。流行病学调查显示，人群中最易发生DHA缺乏的是新生儿、婴幼儿、孕妇和老年人，但DHA也并非摄入越多越好，大量摄入会产生出血倾向，有凝血功能障碍、严重高血压及自身免疫性疾病的患者必须慎用。因此建立快速准确的检测方法测定人血液中的DHA含量，具有一定的现实意义。文献中有采用薄层色谱法对DHA进行分析的，而大部分则使用气相色谱或气相色谱-质谱联用技术由于DHA的极性较强，挥发性、稳定性较低，需要衍生化处理后进行气相色谱检测,其衍生化方法多为甲酯衍生化法，可分为酸催化和碱催化两大类，有关研究发现酸催化比碱催化更适用于酯化DHA等游离脂肪酸，酸催化主要采用氯化氢-甲醇酯化法、硫酸-甲醇酯化法和三氟化硼-乙醚-甲醇酯化法，其中氯化氢-甲醇酯化法中氯化氢-甲醇的吸附浓度不易控制，会影响测定的准确性；硫酸-甲醇酯化法中DHA酯化率不够高；三氟化硼-乙醚-甲醇酯化法中三氟化硼-乙醚配合物易燃、有毒、易分解，操作不方便，也不安全，另外，不饱和脂肪酸甲酯在电子轰击下，双键位置难以正确定位，为此，我们提出一种人体内血液中DHA浓度的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人体内血液中DHA浓度的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人体内血液中DHA浓度的检测方法，包括如下步骤：
S1、血液样品前处理；
S2、标准储备液和标准溶液的配制；
S3、LC-MS/MS分析检测。
优选的，所述步骤S1的具体操作方法为：准确称取0.3g血液，置于10mL离心管中，依次加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液、1.5mL蒸馏水、400μL含有0.05％抗氧化剂(BHT)的甲醇溶液、2mL氯仿，振荡均匀，以2500r/min的转速离心10min，取氯仿层，重复以上提取过程，合并氯仿层至20mL顶空进样瓶中，氮气吹干备用，在氮气保护下向上述吹干的顶空进样瓶中加入200μLAMP，充满氮气后密封，在210℃的恒温油浴中反应75min后冷却至室温，加甲醇定容至1mL，样品经0.22μm滤膜过滤后用LC-MS/MS分析检测。
优选的，所述步骤S2中标准储备液的配制方法为：取DHA标准品12.5mg(精确至0.1mg)于50mL棕色容量瓶中，加入BHT25mg，用甲醇溶解并定容至刻度，配成250μg/mL的标准储备液，放于-20℃冰箱中备用。
优选的，所述步骤S2中标准溶液的配制方法为：分别取7、10、50、100、300、600、1000μL的标准储备液，用甲醇定容至25mL，各加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液，配成0.07、0.1、0.5、1、3、6、10μg/mL的系列标准溶液。
优选的，所述步骤S3中LC-MS色谱条件为：液相色谱柱：VarianPolarisC18-A100×2.1mm，5μm；柱温：室温；流动相：A甲醇，B水；梯度条件：0-3min50％A-90％A，3-6min90％A，6-12min50％A；流速：0.2-0.5mL/min。
优选的，所述步骤S3中MS色谱条件为：喷雾电压3500V，鞘气40arb，辅助气7arb，毛细管温度330℃，扫描窗口宽度：Q10.7、Q30.7。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用杂环衍生化结合下对DHA进行分析，并将该方法应用到人血液中DHA的检测，采用内标法定量，而不是归一化法确定其相对含量，该方法操作简便，准确度、灵敏度、精密度均达到满意效果，适用于人血液中DHA含量的分析检测。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种人体内血液中DHA浓度的检测方法，包括如下步骤：
S1、血液样品前处理；
S2、标准储备液和标准溶液的配制；
S3、LC-MS/MS分析检测。
实施例一：
S1、血液样品前处理：
(1)称取0.3g血液，置于10mL离心管中，依次加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液、1.5mL蒸馏水、400μL含有0.05％抗氧化剂(BHT)的甲醇溶液、2mL氯仿，振荡均匀，以2500r/min的转速离心10min，取氯仿层，重复以上提取过程，合并氯仿层至20mL顶空进样瓶中，氮气吹干备用；
(2)在氮气保护下向上述吹干的顶空进样瓶中加入200μLAMP，充满氮气后密封，在180℃的恒温油浴中反应120min后冷却至室温，加甲醇定容至1mL，样品经0.22μm滤膜过滤后用LC-MS/MS分析检测。
S2、标准储备液和标准溶液的配制：
(1)取DHA标准品12.5mg(精确至0.1mg)于50mL棕色容量瓶中，加入BHT25mg，用甲醇溶解并定容至刻度，配成250μg/mL的标准储备液，放于-20℃冰箱中备用；
