阅读说明：本技术 一种树鼩急性肺损伤模型的建立方法及其应用 (Method for establishing tree shrew acute lung injury model and application thereof ) 是由 和君 傅江南 赵月 齐春丽 方梅霞 宋琳亮 邢会杰 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种树鼩急性肺损伤模型的建立方法及其应用,麻醉树鼩后通过气管内给药180～200mg/kg剂量的脂多糖溶液,当树鼩肺部损伤面积达到一半以上时,即构建得到所述的树鼩急性肺损伤动物模型。通过本发明的建立方法,树鼩在70小时后均可肺部损伤达到一半以上；在96～120小时树鼩在临床上表现出消瘦、呼吸困难等症状,树鼩肺部的损伤面积在70％以上,血氧指标可达200mmHg以下。本发明的建模方法高效、成功率高,可有效节约成本；模型周期在70小时以上,显著地为急性肺损伤拓宽了研究周期空间；所建立的树鼩动物模型不可自我修复和可逆性恢复,临床症状与人类疾病更为相似,具有良好的产业化前景。(The invention provides a method for establishing a tree shrew acute lung injury model and application thereof, wherein a 180-200 mg/kg dose of lipopolysaccharide solution is administrated in a trachea after a tree shrew is anesthetized, and when the lung injury area of the tree shrew reaches more than half, the tree shrew acute lung injury animal model is established. By the establishing method, the lung injury of the tree shrews can reach more than half after 70 hours; the tree shrew shows symptoms such as emaciation, dyspnea and the like clinically within 96-120 hours, the lung injury area of the tree shrew is more than 70%, and the blood oxygen index can reach below 200 mmHg. The modeling method is efficient and high in success rate, and cost can be effectively saved; the model period is more than 70 hours, and the research period space is remarkably widened for acute lung injury; the established tree shrew animal model can not be self-repaired and can be reversibly restored, the clinical symptoms are more similar to human diseases, and the method has good industrialization prospect.)

一种树鼩急性肺损伤模型的建立方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物模型的建模方法，特别涉及一种树鼩急性肺损伤模型的建立方法及其应用。

背景技术

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是全身性炎症反应在肺部的表现，其临床表现为肺部炎症、毛细血管通透性增加进而导致肺水肿的产生，随着病情的加剧，可进一步发展为呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，造成广泛肺泡损伤为病理特征，表现为蛋白性肺泡水肿和低氧血症。脓毒血症和多发性创伤是ARDS的最常见病因，炎性介质和抗炎介质的平衡失调是ALI/ARDS发生发展的关键环节，急性肺损伤一直是重症医学与呼吸病学亟需解决的关键问题。

现在常用的急性肺损伤动物模型有油酸诱导、机械通气诱导和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的动物模型。其中脂多糖诱导方法因为操作简单、可行性高、动物存活率高，是目前国内外使用较多的制备急性肺损伤动物模型的方法。

目前急性肺损伤研究最常用的模型动物是啮齿类和灵长类动物。由于啮齿类在进化上与人类相距甚远，以其为研究对象所得的实验数据对临床的指导意义不大；灵长类动物由于进化程度高，与人类亲缘关系最近，是目前实验研究中与人类最为相似的理想动物模型。但是它们价格过高，繁殖周期长，兼之动物伦理方面的原因，未能广泛应用。

目前脂多糖制备急性肺损伤模型中最常用的是小鼠模型。常用的诱导方法如下：将小鼠禁食12h，给予20mg/kg或10mg/kg LPS气管插管，24h采取样本；但目前的建模方法中，24h的时间主要检测的是细胞因子的变化情况。因此，剂量的多少影响小鼠的死亡时间、细胞因子的变化水平等。这种造模方法有诸多弊端：其一，实验小鼠与人类种属差异较大，所得实验数据指导意义不大；其二，实验小鼠的肺部自愈能力强，使得临床药物的筛选常常无效；其三，小鼠肺部血管内缺乏巨噬细胞(PIM)，肺部损伤反应相对较轻；其四，未有明显的呼吸困难症状，会突然死亡(die of shock)，因此，此模型只能检测ALI前期的炎症因子浸润期。

