具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

基于微生物的角度，柯萨奇病毒是肠道病毒属，而LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的糖脂质，本发明提出的LPS用于CoxsachievirusCVB3-A病毒协同溶瘤的作用，可以增加20％的溶瘤效力。

为证明上述协同作用，本发明实施例如下。

实施例1病毒溶瘤模型的建立

本实施例病毒细胞来自本公司专利申请号201410151863.9获得的细胞株；Vero细胞购置于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，武汉大学。

1.细胞复苏

根据“慢冻速融”原则，从液氮罐和-80℃冰箱取出待复苏的细胞，迅速放入提前预热至37℃的水浴锅中，待完全解冻后，1300rpm，3min离心，弃上清，使用10％FBS完全培养基轻柔重悬，将细胞从冻存管中转移至75cm²细胞培养瓶中，补充培养基至10ml，轻轻晃匀后置于37℃，5％CO₂培养箱中。

2.细胞换液

细胞培养2-3天后，由于营养物质消耗、细胞代谢产物积累，培养基呈酸性，培养基中的酚红指示剂将变黄。此时若细胞不满足传代条件，则需进行换液。换液时，直接将旧培养基取出丢弃，加入等量新鲜培养基即可。

3.细胞传代

连细胞生长至汇合率80-90％时，则需进行传代。首先取出旧培养基丢弃，加入适量PBS洗两次后吸弃，然后加入少量胰酶，充分接触细胞后将细胞置于37℃，，5％CO₂消化3min，观察细胞变圆并从板底脱落时，轻拍培养瓶；最后加入适量完全培养基重悬细胞，吹打5-6次，使细胞悬浮且充分分散成单个细胞，将细胞平均分至2-3个细胞培养瓶中，补足培养基，轻轻晃匀后置于37℃，5％CO₂条件下培养。

4.细胞冻存

当细胞生长至对数生长期，状态良好，且暂时不需要用于实验或需对细胞株进行保存时，可对细胞进行冻存。首先按细胞传代操作步骤使细胞消化，然后使用现配的细胞冻存液对细胞进行重悬，使细胞终浓度约为5×10⁶－1×10⁷个/ml，吹打5-6次，使细胞悬浮且充分分散成单个细胞，将细胞分装于细胞冻存管中；最后将细胞置于程序降温盒中，在-80℃冰箱放置6-8h后可转入液氮罐或直接置于-80℃保存。细胞短期冻存可置于-80℃，长期冻存需置于液氮罐。

5.细胞计数

当需对细胞进行计数时，首先将细胞终止消化并用适量培养基进行重悬并充分混匀，然后取出20μL细胞悬液从计数板边缘处缓慢滴入细胞计数板的细胞计数槽中，使用细胞计数仪对细胞进行计数。可在2个不同视野下对细胞分别进行计数，最后取平均值。细胞计数板使用完毕，可用超纯水冲洗干净置于室温自然晾干后，多次使用。

6.病毒生产与成瘤

6.1病毒生产

1)将Vero细胞培养于225cm²细胞培养瓶中(10％FBSDMEM培养基)至汇合率约为90％；

2)将培养液换成无血清DMEM培养基后，按照MOI＝0.1的比例接种CVB3病毒。

3)病毒感染24h左右，取样观察细胞完全病变，停止培养。

4)将病毒液经组合滤器过滤，得到病毒收获液。

5)过滤后分装成500μL/管，-80℃储存备用。

6.2动物实验

6.2.1裸鼠成瘤实验

1)将4-6周龄雌性BALB/c裸鼠按每笼8只分笼，在适当的温度、湿度、光线和噪音等环境条件下饲养，提供充足的食物和水，由于裸鼠免疫存在缺陷，食物和水需经过灭菌；

2)将待成瘤的细胞扩增至150mm细胞培养板，大量培养细胞，获得足量用于成瘤的肿瘤细胞；

3)待细胞生长至对数生长期，将用于成瘤的肿瘤细胞消化下来，并用完全培养基终止消化并充分重悬成单细胞悬液后，1300rpm、3min离心收集细胞；

4)弃培养基，加入适量PBS(预冷至4℃)去除细胞表明残留的FBS，1300rpm、3min、4℃离心；

5)弃PBS，加入适量无血清培养基(预冷至4℃)重悬细胞，对细胞进行计数，并根据细胞数目补充无血清培养基，调整细胞浓度至10⁷-10⁸个/ml，置于冰上；

6)取100μL细胞悬液于一次性注射器中，排出针头内的空气，用75％酒精对裸鼠背部进行擦拭消毒，将细胞接种于裸鼠皮下；

7)每日观察，待小鼠肿瘤长大电实验需求进行治疗；

8)定期观察小鼠状态并测量肿瘤人小，肿瘤体积计算公式：

V(volume)＝[L×(W)²]/2。

实施例2.与LPS混育后的柯萨奇病毒CVB3的体外溶瘤实验

本实施例实验组以柯萨奇病毒CVB3与LPS混育，将10⁸PFU的柯萨奇病毒CVB3与相同浓度的LPS温育，对照组为10⁸PFU的柯萨奇病毒CVB3，并分别作为病毒感染肿瘤细胞。

1.病毒体外抗肿瘤实验

1)将A549、H460、MCF-7、SUN-398等各5×10⁵个/孔接种至12孔板培养至形成细胞单层；

2)分别感染实验组和对照组的Coxsachievirus CVB3-A，感染量为MOI(感染复数)为0.1～1000；

3)逐日在显微镜下观察肿瘤细胞病变，在病毒感染培养72小时统计其存活率，结果如表1所示。

注：“－”表示无细胞病变效应；“+”表示15％的细胞出现病变效应；“+++”表示50％-75％的细胞出现病变效应；“++++”表示超过75％的细胞出现病变效应。

由表1可知，经LPS混育的柯萨奇病毒CVB3-A对肺癌细胞株A549、H460、乳腺癌细胞株MCF-7、肝癌细胞株SUN398杀伤作用均有增强。

2.LPS浓度对于柯萨奇病毒Coxsachievirus CVB3-A溶瘤效应的影响

细胞系：A549细胞购自中科院上海细胞库；

实验动物：3周龄BALB/c裸鼠，体重15±3g。

1)收集对数生长期的A549细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，接种于BALB/c裸鼠右腋皮下(1×10⁷个细胞/只)，获得荷瘤小鼠；

2)当肿瘤生长至7～8mm³时，将荷瘤小鼠随机分为5组实验组。

3)对于实验组1-5，分别瘤内注射含0、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml的LPS以及相同剂量10⁹PFU(空斑形成单位)的Coxsachievirus CVB3-A。注射时间为隔天一次，观察不同的天数肿瘤的变化，测量肿瘤的体积大小。

由表1不难发现，使用Coxsachievirus CVB3-A病毒配合不同浓度的LPS均均较实验组1(不含LPS)肿瘤体积要小，此外，当LPS分别为50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml时肿瘤体积呈减小的趋势，其中当LPS用量为500μg/ml时，效果最显著。由此可见为了考虑成本及效率，当LPS用量为500μg/ml时，Coxsachievirus CVB3-A的溶瘤效力最好，可以增强20％的溶瘤效力。

本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和描述的实施例。