(2)取7、10、50、100、300、600、1000μL的标准储备液，用甲醇定容至25mL，各加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液，配成0.07、0.1、0.5、1、3、6、10μg/mL的系列标准溶液。
S3、LC-MS/MS分析检测：
(1)LC-MS色谱条件为：液相色谱柱：VarianPolarisC18-A100×2.1mm，5μm；柱温：室温；流动相：A甲醇，B水；梯度条件：0-3min50％A-90％A，3-6min90％A，6-12min50％A；流速：0.2-0.5mL/min；
(2)MS色谱条件为：喷雾电压3500V，鞘气40arb，辅助气7arb，毛细管温度330℃，扫描窗口宽度：Q10.7、Q30.7。
实施例二：
S1、血液样品前处理：
(1)称取0.3g血液，置于10mL离心管中，依次加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液、1.5mL蒸馏水、400μL含有0.05％抗氧化剂(BHT)的甲醇溶液、2mL氯仿，振荡均匀，以2500r/min的转速离心10min，取氯仿层，重复以上提取过程，合并氯仿层至20mL顶空进样瓶中，氮气吹干备用；
(2)在氮气保护下向上述吹干的顶空进样瓶中加入200μLAMP，充满氮气后密封，在180℃的恒温油浴中反应100min后冷却至室温，加甲醇定容至1mL，样品经0.22μm滤膜过滤后用LC-MS/MS分析检测。
S2、标准储备液和标准溶液的配制：
(1)取DHA标准品12.5mg(精确至0.1mg)于50mL棕色容量瓶中，加入BHT25mg，用甲醇溶解并定容至刻度，配成250μg/mL的标准储备液，放于-20℃冰箱中备用；
(2)取7、10、50、100、300、600、1000μL的标准储备液，用甲醇定容至25mL，各加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液，配成0.07、0.1、0.5、1、3、6、10μg/mL的系列标准溶液。
S3、LC-MS/MS分析检测：
(1)LC-MS色谱条件为：液相色谱柱：VarianPolarisC18-A100×2.1mm，5μm；柱温：室温；流动相：A甲醇，B水；梯度条件：0-3min50％A-90％A，3-6min90％A，6-12min50％A；流速：0.2-0.5mL/min；
(2)MS色谱条件为：喷雾电压3500V，鞘气40arb，辅助气7arb，毛细管温度330℃，扫描窗口宽度：Q10.7、Q30.7。
实施例三：
S1、血液样品前处理：
(1)称取0.3g血液，置于10mL离心管中，依次加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液、1.5mL蒸馏水、400μL含有0.05％抗氧化剂(BHT)的甲醇溶液、2mL氯仿，振荡均匀，以2500r/min的转速离心10min，取氯仿层，重复以上提取过程，合并氯仿层至20mL顶空进样瓶中，氮气吹干备用；
(2)在氮气保护下向上述吹干的顶空进样瓶中加入200μLAMP，充满氮气后密封，在210℃的恒温油浴中反应75min后冷却至室温，加甲醇定容至1mL，样品经0.22μm滤膜过滤后用LC-MS/MS分析检测。
S2、标准储备液和标准溶液的配制：
(1)取DHA标准品12.5mg(精确至0.1mg)于50mL棕色容量瓶中，加入BHT25mg，用甲醇溶解并定容至刻度，配成250μg/mL的标准储备液，放于-20℃冰箱中备用；
(2)取7、10、50、100、300、600、1000μL的标准储备液，用甲醇定容至25mL，各加入40μL质量浓度为40μg/mL的C23∶0内标液，配成0.07、0.1、0.5、1、3、6、10μg/mL的系列标准溶液。
S3、LC-MS/MS分析检测：
(1)LC-MS色谱条件为：液相色谱柱：VarianPolarisC18-A100×2.1mm，5μm；柱温：室温；流动相：A甲醇，B水；梯度条件：0-3min50％A-90％A，3-6min90％A，6-12min50％A；流速：0.2-0.5mL/min；
(2)MS色谱条件为：喷雾电压3500V，鞘气40arb，辅助气7arb，毛细管温度330℃，扫描窗口宽度：Q10.7、Q30.7。
将本发明进行实施操作后，得到的数据结论如下表：
DHA含量RSD(n＝6)
室温下DHA浓度
-20℃DHA浓度
实施例一
3.22％
0.04％
0.08％
实施例二
3.22％
2.87％
1.47％
实施例三
3.22％
4.63％
2.42％
本发明采用杂环衍生化结合下对DHA进行分析，并将该方法应用到人血液中DHA的检测，采用内标法定量，而不是归一化法确定其相对含量，该方法操作简便，准确度、灵敏度、精密度均达到满意效果，适用于人血液中DHA含量的分析检测。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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