临床上判定急性肺损伤的金标准如下：在排除心脏原因下由明确的诱因导致①CT改变或②血气分析(氧合指数(PaO₂/FiO₂)＜300mmHg为ALI，PaO₂/FiO₂＜200mmHg为ARDS)。但目前大多数的急性肺损伤动物模型以ALI的I期炎症因子的检测为主，周期均少于72h；此外啮齿类动物ALI模型通常会突然死亡，难以有明显的临床症状等。而在动脉血的检测研究方面，中大型动物模型如兔、犬、猪、羊模型能满足一定的取血量，但犬和兔体内缺乏肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophages,PIM)，致使其肺部损伤反应降低；猪、羊以反复肺泡灌洗，油酸模型居多。

树鼩作为低等灵长类动物，在模拟人类疾病方面更具有亲缘优势，可媲美灵长类动物，在生命医药领域中展示出了其他物种无法比拟的优势，已在病毒性感染、免疫相关疾病、癌症、肝炎感染模型、树鼩神经系统疾病等疾病研究中得到成功应用。

但是树鼩的成本在1500～2000元/只，药物消耗约为600元/只，每只树鼩造模的平均成本在2100～2600元/只。虽然基于树鼩构建的动物病理模型在一些疾病研究已有应用，但尚未见树鼩急性肺损伤的模型的相关报道。不同疾病的关注焦点、检测指标大相径庭；而不同动物属种的差异给造模方法的稳定性、造模剂量适应性等带来了众多挑战，进一步增大了研究难度。

因此，急性肺损伤疾病的研究和临床前药物评价的迫切需要与人类疾病症状更为相似的动物模型；如何高效地通过树鼩进行造模具有重要研究价值，对未来的临床应用将具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种树鼩急性肺损伤动物模型的构建方法，使用该方法建立的树鼩模型症状明显，并且过程容易控制，稳定性好，重复性强。

本发明的另一目的在于提供所述的树鼩急性肺损伤动物模型的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种树鼩急性肺损伤动物模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)麻醉健康树鼩后，按180～200mg/kg的剂量进行气管内给药脂多糖溶液；

(2)给药后观察，当树鼩肺部损伤面积达到一半以上时，即构建得到所述的树鼩急性肺损伤动物模型。

步骤(1)中所述的健康树鼩优选为雄性成年树鼩，成年的雄性动物比雌性动物稳定，例如激素等方面；所述的健康树鼩优选为体重为120～160g的树鼩。

所述的健康树鼩不含体内外寄生虫及体征正常。

步骤(1)中所述的麻醉优选为深度麻醉状态。

步骤(1)中所述的麻醉的方法可采用呼吸麻醉法或注射麻醉法；所用的麻醉剂优选为戊巴比妥钠或异氟烷中的至少一种。

当所述的麻醉剂为戊巴比妥钠时，麻醉的具体方式优选为按树鼩体重×0.1％×3体积的剂量经腹腔注射3％戊巴比妥钠进行麻醉。

当所述的麻醉剂为异氟烷时，麻醉的具体方式优选为：麻醉用量值为3.5，游离氧为0.8进行麻醉。

步骤(1)中所述的麻醉前，优选对树鼩禁食10～12小时，不禁水。

步骤(1)中所述的气管内给药优选为一次性完成给药。

步骤(1)中所述的脂多糖溶液的给药体积优选为400～500μL，可使给药更为均匀。

步骤(1)中所述的气管内给药优选为气管导管内给药；优选为非暴露式气管内给药。

步骤(1)中所述的气管内给药的具体操作优选为：将树鼩以背卧姿势固定于工作板，将工作板立起，将喉镜***喉咙深部的气管开口处，施用浓度为180～200mg/kg的脂多糖溶液。

所述的喉镜优选为儿童喉镜；进一步优选为将喉镜片的前端用胶布缠裹并保持喉镜灯可正常工作的儿童喉镜。

优选地，在完成施用脂多糖溶液后，立刻注入少量空气，以减少脂多糖溶液在给药容器上的残留。

所述的少量空气优选为0.2mL；注入少量空气的次数优选为3次。

步骤(2)中所述的树鼩肺部损伤面积达到一半以上，即使不同的动物可能出现个体差异，通过本发明的构建方法树鼩一般在70小时后(多在70～120小时内)树鼩肺部损伤达到一半以上；部分树鼩在96～120小时在临床上表现出消瘦、呼吸困难等症状，树鼩肺部的损伤面积在70％以上，动脉血气分析的血氧指标氧合指数OI(PaO₂/FiO₂)可达200mmHg以下。

所述的树鼩急性肺损伤动物模型的构建方法在急性肺损伤或呼吸窘迫综合征的科学研究中的应用。

所述的科学研究包括急性肺损伤的疾病发生发展机制研究和评价新型急性肺损伤治疗药物等等。

所述的应用包括当树鼩急性肺损伤动物模型临床上出现呼吸困难及消瘦症状，肺部病变在70％以上时，进行如下至少一项研究：

(1)剖检取材进行肺部病理评价和机制的研究；

(2)采集动脉血进行检测；所述的检测包括血气分析、血常规检验等；

(3)采集肺泡换洗液检测细胞因子水平。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次成功构建了低等灵长类动物树鼩的急性肺损伤模型，模型种属较现有技术中的实验动物具有明显的优势。利用本发明的树鼩急性肺损伤模型研究该病的发生发展机制和评价新型急性肺损伤治疗药物，对未来的临床应用具有重要的指导意义。

(2)本发明的造模剂量非常重要，但由于模型种属的不同，本发明的造模剂量无法简单地从常规的物种换算系数计算得到。本发明既要保证树鼩肺部损伤面积达到急性肺损伤检测指标的要求(肺部损伤面积应至少一半以上)，又期望树鼩能表现出临床症状(呼吸困难、消瘦等)，本发明的研究团队围绕理想的药物剂量进行了大量、长时间的创新临床研究。

(3)给药方式的选择及辅助器械的改造：在本发明的研究过程中，曾选择腹腔注射的方式，考虑到损伤反应及药物吸收率的问题，最终改用气管插管的方式(非暴露式气管插管)。同时，因本发明所用的药物浓度大，管壁上的药物残留不可忽略，注入药物时，立刻注入200μL空气以降低药物损耗而引起的误差。更优选的，由于正常儿童所用器械如果在***气管部位直接用于树鼩，很容易导致器械损伤，为了便于气管插管的成功进行，如图1所示，本发明将儿童喉镜片的前端用胶布缠裹(保持喉镜灯可正常工作)，将改造后儿童喉镜进行树鼩的气管插管方式，不会因器械的问题而造成损伤，成功率接近100％。

(4)本发明的建模方法高效、成功率高，可有效节约成本；模型周期在70h以上，为急性肺损伤显著地拓宽了研究周期空间；临床症状与人类疾病更为相似，具有良好的产业化前景。

(5)本发明的模型可持续70h以上，与常规的大小鼠模型相比，本发明构建得到的树鼩模型未出现自我修复和可逆性恢复等过程。

附图说明

图1是本发明改造后的儿童喉镜示意图。

图2是本发明改造后的留置针示意图。

图3是树鼩LPS诱导后micro-CT检测结果图。

图4是树鼩肺脏组织切片HE染色结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

实施例1

1.材料与方法：

1.1实验材料

体重120～160g的雄性树鼩5只，无体内外寄生虫，表征正常的树鼩；购自中国科学院昆明动物研究所。

1.2主要试剂

脂多糖(LPS)购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3主要溶液的配制

200mg/kg LPS溶液配制：按树鼩体重130g，称取LPS晶体26mg，溶于400μL PBS(pH＝7.35～7.45)中。

1.4主要仪器

喉镜：Simeite 2012-58

留置针：BD 20G

血气针：BD血气针(2mL)

麻醉机：瑞沃德生命科技有限公司510IP

小动物活体成像微型CT：Super Nova CT(SNC-100)

血气分析仪：西门子RXPIDPoint 500

1.5实验方法

(1)选取5只雄性树鼩，10～12h禁食，不禁水；

(2)腹腔注射前，对树鼩进行麻醉，麻醉方法可采用呼吸麻醉法或注射麻醉法。

研究中对树鼩进行呼吸麻醉，异氟烷用量值为3.5，游离氧为0.8；或根据动物体重，腹腔注射3％戊巴比妥钠按树鼩体重×0.1％×3的体积进行深度麻醉，均可使树鼩进入深度麻醉状态，实施后续造模操作。

(3)将树鼩以背卧姿势固定在啮齿动物工作板上，将橡皮筋置于树鼩上门牙上，树鼩的背部应完全平放在工作板上，立起工作板，固定，胸部不应偏向两侧，并用橡皮筋将其完全固定；用直镊将树鼩的舌头向左放一边，轻轻地把改造过的儿童喉镜(如图1所示，将喉镜片的前端用胶布缠裹)***喉咙深部的气管开口处，直到可以看到喉部；打完麻药后，动物会产生较多的痰液，在喉镜照射下，立刻用改造过的BD 20G的留置针(如图2所示，出针处用胶带固定)进行吸痰；

(4)用喉镜找到会厌软骨位，***导管针，取出导管针在导管口放置一小撮棉花验证是否***气管内；给药剂量如表1所示，用移液枪注射200mg/kg/次LPS溶液，1次注射400～500μL，立刻注入0.2mL的空气，重复注入空气2次(每次0.2mL)以减少LPS在导管内的残留；以相同的方式通过气管插管用移液枪注射相同体积400μL的PBS溶液(pH＝7.35～7.45)作为对照组(亦曾注射500μL pH＝7.35～7.45的PBS溶液作为对照组，效果无明显差异)。

(5)移除导管，将树鼩轻轻从工作台拿下，并将头部和胸部用折叠的纸巾小幅度垫高，以保证其顺畅的呼吸；对树鼩状态进行监测直到其苏醒，约4～6h。

(6)苏醒后将动物放回饲养笼中，观察动物状况直至72h；

(7)72h后，树鼩进行micro-CT检测肺部病变情况，肺部病变达到1/2且还未出现临床症状的，每天进行检测肺部病变情况的检测；

(8)临床上出现呼吸困难，消瘦等症状的，肺部病变在70％以上的，即刻剖检取材检测；

(9)将树鼩固定于手术台上，碘伏消毒腹部；用手术剪剖开腹部，用2mL血气针***腹主动脉抽血4mL(分别做血气分析、血常规并保留血清)；

(10)碘伏消毒胸部及喉部，手术间剪开胸腔及喉部，取出肺部连带气管；

(11)用灭菌的4mL的PBS灌注气管至肺部，吹打3次，吸出肺泡换洗液待测细胞因子等；

(12)肺组织部分固定部分冻存。

(13)以下为动物给药方案：

表1树鼩的给药剂量

(14)5只树鼩按本发明方法造模，所有树鼩在第70h后肺部损伤达均到一半以上，5只动物均造模成功。

(15)树鼩micro-CT测定肺部病变：使用平生Super Nova CT(SNC-100)以肺窗和纵膈窗扫描，分析动物肺部病变情况。

(16)树鼩肺部病理变化：将树鼩左下肺叶固定24h，纵向切割肺叶，制作病理切片。

(17)树鼩肺湿/干重(W/D)情况：将树鼩右上叶取出称重，放入80℃烘箱72h，称重，记录。

2.实验结果

树鼩气管插管200mg/kg的LPS溶液，树鼩肺部损伤面积至少在70％以上(见图3)；病理切片显示肺间质轻度至中度弥漫性增宽，轻度至中度水肿，肺间质和肺泡腔内可见明显大量泡沫细胞分布，肺脏可见嗜中性粒细胞浸润，巨噬细胞增多，支气管腔内可见脱落上皮细胞、泡沫细胞及嗜酸性分泌物，肺泡结构消失，肺不张(见图4)；树鼩肺水肿情况见表2。

表2 5只树鼩的W/D

实施例2

180mg/kg LPS溶液配制：按树鼩体重130g，称取LPS晶体23.4mg，溶于400μL PBS中。

取2只雄性树鼩，无体内外寄生虫，表征正常的树鼩，体重在150g左右；购自中国科学院昆明动物研究所。

除了气管插管给药的LPS溶液的剂量为180mg/kg外，本实施例的实验方法与操作同实施例1。

(1)动物禁食12h，不禁水；气管插管给药180mg/kg的LPS溶液，给药量见表3。

表3给药剂量

(2)结果：LPS诱导的后，树鼩在3～4天左右出现明显的呼吸症状，食欲废绝；血气分析发现，氧合指数OI(PaO₂/FiO₂)分别为166mmHg、188mmHg，均在200mmHg以下，达到ARDS的要求；CT发现树鼩的病变面积均已达到80％以上。

表4树鼩的W/D

对比例1

发明人团队在研究过程中，曾参照现有技术中的树鼩与其他实验动物等效剂量换算系数尝试获得本发明的造模剂量。

根据文献吴婷婷，屈会化，胡丽娜，孙晔，戴进，孙慧，李翼飞，赵琰*，王庆国*，基于树鼩体表面积的树鼩与人类及其他实验动物等效剂量换算系数的测算，中华中医药杂志，2015年1月第30卷第1期.记载，得知树鼩在Meeh-Rubner氏公式中的K值为10.83±1.73；单位体质量上体表面积相对比值为0.65±0.10；按体表面积比值折算等效剂量的系数中，小鼠剂量(20g)至树鼩剂量(130g)的换算系数为4.134。

LPS造模一般以2种途径：腹腔注射和气管插管，前者是以肺内毛细血管内皮损伤为主，后者以肺泡上皮损伤为主。常用的小鼠模型中，也是用这两种造模方式。

在腹腔注射模型中，小鼠多以1.5～5mg/kg LPS的剂量能检测到明显的肺部毛细血管内皮通透性的改变(参考文献1～2)，以体表系数计算，体重125.3g和128g的树鼩腹腔分别注射1mg(类比于小鼠为2mg/kg的剂量)和2.65mg(类比于小鼠为5mg/kg的剂量)的LPS。

考虑到成本及急性肺损伤动物体重会下降的特性，这两只树鼩的体重每天以5～8g在增长，观察至第5天，此造模剂量失败。

对比例2

鉴于对比例1按现有技术报道的常规体表系数换算得到的剂量造模失败，同时考虑到成本及腹腔注射的吸收率的问题，本对比例选用气管插管这种更为直接的肺损伤模式进行探索。

进一步将提高给药剂量至37.5mg/kg(类比于小鼠为9mg/kg的剂量)和108mg/kg(类比于小鼠为26mg/kg的剂量)按实施例1的方法进行气管插管给药，这两只树鼩3天体重增长趋势与正常树鼩一致，体重每天以5～8g在增长，此造模剂量失败。

参考文献3报道小鼠气管插管30mg/kg、40mg/kg高剂量的LPS，会引发小鼠重症肺损伤；给予10mg/kg、20mg/kg的剂量，可引发中度的肺损伤。

考虑到树鼩在麻醉过程中展示的对麻药的耐受性，本对比例先以20*4.134＝82.68mg/kg的剂量按实施例1的方法进行气管插管给药，如：体重121.3g的树鼩，10mg的LPS给药，观察称重5天，树鼩状态良好，体重增加12g，此剂量建模失败。

体重131g的树鼩，增加剂量至164mg/kg，类比于小鼠为40mg/kg，给药第3天，树鼩的肺损伤为40％，未超过一半，远高于常规剂量的造模剂量在树鼩上仍旧无法达到急性肺损伤的要求。

进一步增加药物剂量至325mg/kg，2只受试树鼩体重分别为132g和128g，均在给药25h左右死亡。

由以上实施例和对比例可知，不同实验动物之间的等效剂量换算系数是实验动物的重要基础数据，更是实验动物应用于现代生物医学研究中的先决条件。但在研究中发现，在构建急性肺损伤标准的树鼩动物模型中，本发明的造模剂量无法简单地从常规的物种之间等效剂量换算系数等现有技术或常规技术手段获得(如对比例1)；甚至采用高剂量给药，树鼩的建模依旧不如人意(如对比例2)。

发明人团队经过长达1年的大量创新临床研究，出乎意料地发现180～200mg/kg的剂量可使树鼩约在第三天均可达到一半的肺部损伤，4～5天树鼩肺部的损伤面积在70％以上，且有明显的呼吸困难、消瘦的临床症状，血氧指标亦在200mmHg以下，这在大鼠、小鼠模型中是无法做到的。本发明的建模方法高效、成功率高，对树鼩动物模型的临床应用具有重要的指导意义。

参考文献：

1.Gonzales JN,Gorshkov B,Varn MN,Zemskova MA,Zemskov EA,Sridhar S,etal.Protective effect of adenosine receptors against lipopolysaccharide-induced acute lung injury.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2014；306(6):L497-507.

2.Shi M,Wang L,Zhou J,Ji S,Wang N,Tong L,et al.Direct factor Xainhibition attenuates acute lung injury progression via modulation of thePAR-2/NF-kappaB signaling pathway.Am J Transl Res.2018；10(8):2335-49.

3.Wang L,Wang T,Li H,Liu Q,Zhang Z,Xie W,et al.Receptor InteractingProtein 3-Mediated Necroptosis Promotes Lipopolysaccharide-InducedInflammation and Acute Respiratory Distress Syndrome in Mice.PLoS One.2016；11(5):e0155723.

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。